一種蟬花的雙向人工培養方法與流程

2023-11-10 01:29:19 2

本發明涉及一種蟬花的培養方法，具體涉及一種蟬花的雙向人工培養方法。
背景技術：
：中藥蟬花為蟬棒束孢IsariacicadaeMiquel(蟬擬青黴Paecilomycescicadae(Miquel)Samson)寄生在某些蟬若蟲上形成的菌蟲複合體，是我國傳統著名的中藥材之一，其藥用比冬蟲夏草早800年。醫家認為蟬花是一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材。天然蟬花多生長於竹林中，浙江天目山一帶是蟬花的主產區，被稱為「南方的蟲草」。現代藥理研究表明天然蟬花及人工培養蟬花中含有多糖、腺苷和N6-(2-羥乙基)腺苷等核苷類物質、胺基酸、生物鹼及麥角甾醇等多種活性物質，具有明顯的解熱鎮痛、抗驚厥等作用，以及顯著的抗腎功能衰竭作用，還具有明顯的抗腫瘤，調節免疫，抗氧化、抗衰老、抑制B型肝炎病毒等作用。人工培養蟬花毒性甚微，小鼠口服60g/kg無毒性。近年來，利用生物發酵技術人工培養蟬花並進一步深度開發利用逐漸成為研究的熱點。人工培育蟬花，主要是通過固體發酵的原理，利用小麥作為培養基。將蟬棒束孢通過斜面種子接種到搖瓶、發酵罐擴大培養，經固體發酵形成若花狀分叉多枝的孢梗束子實體，經採收乾燥即可作食藥用原料。目前，蟬花的人工培養主要是單面培養，即採用立體培養架培養，菌絲只能單向生長，不利於培養基和培養空間的充分利用；且該方法培養時間長，不利於節約生產成本。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種蟬花的雙向人工培養方法。本發明的目的是通過如下技術方案實現的：一種蟬花的雙向人工培養方法，該方法包括如下步驟：步驟1，蟬花菌種在液體培養基中進行擴大培養；步驟2，在培養室內將步驟1經過擴大培養得到的菌種接種到固體培養基中進行固體培養，菌絲體生長階段，保持黑暗條件；當處於孢梗束生長階段時轉為光照培養，在菌絲體長滿培養基時，將培養基進行懸空；和步驟3，對孢梗束進行採收；所述黑暗可以是基本黑暗條件。進一步，菌絲體長滿培養基時，培養基出現板結時將培養基進行懸空。進一步，培養基懸空後與培養容器頂部和底部的距離分別為12～16cm；更進一步，培養基懸空後與培養容器頂部和底部的距離分別為14～15cm。進一步，步驟2固體培養過程中，培養溫度為20～30℃；更進一步，在菌絲體生長階段，培養溫度為22～24℃；在孢梗束生長階段，培養溫度為20～22℃；進一步，在孢梗束生長階段光照強度為100～200Lx。進一步，步驟2固體培養過程中相對溼度為50～70％；更進一步，相對溼度為65～70％。本發明步驟1所述液體培養過程以菌種擴增為目的，可採用常規的菌種擴培方法，包括斜面培養、搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐培養中的任意一種或幾種方法的組合；所用培養基為本領域常規的液體培養基，如馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基、馬鈴薯-蔗糖-水培養基、馬鈴薯-葡萄糖-水培養基、酵母浸出粉-複合胺基酸-蔗糖培養基，酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培養基，麩皮煮汁-白砂糖培養基等。本發明步驟2中所述固體培養基為本領域常規固體培養基，如穀物培養基，可選自小麥、玉米、大米、小米、黃豆粉、蕎麥、大麥、燕麥、糙米、粳米中的任意一種或幾種；農作物秸杆培養基，如麥稈、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一種或幾種；農作物皮殼培養基，如麩皮、大豆皮、棉籽殼等；經濟林木樹枝培養基等；其中優選穀物培養基。本發明中所述蟬花(IsariacicadaeMiquel)是廣布種，廣泛分布在我國秦嶺-淮河以南的18個省、市、區。在我國長江以南的亞熱帶和熱帶地區，且多在低洼地帶及滇藏高原的金沙江、怒江、瀾滄江和雅魯藏布江等河谷地帶。只要在其生長季節，每年的6～8月，按照一般中藥材的採集方法都可採到，是現有技術中已知菌種，並可以從商業途徑購買獲得。本發明所用的蟬花菌株為第CN201110178274.6號專利中公開的保藏號為CGMCCNo.3453的蟬擬青黴菌株[Paecilomycescicadae(Miq.)Samson]。本發明培養方法的有益效果在於：①雙向培養能夠更充分地利用和轉化培養基，孢梗束得率較單向培養提高了20-40％，而產品的內在質量與單面培養相比無顯著性差異；②雙向培養能夠更充分地利用了培養空間；③雙向培養的培養周期較單向培養明顯縮短(可節省2d)，節約了生產成本，增加了年生產批次。附圖說明圖1柵欄狀支架俯視圖1.支架；2.長方形延伸；3.橫梁圖2培養盒示意圖1.上盒蓋；2.透氣膜孔；3.支架；4.下盒蓋具體實施方式實驗例1蟬花菌種的擴大培養斜面培養：將分離純化的菌種接種於斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22℃培養箱，培養時間為7天，待菌絲長滿試管；搖瓶培養：在500m1三角瓶中裝入200m1液體培養基，在0.11Mpa壓力下高壓滅菌30分鐘，待冷卻至室溫，將1支斜面試管的菌種接種到500m1三角瓶培養基上，並置於恆溫振蕩培養箱，溫度22±1℃，150轉/分鐘條件下培養，培養時間為3天；種子罐培養：在50L氣升式發酵罐中裝入20L液體培養基，培養基溫度大於95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養基重量的0.03％，在0.11Mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，並保壓30～45分鐘；滅菌後，冷卻至20℃時，將4瓶上述培養好的500m1搖瓶菌種接入培養基，培養溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5V/Vmin，保壓4.903～7.0845×104Pa，經3天通氣培養，達到對數生長期後即可，終培養體積為20L。發酵罐培養：在500L氣升式發酵罐中裝入200L液體培養基，培養基溫度大於95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養基重量的0.03％，在0.11Mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，並保壓30～45分鐘；滅菌後，冷卻至20℃時，將上述培養好的200L種子罐種子全部接入培養，培養溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5V/Vmin，保壓4.903～7.0845×104Pa，經3天通氣培養，達到對數生長期後即可。終培養體積為200L。斜面試管培養基：每1升液體含有200克馬鈴薯煮汁，20克蔗糖，20克瓊脂，餘補水至1000毫升，pH值為6.5；搖瓶、種子罐及發酵罐中的液體培養基：含有酵母浸出粉1％，複合胺基酸0.5％，白砂糖3.5％，餘量補水至100％，pH值為6.5。實驗例2蟬花菌種的擴大培養斜面培養：將分離純化的菌種接種於斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22℃培養箱，培養時間為7天，待菌絲長滿試管；搖瓶培養：在500m1三角瓶中裝入200m1液體培養基，在0.11Mpa壓力下高壓滅菌30分鐘，待冷卻至室溫，將1支斜面試管的菌種接種到500m1三角瓶培養基上，並置於恆溫振蕩培養箱，溫度22±1℃，150轉/分鐘條件下培養，培養時間為3天；種子罐培養：在50L氣升式發酵罐中裝入20L液體培養基，培養基溫度大於95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養基重量的0.03％，在0.11Mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，並保壓30～45分鐘；滅菌後，冷卻至20℃時，將4瓶上述培養好的500m1搖瓶菌種接入培養基，培養溫度為22±1℃，通氣 量為1：0.5V/Vmin，保壓4.903～7.0845×104Pa，經3天通氣培養，達到對數生長期後即可，終培養體積為20L。斜面試管培養基：每1升液體含有200克馬鈴薯煮汁，20克蔗糖，20克瓊脂，餘補水至1000毫升，pH值為6.5；搖瓶及種子罐培養基：每1升液體含有30克酵母浸出粉，30克白砂糖，5克大豆水解蛋白，加水補至1000毫升，pH值為6.5。實驗例3蟬花菌種的擴大培養斜面培養：將分離純化的菌種接種於斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22℃培養箱，培養時間為7天，待菌絲長滿試管；種子罐培養：在50L氣升式種子罐中裝入20L液體培養基，培養基溫度大於95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養基重量的0.03％，在0.11Mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，並保壓30～45分鐘；滅菌後，冷卻至20℃時，將4瓶上述斜面試管的菌種接入培養基，培養溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5V/Vmin，保壓4.903～7.0845×104Pa，經3天通氣培養，達到對數生長期後即可，終培養體積為20L。發酵罐培養：在500L氣升式發酵罐中裝入200L液體培養基，培養基溫度大於95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養基重量的0.03％,在0.11Mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，並保壓30～45分鐘；滅菌後，冷卻至20℃時，將上述培養好的200L種子罐種子全部接入培養，培養溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5V/Vmin，保壓4.903～7.0845×104Pa，經3天通氣培養，達到對數生長期後即可。終培養體積為200L。斜面試管培養基：每1升液體含有200克馬鈴薯煮汁，20克蔗糖，20克瓊脂，餘補水至1000毫升，pH值為6.5；種子罐及發酵罐培養基：每1升液體含有40克麩皮煮汁，30克白砂糖，餘補水至1000毫升，pH值為6.5。實施例4固體發酵培養培養容器：耐高壓滅菌的塑膠袋，在塑膠袋中置入一個柵欄狀支架，如圖1所示，所述支架包括支架1和長方形延伸2，所述長方形延伸2位於支架1的兩側。當對培養基進行懸空處理時，將支架兩側的長方形延伸2放置於橫梁3即可。固體培養基：將小麥清洗控水後，加入適量的水，其重量比為小麥:水為1：1.4，拌勻後裝入塑膠袋中，紮緊袋口。將裝好培養基的培養容器放置滅菌鍋內，121℃下滅菌30～50min；滅菌後，培養容器移置緩衝室內，自然冷卻至24℃以下移置接種室內。接種：接種前培養容器先在超淨工作檯或百級層流罩內(下)用紫外光照射0.5h；每個塑膠袋中按7％的接種量接種實施例1得到的菌種，接種後的塑膠袋放入培養室培養。培養過程和培養條件：菌絲體生長階段，培養室溫度為22～24℃，空氣相對溼度65％～70％，將培養室遮光，使發菌室基本黑暗；待菌絲體長滿培養基時，培養基由於菌絲滲透、扭結並與其中的小麥顆粒相互纏繞而逐漸板結，轉入光照培養，同時將平鋪於柵欄支架上的已經板結的培養基進行懸空處理，即將塑膠袋中柵欄狀支架的兩側延伸分別放置在橫梁上，從而將培養基質懸空，塑膠袋上下均保持12～16cm對稱的培養空間。此後為誘導形成孢梗束時期，培養室溫度為20～22℃，空氣相對溼度65％～70％，保證有散射光(100Lx～200Lx)誘導孢梗束形成。培養室要適時通風換氣，保持發菌室空氣新鮮。採收及處理：至孢梗束成熟，尚未大量產生孢子時進行採收；採收後的孢梗束在相對溼度45％～50％的除溼間除溼40h～50h，進入烘乾室準備烘乾。烘箱設置溫度60℃，乾燥時間8h～10h。乾燥結束後裝入PE袋中，扎口放置陰涼乾燥處。乾燥結束測定孢梗束水分，其應≤6％。實施例5固體發酵培養培養容器：聚丙烯培養盒，如圖2所示，所述培養盒包括上盒蓋1、透氣膜孔2、支架3和下盒蓋4，所述支架3固定於下盒蓋4上，距離上盒蓋頂 和下盒蓋均14cm，支架平面距離下盒蓋口的平面2.5cm，在上盒蓋1和下盒蓋4上分別有兩個透氣膜孔2，上貼透氣膜；當對培養基進行懸空處理時，緩慢將培養盒上下倒置，培養基就會在重力作用下平落支架3上。固體培養基：將大米清洗控水後，加入適量的水，其重量比為大米:水為1：1.3，拌勻後裝入培養盒中，此時上盒蓋在下，下盒在上，培養基在上盒蓋裡。將裝好培養基的培養容器放置滅菌鍋內，121℃下滅菌30～50min；滅菌後，培養容器移置緩衝室內，自然冷卻至24℃以下移置接種室內。接種：接種前培養容器先在超淨工作檯或百級層流罩內(下)用紫外光照射0.5h；每個培養容器按5％的接種量接種實施例2得到的菌種，接種後的容器放入培養室培養。培養過程和培養條件：菌絲體生長階段，培養室溫度為22～24℃，空氣相對溼度65％～70％，將培養室遮光，使發菌室基本黑暗；待菌絲體長滿培養基時，培養基由於菌絲滲透、扭結並與其中的小麥顆粒相互纏繞而逐漸板結，轉入光照培養，同時將已經板結的培養基質進行懸空處理，即緩慢將培養盒上下倒置，已經板結的培養基就會在重力作用下平落支架上。此後為誘導形成孢梗束時期，培養室溫度為20～22℃，空氣相對溼度65％～70％，保證有散射光(100Lx～200Lx)誘導孢梗束形成。培養室要適時通風換氣，保持發菌室空氣新鮮。採收及處理：同實施例4。實施例6固體發酵培養培養容器：耐高壓滅菌的塑膠袋，在塑膠袋中置入一個柵欄狀支架，如圖1所示，所述支架包括不鏽鋼支架1和長方形延伸2，所述長方形延伸2位於不鏽鋼支架1的兩側，當對培養基進行懸空處理時，將支架兩側的長方形延伸2放置於橫梁3即可。固體培養基：將糙米清洗控水後，加入適量的水，其重量比為糙米：水為1：1.5，拌勻後裝入塑膠袋中，紮緊袋口。將裝好培養基的培養容器放置滅菌鍋內，121℃下滅菌30～50min；滅菌後，培養容器移置緩衝室內，自 然冷卻至24℃以下移置接種室內。接種：接種前培養容器先在超淨工作檯或百級層流罩內(下)用紫外光照射0.5h；每個塑膠袋中按7％的接種量接種實施例3得到的菌種，接種後的塑膠袋放入培養室培養。培養過程和培養條件：菌絲體生長階段，培養室溫度為22～24℃，空氣相對溼度65％～70％，將培養室遮光，使發菌室基本黑暗；待菌絲體長滿培養基時，培養基由於菌絲滲透、扭結並與其中的小麥顆粒相互纏繞而逐漸板結，轉入光照培養，同時將平鋪於柵欄裝支架上的已經板結的培養基進行懸空處理，即將塑膠袋中柵欄狀支架的兩側延伸分別擱在梁上，從而將培養基質懸空，塑膠袋上下均保持12～16cm對稱的培養空間。此後為誘導形成孢梗束時期，培養室溫度為20～22℃，空氣相對溼度65％～70％，保證有散射光(100Lx～200Lx)誘導孢梗束形成。培養室要適時通風換氣，保持發菌室空氣新鮮。採收及處理：同實施例4。實施例7固體發酵培養培養容器：聚丙烯培養盒，如圖2所示，所述培養盒包括上盒蓋1、透氣膜孔2、支架3和下盒蓋4，所述支架3固定於下盒蓋4上，距離上盒蓋頂和下盒蓋均14cm，支架平面距離下盒蓋口的平面2.5cm，在上盒蓋1和下盒蓋4上分別有兩個透氣膜孔2，上貼透氣膜，當對培養基進行懸空處理時，緩慢將培養盒上下倒置，培養基就會在重力作用下平落支架3上。固體培養基：小米清洗控水後，加入適量的水，其重量比為小米:水為1：1.3，拌勻後裝入培養盒中，此時上盒蓋在下，下盒在上，培養基在上盒蓋裡。將裝好培養基的培養容器放置滅菌鍋內，121℃下滅菌30～50min；滅菌後，培養容器移置緩衝室內，自然冷卻至24℃以下移置接種室內。接種：接種前培養容器先在超淨工作檯或百級層流罩內(下)用紫外光照射0.5h；每個培養容器按5％的接種量接種實施例1得到的菌種，接種後的容器放入培養室培養。培養過程和培養條件：菌絲體生長階段，培養室溫度為22～24℃，空氣相對溼度65％～70％，將培養室遮光，使發菌室基本黑暗；待菌絲體長滿培養基時，培養基由於菌絲滲透、扭結並與其中的小麥顆粒相互纏繞而逐漸板結，轉入光照培養，同時將已經板結的培養基質進行懸空處理，即緩慢將培養盒上下倒置，已經板結的培養基就會在重力作用下平落在柵欄橫杆上。此後為誘導形成孢梗束時期，培養室溫度為20～22℃，空氣相對溼度65％～70％，保證有散射光(100Lx～200Lx)誘導孢梗束形成。培養室要適時通風換氣，保持發菌室空氣新鮮。採收及處理：同實施例4。實施例8對照實施例固體培養基：將小麥清洗控水後，加入適量的水，其重量比為小麥:水為1：1.4，拌勻後裝入密封的聚丙烯盒子中(盒子上方蓋打孔，孔上貼中有透氣膜)；將裝好培養基的培養容器放置滅菌鍋內，121℃下滅菌30～50min；滅菌後，培養容器移置緩衝室內，自然冷卻至24℃以下移置接種室內。接種：接種前培養容器先在超淨工作檯或百級層流罩內(下)用紫外光照射0.5h；每個培養容器按7％的接種量接種實施例1得到的菌種，接種後的容器放入培養室培養。培養條件：培養室溫度為22～24℃，空氣相對溼度65％～70％；首先要將培養室遮光，使發菌室基本黑暗。待菌絲體長滿培養基時，轉入光照培養。接種後定期檢查，及時剔除生長勢差、感染雜菌的培養容器。此後為誘導形成孢梗束時期，保持培養室溫度為20～22℃，相對空氣溼度65％～70％，保證有散射光(100Lx～200Lx)誘導孢梗束形成。培養室要適時通風換氣，保持發菌室空氣新鮮。採收及處理：同實施例4。培養結果比較1、實施例4-8固體培養時間和孢梗束得率結果比較，結果見表1。表1培養時間和孢梗束得率結果培養時間/天孢梗束得率％實施例42614.1±1.35Aa實施例52612.2±1.02Bb實施例62613.1±1.30Aa實施例72613.5±1.24Aa實施例82811.0±1.03Cc2、實施例4及實施例8孢梗束營養成分含量比較，結果見表2。表2孢梗束營養成分含量通過比較可以看出，實施例4～7的雙面培養較實施例8的單面培養具有明顯優勢：①雙向培養能夠更充分地利用和轉化培養基，孢梗束得率較單向培養提高了20～40％，而產品的內在質量與單面培養相比無顯著性差異；②雙向培養能夠更充分地利用了培養空間；③雙向培養的培養周期較單向培養明顯縮短(可節省2天)，節約了生產成本，增加了年生產批次。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp