一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-09 04:48:46

專利名稱：一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫用材料領域，具體涉及一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質及其製備 方法和用途。
背景技術：
角膜病是全球範圍內第二致盲眼病，並且以每年150 200萬病例的速度遞增。角 膜移植是目前治療角膜盲唯一有效的方法，但供體角膜來源的極端匱乏制約著角膜移植的 開展。因此，研究和開發出人角膜替代品是解決此供需矛盾的關鍵。目前，體外構建與正常角膜功能等效的活性組織工程角膜已有數十年的歷史。由 於角膜獨特的生理和光學特性，要求構建的組織工程角膜必須具有(1)良好的生物相容 性；(2)適度的強度和彈性；(3)高透明性；(4)穩定的角膜厚度和角膜曲率。角膜基質如豬角膜基質具有與人角膜基質類似的組織結構、生物物理特性和光學 特性。但是異種移植後強烈的排斥反應阻礙了異種角膜在臨床上的應用。近年來的研究發 現，角膜基質內的基質細胞是引起基質型排斥反應的主要抗原。而作為角膜基質架構的膠 原纖維在種系間高度保守，抗原性很低，無細胞的異種角膜移植後不產生排斥反應。因此， 將動物的基質細胞完全脫去，使之成為無細胞的角膜基質可能是人角膜基質的理想替代 物。經典的組織工程角膜是將種子細胞接種在可降解材料上，Minami等在膠原凝膠 上培養角膜細胞，雖然獲得三維角膜類似物，但由於其不透明和抗拉力弱，不能用於角膜移 植。Griffith等將轉基因的內皮和上皮細胞培養在以膠原-硫酸軟骨素為基礎的基質上， 成功的培養出功能性類人角膜組織，但是病毒和醛交聯對正常細胞均有毒性，且基質強度 也不夠，另外由於膠原易被膠原酶消化，因此不穩定，進而影響角膜的光學性能和移植細胞 的長期存活。因此人工合成的角膜生物材料至今還很不理想，無法製備出與人角膜具有相 似的透明性、強度及生物學特性的基質架構。劉曉霞等採用胰酶_冰凍法對新鮮兔角膜進行脫細胞處理，結果顯示用該方法獲 得的兔角膜全層和分層脫細胞基質未見細胞成分，但透光率低於新鮮角膜而且脫細胞時間 較長，要持續3天。北京大學第三附屬醫院徐永根等人利用表面活性劑、DNA酶和RNA酶對 天然豬角膜進行脫細胞處理，90%丙三醇脫水4h後其透明性接近天然角膜，但是破壞了天 然角膜基質的超微結構。由於現在大多數使用的脫細胞方法如機械力、離子和去離子除垢 劑、酶處理的方法會影響角膜的透明性而且會破壞角膜的超微結構。

發明內容
為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的首要目的在於提供一種低免疫原性 與自然角膜特性接近的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法；該方法用酶消化較短的 時間加上相對溫和缺氧冷凍的物理條件，可以保持角膜的透明性而且不影響天然角膜基質 的超微結構，且整個脫細胞的過程持續時間較短，約30h就可以完成。
本發明的另一目的在於提供上述方法製備得到的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質。本發明的再一目的在於提供該脫細胞角膜或脫細胞角膜基質在組織工程的人工 角膜構建或者製備角膜移植、屈光手術的醫用材料中的應用。本發明的目的通過以下技術方案來實現一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，包括如下具體步驟(1)新鮮動物全層角膜或角膜基質的獲取修剪動物眼球表面附屬組織後用含 1000 2000u/ml的抗生素的磷酸鹽緩衝液洗滌，在手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全形膜， 獲得全層角膜；將全層角膜刮去角膜上皮層和撕去後彈力層，得到角膜基質；室溫20°C 28°C條件下，將獲得的全層角膜或角膜基質稱取起始初重；(2)去除角膜上皮、內皮和基質細胞①在室溫20°C 28°C下，將獲得的全層角膜或角膜基質置於純水中浸泡0. 5 lh；②將經步驟①處理後的全層角膜或角膜基質置於酶溶液中，放在恆溫搖床上震蕩 消化，然後再用平衡鹽溶液震蕩清洗；③將經步驟②處理後的全層角膜或角膜基質重複凍融過程6 8次，然後置於平 衡鹽溶液震蕩清洗6 8次，每次30 40min，得到脫細胞角膜或脫細胞角膜基質；所述凍 融過程是把離心管置於室溫下和空氣中，將全層角膜或角膜基質放在離心管中，離心管注 滿液氮，在瞬間缺氧和-196°C條件下冷凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置 1 1. 5h，然後鬆開離心管口，解除缺氧冷凍狀態，待角膜慢慢復溫解凍；(3)脫水處理將脫細胞角膜或脫細胞角膜基質在無菌條件下，保持溫度20°C 28°C，紫外線照射下，乾燥至起始初重；(4)消毒、保存將經過脫水處理的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質經輻射劑量為 25kGey的鈷6(1輻射滅菌，採用在4°C冰箱中密封保存或在體積分數為95%甘油中保存備用， 得到脫細胞角膜或脫細胞角膜基質產品。步驟⑴所述動物為豬、牛、兔、羊、貓、猴、馬、驢或狗，所述動物眼球為屠宰場屠 宰後的新鮮動物屍體上獲取的；所述抗生素為慶大黴素；所述磷酸鹽緩衝液的PH值為7 8 ；所述洗滌的次數為3 5次。步驟②所述震蕩消化的溫度保持37°C，PH值為6 8，時間為3 5h ；所述震蕩清 洗的次數為3 6次，每次30 40min。步驟②所述酶溶液為磷脂酶溶液或中性蛋白酶溶液；所述酶溶液的用量為10 15ml每塊全層角膜或角膜基質；所述平衡鹽溶液為pH值為7 8的磷酸平衡鹽溶液PBS ； 步驟③所述離心管為50ml塑料離心管。所述磷脂酶溶液是磷脂酶A2溶液；所述中性蛋白酶溶液為中性蛋白酶Dispase II 溶液。所述磷脂酶溶液是將磷脂酶A2溶解在平衡鹽溶液中製成的濃度為100 300U/ml 的溶液，所述中性蛋白酶溶液是將中性蛋白酶Dispase II溶解在平衡鹽溶液中製成的濃度 為2. 4U/ml的溶液。步驟(3)所述脫水處理是將脫細胞角膜或脫細胞角膜基質放在超淨臺上進行處 理；所述乾燥採用風機吹乾。
一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質，是由上述方法製備得到的。上述脫細胞角膜或脫細胞角膜基質可應用於在組織工程的人工角膜構建，也可應 用於製備角膜移植或屈光手術的醫用材料。上述方法得到的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質為活性人工角膜的支架材料，進行 角膜相關細胞的培養，獲得可以進行移植的分層與全層活性人工角膜；也可以作為角膜移 植物進行角膜移植眼表修復。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果(1)本方法既可以去除動物角膜基質內的細胞成分，又可以保存角膜膠原纖維的 基本架構，從而保留了角膜韌性和透明性，處理後的角膜具有很低的免疫原性。(2)本方法脫細胞角膜處理時間短於現有的脫細胞角膜技術方法，綜合應用物理 與酶消化方法，對角膜結構與生理特性影響較小，與自然角膜特性接近，是一種理想的組織 工程角膜。


圖1為豬角膜脫細胞處理前後的大體觀察圖，其中(a)為豬角膜脫細胞處理前的 大體觀察圖，(b)為豬角膜脫細胞處理後的大體觀察圖。圖2為豬角膜脫細胞處理前後蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，其中(a)為豬角膜 脫細胞處理前HE染色照片圖，(b)為豬角膜脫細胞處理後HE染色照片。圖3為豬角膜脫細胞處理前後的透射電鏡照片圖，其中(a)為豬角膜脫細胞處理 前的透射電鏡照片圖，(b)為豬角膜脫細胞處理後透射電鏡照片圖。圖4為豬角膜脫細胞處理後表面進行角膜基質細胞培養圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1 豬全層角膜脫細胞角膜的製備(1)新鮮豬角膜的獲取從某屠宰場屠 後的豬屍體上獲取新鮮豬眼球，修剪眼 球表面附屬組織後用含2000u/ml的慶大黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH值為7)洗滌3次， 手術顯微鏡下沿角膜緣剪下豬全層角膜，參見圖la、圖2a、圖3a ；將全層角膜室溫20°C 28°C條件下，將獲得的豬全層角膜稱取起始初重；(2)去除角膜上皮、內皮和基質細胞①室溫下，將獲得的豬全層角膜置於純水中浸泡0. 5h ；②將經步驟①處理後的每塊豬全層角膜置於IOml 200U/ml的磷脂酶A2溶液中， 置於恆溫搖床上震蕩消化3h，處理溫度為37°C，pH值8. 0 ；然後用pH值為7的磷酸平衡鹽 溶液PBS震蕩清洗3次，每次40min ；③將經步驟②處理後的豬全層角膜重複凍融過程6 8次，然後置於平衡鹽溶 液震蕩清洗6 8次，每次30 40min，得到豬脫細胞角膜；所述凍融過程是把50ml塑料 離心管置於室溫下和空氣中，將豬全層角膜放在離心管中，離心管注滿液氮，在瞬間缺氧 和-196°C條件下冷凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置1.5h，然後鬆開離 心管口，解除缺氧冷凍狀態，待角膜慢慢復溫解凍；
(3)脫水處理將豬脫細胞角膜放在超淨臺上，溫度保持室溫下(20°C 28°C )， 紫外線線照射下，風機吹乾約4h直至角膜乾燥至起始初重，脫水后角膜透明，參見圖lb、圖 2b、圖 3b。(4)消毒、保存脫水處理後的豬脫細胞角膜經鈷6°(25kGey)輻射滅菌後，用體積 分數為95%甘油(4°C冰箱)中保存備用，得到豬脫細胞角膜產品。結果取上述所得豬脫細胞角膜產品進行形態學HE染色觀察、超微結構透射電鏡 觀察、透光率、厚度變化、力學性質、生物相容性分析。HE染色結果顯示正常角膜具有完整 的復層角膜上皮細胞和單層角膜內皮細胞，角膜基質內存在大量基質細胞。脫細胞角膜中 未觀察到任何完整的細胞，上皮層和內皮層，即得到的是脫細胞角膜。透射電鏡照片顯示 脫細胞角膜中膠原纖維排列整齊，未見膠原纖維降解的跡象。透光率結果顯示製備的脫 細胞角膜高度透明，在300 SOOnm波長範圍內，脫細胞角膜的透光率隨著光波波長的增 加，逐漸增加，在SOOnm波長時達到最大值，脫細胞角膜的透光率隨著波長變化的趨勢與正 常角膜比較，無顯著性差異(P >0.05)。角膜厚度變化結果顯示37°C時，乾燥後的脫細 胞角膜置於磷酸鹽緩衝液後，在吸水IOmin 120min時間範圍內，脫細胞角膜厚度隨著吸 水時間的延長，逐漸增加，在120min時達到最大值，脫細胞角膜的角膜厚度變化隨著吸水 時間變化的趨勢與正常角膜比較，無顯著性差異(P >0.05)。高精度生物材料試驗機力學 性質分析結果顯示在0. 1 1.0mm位移範圍內，隨著位移的增加，脫細胞角膜所受的壓強 逐漸增加，脫細胞角膜壓強變化隨著位移變化的趨勢與正常角膜比較，無顯著性差異(P > 0. 05)。將製備的脫細胞角膜為支架材料，進行角膜基質細胞的培養，發現角膜基質細胞在 脫細胞角膜表面能夠生長，參見圖4。說明製備的脫細胞角膜具有良好的生物相容性。從結果分析得出本方法製備的脫細胞角膜既去除了動物角膜基質內的細胞成分， 具有很低的免疫原性，又可以保存角膜膠原纖維的基本架構，從而保留了角膜韌性和透明 性，還具有良好的生物相容性，與自然角膜特性接近，是一種理想的組織工程角膜。應用將製備的脫細胞角膜為活性人工角膜的支架材料，進行角膜相關細胞的培 養角膜獲得可以進行移植的分層與全層活性人工角膜，也可以作為角膜移植物進行治療性 角膜移植眼表修復，還可以作為異種角膜移植的供體材料。實施例2 豬角膜基質脫細胞基質的製備(1)新鮮豬角膜基質的獲取從某屠宰場屠宰後的豬屍體上獲取新鮮豬眼球，修 剪眼球表面附屬組織後用含lOOOu/ml的慶大黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH值為8)洗滌4 次，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下豬全層角膜；將豬全層角膜刮去角膜上皮層和撕去後彈力 層，得到豬角膜基質；室溫20°C 28°C條件下，將獲得的豬角膜基質稱取起始初重；(2)去除角膜基質細胞①室溫下(20°C 28°C )，將獲得的豬角膜基質置於純水中浸泡0. 5h ；②將經步驟①處理後的每塊豬角膜基質置於15ml 300U/ml的磷脂酶A2溶液中， 置於恆溫搖床上震蕩消化3h，處理溫度為37°C，pH值7. 0，然後用pH值為8的磷酸平衡鹽 溶液PBS震蕩清洗3次，每次30min ；③將經步驟②處理後的豬角膜基質重複凍融過程6次，然後置於平衡鹽溶液震蕩 清洗6次，每次40min，得到豬脫細胞角膜基質；所述凍融過程是把50ml塑料離心管置於室 溫下和空氣中，將豬全層角膜放在離心管中，離心管注滿液氮，在瞬間缺氧和-196°C條件下冷凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置1. 5h，然後鬆開離心管口，解除缺氧 冷凍狀態，待角膜慢慢復溫解凍；(3)脫水處理豬脫細胞角膜基質放在超淨臺上，溫度保持室溫下(20°C 28°C )， 紫外線線照射下，風機吹乾約4h直至角膜乾燥至起始初重。(4)消毒、保存脫水處理後的豬脫細胞角膜基質經鈷6°(25kGey)輻射滅菌後，4°C 下保存備用，得到豬脫細胞角膜基質產品。實施例3 牛全層角膜脫細胞角膜的製備(1)新鮮牛全層角膜的獲取從某屠宰場屠宰後的牛屍體上獲取新鮮牛眼球，修 剪眼球表面附屬組織後用含2000u/ml的慶大黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH值為7. 5)洗滌 5次，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全形膜獲取牛全層角膜；室溫20°C 28°C條件下，將獲得 的牛全層角膜稱取起始初重；(2)去除角膜上皮、內皮和基質細胞①室溫下(20°C 28°C )，將獲得的牛角膜置於純水中浸泡Ih ；②將經步驟①處理後的每塊牛全層角膜置於15ml 2. 4U/ml中性蛋白酶Dispase II溶液中，置於恆溫搖床上震蕩消化5h，處理溫度為37°C，pH值6. 0，然後用pH值為7. 5的 磷酸平衡鹽溶液PBS震蕩清洗6次，每次40min ；③將經步驟②處理後的牛全層角膜重複凍融過程8次，然後置於平衡鹽溶液震蕩 清洗8次，每次30min，得到牛脫細胞角膜；所述凍融過程是把50ml塑料離心管置於室溫 下和空氣中，將豬全層角膜放在離心管中，離心管注滿液氮，在瞬間缺氧和-196°C條件下冷 凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置lh，然後鬆開離心管口，解除缺氧冷凍 狀態，待角膜慢慢復溫解凍；(3)脫水處理將牛脫細胞角膜放在超淨臺上，溫度保持室溫下(20°C 28°C)，紫 外線線照射下，風乾約4h直至角膜乾燥至起始初重。(4)消毒、保存脫水處理後的牛脫細胞角膜經鈷6°(25kGey)輻射滅菌後，體積分 數為95%甘油(室溫下)中保存備用，得到牛脫細胞角膜產品。實施例4 牛角膜基質層脫細胞基質的製備(1)新鮮牛角膜基質的獲取從某屠宰場屠宰後的牛屍體上獲取新鮮牛眼球，修 剪眼球表面附屬組織後用含1500u/ml的慶大黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH值為7)洗滌5 次，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下牛全層角膜；將牛全層角膜刮去角膜上皮層和撕去後彈力 層，得到牛角膜基質；室溫20°C 28°C條件下，將獲得的全層角膜或角膜基質稱取起始初 重；(2)去除角膜基質細胞①室溫下(20°C 28°C )，將獲得的牛角膜基質置於純水中浸泡Ih ；②將經步驟①處理後的每塊牛角膜基質置於IOml 2. 4U/ml中性蛋白酶Dispase II溶液中，置於恆溫搖床上震蕩消化3h，處理溫度為37°C，pH值8. 0，然後用pH值為8的 磷酸平衡鹽溶液PBS震蕩清洗5次，每次30min ；③將經步驟②處理後的牛角膜基質重複凍融過程7次，然後置於平衡鹽溶液震蕩 清洗7次，每次35min，得到牛脫細胞角膜基質；所述凍融過程是把50ml塑料離心管置於室 溫下和空氣中，將豬全層角膜放在離心管中，離心管注滿液氮，在瞬間缺氧和-196°C條件下冷凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置lh，然後鬆開離心管口，解除缺氧冷 凍狀態，待角膜慢慢復溫解凍；(3)脫水處理將牛脫細胞角膜基質放在超淨臺上，溫度保持室溫下(20°C 28°C )，紫外線線照射下，吹乾約4h直至角膜乾燥至起始初重。(4)消毒、保存脫水處理後的牛脫細胞角膜基質經鈷6°(25kGey)輻射滅菌後，4°C 下保存備用，得到牛脫細胞角膜基質產品。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於包括如下具體步驟(1)新鮮動物全層角膜或角膜基質的獲取修剪動物眼球表面附屬組織後用含1000～2000u/ml抗生素的磷酸鹽緩衝液洗滌，在手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全形膜，獲得全層角膜；將全層角膜刮去角膜上皮層和撕去後彈力層，得到角膜基質；室溫20℃～28℃條件下，將獲得的全層角膜或角膜基質稱取起始初重；(2)去除角膜上皮、內皮和基質細胞①在室溫20℃～28℃下，將獲得的全層角膜或角膜基質置於純水中浸泡0.5～1h；②將經步驟①處理後的全層角膜或角膜基質置於酶溶液中，放在恆溫搖床上震蕩消化，然後再用平衡鹽溶液震蕩清洗；③將經步驟②處理後的全層角膜或角膜基質重複凍融過程6～8次，然後置於平衡鹽溶液震蕩清洗6～8次，每次30～40min，得到脫細胞角膜或脫細胞角膜基質；所述凍融過程是把離心管置於室溫下和空氣中，將全層角膜或角膜基質放在離心管中，離心管注滿液氮，在瞬間缺氧和 196℃條件下冷凍，並保持缺氧冷凍狀態，緊密管口後在室溫下放置1～1.5h，然後鬆開離心管口，解除缺氧冷凍狀態，待角膜慢慢復溫解凍；(3)脫水處理將脫細胞角膜或脫細胞角膜基質在無菌條件下，保持溫度20℃～28℃，紫外線線照射下，乾燥至起始初重；(4)消毒、保存將經過脫水處理的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質經輻射劑量為25kGey的鈷60輻射滅菌，採用在4℃冰箱中密封保存或在體積分數為95％甘油中保存備用，得到脫細胞角膜或脫細胞角膜基質產品。
2.根據權利要求1所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於步驟(1)所述動物為豬、牛、兔、羊、貓、猴、馬、驢或狗，所述動物眼球為屠宰場屠宰後的 新鮮動物屍體上獲取的；所述抗生素為慶大黴素；所述磷酸鹽緩衝液的PH值為7 8 ；所述 洗滌的次數為3 5次。
3.根據權利要求1所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於步驟②所述震蕩消化的溫度保持37°C，pH值為6 8，時間為3 5h ；所述震蕩清洗的 次數為3 6次，每次30 40min。
4.根據權利要求1所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於步驟②所述酶溶液為磷脂酶溶液或中性蛋白酶溶液；所述酶溶液的用量為10 15ml 每塊全層角膜或角膜基質；所述平衡鹽溶液為pH值為7 8的磷酸平衡鹽溶液PBS ；步驟 ③所述離心管為50ml塑料離心管。
5.根據權利要求4所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於所述磷脂酶溶液是磷脂酶A2溶液，所述中性蛋白酶溶液是中性蛋白酶Dispase II溶 液。
6.根據權利要求5所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於所述磷脂酶溶液是將磷脂酶A2溶解在平衡鹽溶液中製成的濃度為100 300U/ml的溶 液；所述中性蛋白酶溶液是將中性蛋白酶Dispase II溶解在平衡鹽溶液中製成的濃度為2.4U/ml的溶液。
7.根據權利要求1所述的一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在 於步驟(3)所述脫水處理是將脫細胞角膜或脫細胞角膜基質放在超淨臺上進行處理；所述乾燥採用風機吹乾。
8.一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質，是由權利要求1 7任一項所述方法製備得到的。
9.根據權利要求8所述的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質在組織工程的人工角膜構建 中的應用。
10.根據權利要求9所述的脫細胞角膜或脫細胞角膜基質在製備角膜移植或屈光手術 的醫用材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種脫細胞角膜或脫細胞角膜基質及其製備方法和用途。該方法包括步驟(1)新鮮動物全層角膜或角膜基質的獲取；(2)去除角膜上皮、內皮和基質細胞①室溫下用純水浸泡全層角膜或角膜基質；②置於酶溶液中，震蕩消化，再用平衡鹽溶液震蕩清洗；③將全層角膜或角膜基質重複凍融過程4～8次，然後置於平衡鹽溶液震蕩清洗，得到脫細胞角膜或脫細胞角膜基質；(3)脫水處理；(4)消毒、保存。本方法角膜脫細胞處理時間短，對角膜結構與生理特性影響較小，處理後的角膜具有很低的免疫原性，與自然角膜特性接近。脫細胞角膜或脫細胞角膜基質可用於組織工程的人工角膜構建，又可作為醫用材料用於角膜移植、屈光手術。
文檔編號A61L27/36GK101985051SQ20101051598
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者何克雲, 戴靜, 陳建蘇 申請人:暨南大學