小鵝瘟活疫苗的製備方法及其製備的活疫苗的製作方法

2023-06-09 04:48:51 3

專利名稱：小鵝瘟活疫苗的製備方法及其製備的活疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及小鵝瘟活疫苗的製備方法及其製備的活疫苗。
背景技術：
鵝瘟是由小鵝瘟病毒引起的20日齡以內的雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病， 其發病率和死亡率可高達9(Γ100%，對養鵝業造成巨大經濟損失的疫病。1956年方定一教 授首先在揚州發現此病，1961年方定一、王永坤等在揚州再次發現本病，並分離到病毒，命 名為小鵝瘟，其病原為小鵝瘟病毒。此病在全國各省份和世界養鵝國家均有暴發流行。根據國際獸醫局(OIE)國際委員會通過的由OIE標準委員會編的哺乳動物、禽和 蜜蜂A和B類疾病「診斷試驗和疫苗標準手冊」(第三版，1996年)中未見有「小鵝瘟診斷試 驗和疫苗」方面的內容及標準。八十年代末由廣東省佛山獸醫專科學校制訂的「鴨胚化小鵝瘟弱毒苗」通過部規 程委員會。九十年代初有福建獸醫生藥廠和廣東獸醫生藥廠生產供應。據了解，毒種接種 鴨胚死亡僅為7(Γ80% ；鴨胚含毒量低；每ml苗免疫羽份僅為鵝胚化疫苗的1/1(Γ1/100 ； 免疫效果差。本申請人於80年中期將已經研製的「鴨胚化小鵝瘟活疫苗」淘汰，其主要原 因包括在鴨胚傳25代，毒種最高僅能使鴨胚死亡80%，不穩定；鴨胚死亡時間沒有規律， 時間太長；鴨胚胚液少，產量低，成本高。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種小鵝瘟活疫苗 的製備方法，以實現用最簡單的製備方法製備出產量高、穩定性好、成本低的疫苗。本發明 的另一目的是提供由上述方法製備得到的疫苗。技術方案為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下
一種製備小鵝瘟活疫苗的方法，將接種了小鵝瘟種毒的鵝胚孵化，收集48 144h內死 亡鵝胚的胚液，經冷凍真空乾燥得到小鵝瘟活疫苗。所述的小鵝瘟病毒的毒株為SYG61毒株的26 35代毒或4廣50代毒，SYG61為揚 州大學(原蘇北農學院)方定一、王永坤教授在1961年在國際上首次報導、分離的小鵝瘟毒 株。所述的小鵝瘟病毒的毒株的接種量為將毒種用生理鹽水作1:100倍稀釋，0.2ml/胚。所述的鵝胚為無小鵝瘟抗體易感鵝胚。所述鵝胚為12 14日齡，接種途徑為尿囊腔接種，孵化溫度為37. 5°C
收集48 144h內死亡鵝胚的胚液，病毒含量應嘗107_°ELD5Q/1.0ml，即可用於制苗。先將檢驗合格的胚液過濾於滅菌容器內，加入5%蔗糖脫脂牛奶作穩定劑，同時加 入青黴素、鏈黴素各1000單位/ml，充分搖勻，定量分裝，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
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上述的製備小鵝瘟活疫苗的方法所製得的活疫苗。本發明的小鵝瘟活疫苗的製備方法，包括小鵝瘟種毒SYG61的篩選，將小鵝瘟 病毒種毒用滅菌PBS作1:100稀釋，接種12日齡發育良好的鵝胚，每胚絨尿腔0. 2ml，將 48^144小時死亡的鵝胚，置2、°C冰箱冷卻壙24小時。分別將經冷卻的鵝胚侵入於5%新 潔爾滅消毒液5 10分鐘，擦乾後放置無菌室內，先以5%碘酊消毒氣室蛋殼部，以無菌手續 打開蛋殼，撥除蛋膜及撕破絨尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脫脂牛奶作穩定劑，同 時加入青黴素、鏈黴素各1000單位/ml，充分搖勻，定量分裝，分裝後迅速進行冷凍真空幹
O本發明的小鵝瘟活疫苗的製備方法，包括種鵝用小鵝瘟活疫苗和雛鵝用小鵝瘟活 疫苗製造，所述小鵝瘟活疫苗是將接種小鵝瘟種毒的鵝胚孵化，收集48 144小時內死亡鵝 胚的胚液，經冷凍真空乾燥得到小鵝瘟活疫苗。種鵝用的活疫苗的種毒為SYG61毒株的 26 35代毒，代號為SYG26 35 ；製造雛鵝和雛鵝用的活疫苗的種毒為SYG61毒株的4廣50代 毒，代號為SYG4廣50。本發明的小鵝瘟活疫苗的製備方法，步驟少，易操作，所製備出的小鵝瘟活疫苗， 產量高、穩定性好、成本低，免疫保護效果好。種鵝在產蛋前15天左右用1 100稀釋的鵝 胚化種鵝弱毒苗進行皮下或肌肉注射。在免疫12天後至100天左右，鵝群所產蛋孵化的雛 鵝群能抵抗人工及自然病毒的感染。未經免疫的種鵝群，或種鵝群免疫100天以上的所產 蛋孵化的雛鵝群，在出炕48小時內應用鵝胚化雛鵝弱毒疫苗進行免疫，免疫後7天內嚴格 隔離飼養，防止強毒感染，保護率達95%左右。在已被汙染的雛鵝群作緊急預防，保護率達 70% 80%。


圖1是小鵝瘟病毒攻毒結果表。 圖2是安全試驗結果表。 圖3是攻毒試驗結果表。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的解釋。實施例1毒種研究 一種毒的分離
病料1961年從揚州發生小鵝瘟的患病雛鵝的肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、腦、血液病毒分罔。病料處理無菌採集患病雛鵝的肝、脾、胰、腦等內臟器官病料和無菌採集患病雛 鵝的肝、胰、脾等病料，分別剪碎、磨細，用滅菌PBS液作1 5稀釋，經3000轉/分離心30分 鍾，取離心的上清液按4:1加入分析純氯仿充分混勻後放置37°C溫箱作用60分鐘，或4°C 冰箱過夜，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液加入抗菌素，使之每毫升含有青黴素、鏈黴 素各1000單位，於37°C溫箱作用30分鐘，經細菌檢驗為陰性者，凍結保存作為病毒分離材 料。該方法因經氯仿處理後可清除其他病毒，尤其是清除囊膜病毒在病毒分離過程中 的幹擾，可獲較為可靠的小鵝瘟病毒。病毒分離接種將病毒組織上清液材料接種12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔接種 0.2ml。收穫72小時以後死亡鵝胚絨尿液，經細菌檢驗合格，低溫保存作為傳代毒種。患病雛鵝分離的毒種簡稱為SYG61毒株，
傳代將SYG61毒株鵝胚絨尿液分別在12日齡易感鵝胚絨尿腔傳代。鑑定除了作細菌、黴菌和支原體常規檢驗外，外源病毒檢驗以雞胚接種和紅細胞 凝集試驗。雞胚接種鵝胚絨尿液毒分別接種10日齡SPF雞胚和12日齡易感鵝胚，每枚絨尿 控接種0. 2ml，觀察10天。紅細胞凝集試驗鵝胚絨尿液毒與1. 0%雞紅細胞試管或50孔板凝集反應。SYG61毒株初次分離時，僅能引起部分鵝胚在5 7天死亡。在易感鵝胚傳10代後能 使12 14日齡易感鵝胚死亡，死亡率達95%左右。鵝胚死亡時間在48 120小時，大多數在 72 96小時之間。經細菌、黴菌、支原體檢驗證明不帶細菌。經雞胚接種不引起雞胚死亡，雞 胚無病變，絨尿液不凝集雞紅細胞。鵝胚絨尿液無凝集紅細胞現象。雛鵝的小鵝瘟病毒的分離和傳代所用的鵝胚必須未經免疫，瓊擴抗體為陰性的健 康種鵝群，發育良好的12日齡。免疫過或瓊擴陽性的種鵝群的胚胎對病毒不易感，不能作 為分離和傳代用。製造種鵝用的活疫苗的種毒為SYG61毒株的26 35代毒，代號為SYG2fr35 ；製造雛 鵝和雛鵝用的活疫苗的種毒為SYG61毒株的4廣50代毒，代號為SYG41~5Q。二種毒毒力返強試驗
種毒=SYG26代鵝胚絨尿液毒、SYG 41代鵝胚絨尿液毒。雛鵝非疫區、未經免疫、瓊擴檢驗抗體陰性的健康種鵝群後代的雛鵝。鵝胚非疫區、未經免疫、瓊擴檢驗抗體陰性的健康種鵝群的胚胎。毒力返強試驗
將SYG26和SYG41代製備的鵝胚絨尿液毒分別皮下注射5隻5日齡健康雛鵝，每雛鵝注 射0. 5ml。72小時任取其中2隻雛鵝撲殺，按無菌手續採取肝、脾組織，稱重後混合置滅菌研 磨器中磨碎，用滅菌Hanks液作1:5稀釋，每ml加入青黴素和鏈黴素各1000單位，置37°C 溫箱作用30分鐘。取上清液接種5隻5日齡同一來源的易感雛鵝，每隻皮下0. Iml0 72小 時任取其中2隻雛鵝撲殺，按此方法，SYG26連續傳4代，SYG41連續傳5代。每代未撲殺的 雛鵝均隔離飼養觀察10天。SYG26代製備的鵝胚絨尿液毒，經易感雛鵝連續傳4代和SYG41代製備的鵝胚絨尿 液毒，經易感雛鵝連續傳5代，每代撲殺的雛鵝內臟器官無肉眼可見病變，也無小鵝瘟組織 學顯微病理變化，未撲殺的雛鵝未發生死亡，生長情況良好，無任何不良反應。上述結果說 明弱毒株對雛鵝具有安全可靠，無毒力返強現象。將SYG26代製備的鵝胚絨尿液毒皮下注射6隻5日齡雛鵝，每雛鵝0. 5ml。72小時 任取其中3隻雛鵝撲殺，按無菌手續採取肝、脾組織，稱重後混合置滅菌研磨器中磨細，用 滅菌生理鹽水作1 5稀釋，每ml加青黴素和鏈黴素各1000單位，置37°C溫箱作用30分鐘。 取上清液接種6隻5日齡同一來源的易感雛鵝，每隻皮下0. Iml0 72小時任取其中3隻雛 鵝撲殺，按此方法連續傳5代。每代未撲殺的3隻雛鵝均分別隔離飼養觀察10天。SYG41代製備的鵝胚絨尿液毒，經易感雛鵝連續傳5代，每代撲殺的雛鵝內臟器官 無肉眼可見的病變，也無組織學顯微病理變化。未撲殺的雛鵝未發生死亡，生長良好，無任 何不良反應。上述結果說明本弱毒株對雛鵝具有安全可靠，無毒力返強現象。
病毒在鵝體內存留的測定
50隻試驗鵝，每隻胸部肌肉注射1:10，0.1ml SYG26代製備的鵝胚絨尿液毒。注射24、 48、72、144和240小時5個不同時間殺死，每批撲殺5隻。用無菌手續分別等量取5隻鵝 肝、脾混合磨細，腸內容物和十二指腸腸管剪碎磨細，置 15°C冰箱內凍結保存。將被檢材 料分別用滅菌生理鹽水作1:5稀釋，經離心取上清液每ml加入各1000單位青黴素和鏈黴 素，於37°C溫箱作用1小時。每個被檢材料接種5枚13日齡鵝胚，每胚絨尿腔0.2ml。在 48^144小時內死亡的鵝胚經無菌檢驗、血凝檢測及病變檢查，符合本病毒特性者為準。觀察 10天。從SYG26代製備的鵝胚絨尿液毒注射24小時後首先在十二指腸組織檢測到病毒， 48小時在十二指腸、腸內容物均可檢測到病毒，96小時在十二指腸、腸內容物和肝、脾組織 均可檢測到病毒，而144小時和240小時均沒有檢測到病毒。從上述結果，本弱毒株注射鵝 體後2Γ96小時病毒在十二指腸出現，96小時在腸內容物及肝脾組織出現，而144上時沒能 檢測到病毒。說明本病毒在鵝體內存留96小時左右；96小時腸內容物檢測僅引起20%鵝 胚死亡，因此小鵝瘟弱毒株種鵝免疫注射後，對飼養場地汙染是暫時，在產蛋前二周注射， 病毒對蛋殼的汙染機會基本沒有。從SYG26代和SYG41代製備的病毒液在易感雛鵝體內連續傳4代和5代，經飼養觀 察以及肉眼和顯微病理學檢查結果，證明無毒力返強現象。從SYG26R製備的病毒液在鵝體 內存留的測定結果，病毒在體內及腸內容物存留96小時左右，144小時已檢測不到病毒。從SYG26代製備的病毒液在易感雛鵝體內連續傳5代，經飼養觀察以及肉眼和顯微 病理學檢查結果，證明無毒力返強現象。試驗結果，說明具有可靠的安全性。實施例2小鵝瘟活疫苗的製備
本發明所使用的SYG61為揚州大學(原蘇北農學院)方定一、王永坤教授在1961年在國 際上首次報導、分離的小鵝瘟毒株 毒種的繁殖
小鵝瘟病毒的毒種為在易感鵝胚連續傳代的鵝胚絨尿液。製造種鵝用的活疫苗的種毒 為SYG26 35 ；製造雛鵝和雛鵝用的活疫苗的種毒為SYG4廣50。將凍幹毒種先加少許滅菌 PBS液乳化，吸出再稀釋使其達1 100稀釋。或將保存於 15°C的鵝胚絨尿液毒種用滅菌 PBS液作1:100稀釋。將經稀釋的毒種接種1(Γ20枚12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔0. 2ml。 選取接種48 120小時內死亡，病變典型的鵝胚，分別收穫鵝胚液(尿囊液和羊水)，裝於滅菌 容器內。將經檢驗無菌的胚液混合，定量分裝，冷凍保存。注射收穫日期、毒種代次等。毒種鑑定按《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》，應符合規定。毒種保存在 15°C，使用期應不超過1年。毒種繼代應不超過10代。制苗材料選擇
制苗用的種鵝蛋，為非疫區、未經小鵝瘟疫苗免疫、小鵝瘟病毒瓊擴診斷抗原檢驗抗體 陰性的和經鵝副粘病毒病滅活苗及禽流感滅活苗免疫的健康種鵝群。種蛋要新鮮和85%以 上受精率。經消毒後立即置37 38°C孵卵箱內孵化，相對溫度為6(Γ70%之間。選擇發育良 好的12日齡鵝胚作為小鵝瘟制苗材料。制苗毒液的繁殖
6取生產用小鵝瘟病毒種鵝用和雛鵝用毒種，分別用滅菌生理鹽水作1:100倍稀釋，接 種12日齡鵝胚，每胚絨尿腔0.2ml。接種後置37 38°C溫室(孵化箱)繼續孵化，不必翻蛋。小鵝瘟病毒接種的鵝胚，接種後每天照蛋一次，將48小時前死亡胚棄去，4纊144 小時間，每8小時照蛋一次，隨時取出死亡鵝胚，置2 8°C冰箱冷卻壙24小時。分別將冷卻後的鵝胚浸泡於5%新潔爾滅消毒液5 10分鐘，用消毒紗巾擦乾後放 置無菌室內。先以5%碘酊消毒氣室蛋殼部位，以無菌手續打開蛋殼，拔除蛋膜及撕破絨尿 膜，吸出尿液和羊水。每若干個胚的絨尿液(25(T500ml)混合為一組，置於滅菌瓶中，並加入 適量抗菌素，放2 8°C冰庫處理，留樣後，結凍保存。在收穫過程中同時逐個觀察胚體病變， 如胎兒腐敗、液體混濁及有任何汙染可疑的胚棄去不用。半成品檢驗
將每組留樣按《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》(2001)附錄301頁進行，應 無細菌生長。病毒含量測定每ml含量，小鵝瘟病毒> 107_°。配苗及分裝
先將檢驗合格的同一毒株的絨尿液混合。將雛鵝細小病毒液和小鵝瘟病毒液分別過濾 於兩個滅菌容器內。再將兩種病毒液等量混合後加入5%蔗糖脫脂牛奶作穩定劑，同時加入 適量抗菌素，充分搖勻，定量分裝，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。凍幹完畢壓塞、加蓋、貼 籤，置低溫保存。成品檢驗
物理性狀凍幹苗為微黃色或白色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液後迅速溶解。無菌檢驗按《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》2001版附錄301頁進行， 應無細菌生長。支原體檢驗按《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》2001版附錄305頁進 行，應無支原體生長。鑑別檢驗本品用抗小鵝瘟病毒血清等量混合進行中和後，尿囊腔接種10日齡易 感鵝胚6枚，每枚尿囊腔接種0. 2ml，應不發生感染死亡。外源病毒檢驗按《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》(2001)二版附錄306 頁檢驗外，2. 1. 1法進行。但在用SPF雞胚檢驗的同時應加30個10日齡的鵝胚，同時分組 試驗，觀察判定。應無外源病毒汙染。安全檢驗按瓶籤註明羽份，疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成每毫升含20羽份，皮下 注射5日齡雛鵝5隻，每隻皮下注射1ml，觀察14天，應無臨床反應。效力檢驗用2日齡健康易感雛鵝10隻，每隻皮下接種疫苗0. Iml (相當於1個 使用劑量)，免疫後9天，第一組連同條件相同的未免疫對照雛鵝10隻，另一組連同條件相 同的未免疫對照雛鵝10隻，各皮下注射小鵝瘟SYG61強毒1:50，0. 5ml。攻毒後均觀察14 天，對照組至少8隻發病死亡，各免疫組至少9隻保護為合格。實施例3小鵝瘟活疫苗的效力檢驗 雛鵝疫苗保護效力檢驗
疫苗0607、0608、0609、0901、0902等5批凍幹苗，每瓶苗為500羽劑量，保存於 15°C冰箱備用。雛鵝非疫區、未經免疫、瓊擴抗體陰性的種鵝群的2日齡雛鵝。攻毒毒種小鵝瘟病毒SYG61強毒株。對一日齡雛鵝毒力，每ml應> 106LD50。0607、0608、0609等3批凍幹苗，每批任取5瓶，每瓶加1. Oml滅菌生理鹽水溶解， 抽取等量苗液作混合樣。共免疫三群13010隻，每隻於出殼後48小時內用1:50稀釋苗液， 皮下注射0. 1ml，隔離飼養9天。176隻用SYG61毒株攻擊，另設10隻同日齡雛鵝作對照組， 每隻皮下注射1:50稀釋0. 5ml, 10隻作空白對照組，隔離飼養觀察14天。0901,0902等2批凍幹苗，每批任取5瓶，每瓶加1. Oml滅菌生理鹽水溶解，抽取等 量苗液作混合樣。免疫兩群各800餘只雛鵝，每隻於出殼後48小時內用1:50稀釋苗液，皮 下注射0. 1ml，隔離飼養9天。每群任取50隻用SYG61毒株攻擊，另設10隻同日齡雛鵝作 對照組，每隻皮下注射1:50稀釋0. 5ml, 10隻空白對照組，隔離飼養觀察14天。0607、0608、0609等3批凍幹苗免疫後生長良好，無不良反應。免疫後9天用強毒 株攻擊。小鵝瘟病毒SYG61毒株攻擊結果，0607批凍幹苗免疫的59隻，存活56隻，保護率 為94. 92% ；0608批凍幹苗免疫的59隻，存活55隻，保護率為93. 22% ；0609批凍幹苗免疫的 58隻，存活54隻，保護率為93. 10% ；而10隻對照組雛鵝攻毒後死亡9隻，死亡率為90% ； 10 只空白對照組全部健活。0901,0902等2批凍幹苗免疫後生長良好，無不良反應。免疫後9天分別強毒攻 擊。小鵝瘟病毒SYG61毒株攻擊結果，9901批凍幹苗免疫的50隻，存活49隻，保護率為 98% ；0902批凍幹苗免疫的50隻存活47隻，保護率為94% ；而10隻對照組雛鵝攻毒後死亡 9隻，死亡率為90%。詳細結果如圖1所示。應用小鵝瘟SYG61弱毒株製備的5批凍幹苗，每隻2日齡雛鵝注射1 50，0. Iml苗 液，免疫9天後分別用1:50，0. 5ml強毒攻擊。結果；用小鵝瘟病毒攻擊的276隻雛鵝，保護 261隻，保護率為94. 57%，而20隻對照組雛鵝死亡18隻，死亡率為90%，20隻空白對照雛鵝 全部健活。上述結果表明雛鵝出殼後48小時內用雛鵝用活疫苗免疫，免疫後9天有94%左 右保護率。小鵝瘟病毒SYG4廣50弱毒株製備的0607、0901等5批凍幹苗，共免疫14610隻 2日齡雛鵝。免疫後9天；任取276隻雛鵝用小鵝瘟病毒SYG61強毒攻擊，每隻皮下1:50， 0. 5ml。結果，保護261隻，保護率為94. 57%，而20隻對照組死亡18隻，死亡率為90%，40隻 空白對照組雛鵝全部健活。種鵝疫苗保護效力檢驗
抗小鵝瘟母源抗體是由種母鵝經卵傳遞給雛鵝，具有抵抗小鵝瘟病毒侵襲，保護雛鵝 不受感染髮病的作用。本試驗通過免疫監測及攻毒試驗，測定由小鵝瘟活疫苗免疫後種鵝 後代雛鵝母源抗體的消長規律和對強毒攻擊的保護效果。種鵝選一養鵝戶飼養種鵝20隻，供小鵝瘟疫苗免疫。其中10隻隔離飼養，作為 安全性試驗組。雛鵝來源於免疫鵝種蛋孵化鵝雛24隻，為母源抗體檢測組，供採血測定母源抗 體，另選無母源抗體雛鵝15隻，隔離飼養，作為對照組。小鵝瘟活疫苗試驗用疫苗為小鵝瘟活苗實驗室試產品批號為0804，0806，0902。攻毒毒種小鵝瘟病毒SYG61強毒株。對一日齡 鵝毒力，每ml應> 106LD50。
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抗體檢測以常規瓊脂免疫擴散試驗法檢測種鵝及雛鵝血清沉澱抗體。安全性試驗組用製備好的活接種10隻健康鵝，每隻注射10羽份，隔離器內飼養， 觀察15天。種鵝免疫種鵝以小鵝瘟活苗注射1羽份，兩周後翅下靜脈採血分離血清，檢測抗 體滴度，同時開始集種蛋孵化。雛鵝分別於1，3，5，7，10，13，16，20日齡，隨機經心臟採血5份，分離血清檢測母 源抗體。攻毒試驗分別於1，8，16日齡每組隨機選取雛鵝只，隔離飼養，以小鵝瘟強毒 0. 2mL/只皮下注射攻毒，連續觀察20d。安全性試驗結果見圖2。從圖2可以看出，將製品以10倍使用劑量接種80日齡 鵝，在注射部位及全身均無不良反應，證明疫苗安全性良好。血清抗體檢測
種母鵝血清抗體種母鵝小鵝瘟疫苗免疫前血清抗體為陰性，免疫後兩周血清抗體轉 陽性，抗體變化，種母鵝血清抗體滴度檢測結果見表1。表1種母鵝血清抗體滴度檢測結果
血清號12345免疫前00000免疫二周後24· 024· 025· 024· 023· 0
雛鵝血清母源抗體變化，見表2。
表2雛鵝血清母源抗體滴度平均值
日齡135710131620抗體量23· 223· 223· 022· 822· 021· 821· 22°· 8陽性率1001001001001001008040
攻毒試驗結果，見圖3。 從疫苗的免疫試驗結果來看，小鵝瘟油乳劑疫苗在免疫後第14天即產生較高水 平抗體。從免疫攻毒試驗來看，未免疫組全部發病，而免疫組完全健活。因此進一步證明了 該疫苗能有效地控制小鵝瘟病毒的流行和發生。
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權利要求
一種製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於將接種了小鵝瘟種毒的鵝胚孵化，收集48 144h內死亡鵝胚的胚液，經冷凍真空乾燥得到小鵝瘟活疫苗。
2.根據權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於所述的小鵝瘟病毒 的毒株為SYG61毒株的26-35代毒或41-50代毒。
3.根據權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於所述的小鵝瘟病毒 的毒株的接種量為將毒種用生理鹽水作1:100倍稀釋，0. 2ml/胚。
4.根據權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於所述的鵝胚為無小 鵝瘟抗體易感鵝胚。
5.根據權利要求1或4所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於所述鵝胚為 12-14日齡，接種途徑為尿囊腔接種，孵化溫度為37. 5°C。
6.根據權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於收集48-144h內死 亡鵝胚的胚液，病毒含量應嘗107_°ELD5Q/1.0ml，即可用於制苗。
7.根據權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法，其特徵在於先將檢驗合格的胚 液過濾於滅菌容器內，加入5%蔗糖脫脂牛奶作穩定劑，同時加入青黴素、鏈黴素各1000單 位/ml，充分搖勻，定量分裝，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
8.權利要求1所述的製備小鵝瘟活疫苗的方法所製得的活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種小鵝瘟活疫苗的製備方法及其製備的活疫苗。該小鵝瘟活疫苗的製備方法包括小鵝瘟種毒SYG61的篩選，將小鵝瘟病毒種毒用滅菌PBS作1:100稀釋，接種12日齡發育良好的鵝胚，每胚絨尿腔0.2ml，將48~144小時死亡的鵝胚，置2~8℃冰箱冷卻4~24小時。分別將經冷卻的鵝胚侵入於5%新潔爾滅消毒液5~10分鐘，擦乾後放置無菌室內，先以5%碘酊消毒氣室蛋殼部，以無菌手續打開蛋殼，撥除蛋膜及撕破絨尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脫脂牛奶作穩定劑，同時加入青黴素、鏈黴素各1000單位/ml，充分搖勻，定量分裝，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。本發明的小鵝瘟活疫苗的製備方法，步驟少，易操作，所製備出的小鵝瘟活疫苗，產量高、穩定性好、成本低，免疫保護效果好。
文檔編號A61P31/20GK101972473SQ201010515949
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年10月22日
發明者周玉雙, 尹松濤, 張建軍, 陳清, 顧成鋼 申請人:揚州威克生物工程有限公司