成骨生長肽碳端五肽的合成方法
2023-06-08 20:58:16 3
成骨生長肽碳端五肽的合成方法
【專利摘要】一種成骨生長肽碳端五肽的合成方法，由以下步驟組成：合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化，依次合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH、NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
【專利說明】成骨生長肽碳端五肽的合成方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及多肽的合成，尤其是短肽的液相合成。
【背景技術】
[0002]成骨生長肽(Osteogenic Growth Peptide)是有促進成骨和刺激造血作用的多妝類生長因子，一級結構為 Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，其中碳端的五肽OGP (10~14)是保持成骨生長肽全部活性的最小片段，胺基酸序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
[0003]成骨生長肽碳端五肽的製備方法有酶促合成法和固相合成法。其中固相合成法最為常用，即將保護甘氨酸接到固相載體上，按固定序列由碳端向氮端逐個延伸，通過縮合、脫除保護、再縮合、切割樹脂、離心、乾燥得到粗品，經高效液相製備得到純度高於90%的產品。該方法使用了保護的胺基酸，並需過量的原料和試劑，導致增加了生產成本，汙染了環境，浪費了原材料；且樹脂載體的交換當量有限，只能進行小批量合成，不能滿足實際生產需求。在成骨生長肽碳端五肽的製備方法【技術領域】，當前需迫切解決的一個技術問題是提供一種生產成本低、對環境汙染少、收率高的合成方法。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題在於克服上述成骨生長肽碳端五肽製備方法的缺點，提供一種生產成本低、對環境汙染少、收率高的成骨生長肽碳端五肽的合成方法。
[0005]解決上述技術問題所採用的技術方案由下述步驟組成:
[0006]由下述步驟組成:
[0007]1、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu
[0008]將Fmoc-Tyr (tbu)-COOH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu)-C00H 加入IOmLl, 4- 二氧六環，室溫攪拌，加入氮羥基丁二醯亞胺，再加入二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-COOH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應10~12小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液為溶有Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu 的 1，4- 二氧六環溶液。
[0009]2、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH
[0010]將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu的1，4- 二氧六環溶液中,Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2,室溫攪拌反應5~8小時,減壓蒸除二氧六環,加I~5倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質量分數為10%的檸檬酸水溶液調pH至2~3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空乾燥箱內40 °C以下乾燥,得Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH。
[0011]3、Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 活化
[0012]將Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 加入IOmL乙酸乙酯，室溫攪拌，加入氮羥基丁二醯亞胺或對硝基苯酚，再加入二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH與氮羥基丁二醯亞胺或對硝基苯酹、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應12~15小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液減壓濃縮至幹，得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu 或 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-ONp。
[0013]4、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-OH
[0014]將步驟(3 )所得的產物置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu或Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp加入IOmL四氫呋喃,室溫攪拌,至完全溶解。
[0015]將0.5mM/mL的苯丙氨酸懸浮液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合,混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu 或 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-ONp 的摩爾比為 1.2 ~1.8:1.2~2:1，室溫攪拌反應8~10小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調PH至2~3，有白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH。
[0016]5、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu
[0017]將Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-OH 置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-OH加入IOmLl, 4-二氧六環,採用步驟I的反應條件進行化學反應，得到溶有 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu 的 1，4- 二氧六環溶液。
[0018]6、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH
[0019]將0.5mM/m L的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2,室溫攪拌反應10~15小時，減壓蒸除二氧六環，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH為2~3，加乙酸乙酯萃取，分離有機相，有機相依次用水、質量濃度為26.5%氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷與乙醚體積比為1:3的混合液40KHz超聲洗滌三次，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得到 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH 純品。
[0020]7、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp
[0021]將Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH 置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒，室溫攪拌，加入對硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)~碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應15~17小時，水洗滌除去鹽，有機相減壓濃縮至幹，得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp。
[0022]8、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0023]將步驟(7)所得的產物置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃,室溫攪拌至完全溶解。
[0024]將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1: 1.2~1.8:1.2~2，室溫攪拌反應10~15小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH至2~3，白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色譜分離，用乙酸乙酯衝洗雜質，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為1:3的混合液衝洗目標物，收集，減壓蒸乾，得到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 純品。
[0025]9、合成 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0026]在每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH 中加入 10mT,哌唳與 1，4_ 二氧六環體積比為1:9的混合液，室溫反應30分鐘，減壓蒸乾，用水溶解，用二氯甲烷萃除雜質，水相減壓濃縮至幹，得 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH。
[0027]10、合成 NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0028]在每克NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 中加入 IOmL 體積分數為 95% 的三氟乙酸水溶液，室溫反應10分鐘，減壓濃縮，加濃縮體積7倍量的冷凍乙醚，攪拌，離心，分離出上清液，固體經真空乾燥箱內40°C以下乾燥,得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍幹得純度大於93%的序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。
[0029]在本發明的合成Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH步驟2中，將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的最佳摩爾比為1:1.5:1.5，室溫攪拌反應5~8小時，減壓蒸除二氧六環，加3倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質量分數為10%的檸檬酸水溶液調pH至2~3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空乾燥箱內 40°C 以下乾燥，得 Fmoc- Tyr (tbu)-Gly-OH。
[0030]在本發明的合成Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp 步驟 7 中，將Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲烷，室溫攪拌，加入對硝基苯酚，再加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酹、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽的最佳摩爾比為1:1.5:1.5，室溫反應15~17小時,水洗除去鹽，有機相減壓濃縮至幹，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp。
[0031]本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0032]本發明採用由氮端向碳端逐個延伸的方法合成成骨生長肽碳端五肽，選用游離的胺基酸，避免使用過量的原料和試劑，適應於規模化生產；與固相合成法相比，降低了生產成本，減少了試劑汙染，提高了產量，能夠滿足實際需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是採用本發明實施例1合成的成骨生長肽碳端五肽的液相色譜圖。
[0034]圖2是採用本發明實施例1合成的成骨生長肽碳端五肽的質譜圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。
[0036]實施例1
[0037]以所用原料Fmoc-Tyr (tbu)-COOH的摩爾量為30mM合成成骨生長肽碳端五肽為例，其合成方法如下:
[0038]1、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu
[0039]將Fmoc-Tyr (tbu)-C00H13.78g 置於 500mL 反應瓶中，加入 140mL 的 1，4- 二氧六環(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-COOH加入IOmLl, 4-二氧六環)室溫攪拌,加入5.18g氮羥基丁二醯亞胺，再加入9.28g 二環己基碳二亞胺,攪拌至溶解,Fmoc-Tyr (tbu) -COOH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫反應11小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液為溶有Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu的1，4- 二氧六環溶液；
[0040]2、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH
[0041]將90mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和90mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合,混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中,Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫攪拌反應7小時，減壓蒸除二氧六環，加3倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質量分數為10%的檸檬酸水溶液調pH至2~3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空乾燥箱內40°C以下乾燥,得Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-0H14.29g,產率92.19%。
[0042]3、Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 活化
[0043]將14.29g 的 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH 置於 500mL 反應瓶中，加入 143mL 的乙酸乙酯(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH加入IOmL乙酸乙酯),室溫攪拌,加入4.77g氮羥基丁二醯亞胺，再加入8.56g 二環 己基碳二亞胺,攪拌至溶解,Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫反應13小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液減壓濃縮至幹，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu。
[0044]4、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH
[0045]將步驟3所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu加入IOmL四氫呋喃，室溫攪拌，至完全溶解；
[0046]將83mL的0.5mM/mL苯丙氨酸懸浮液和83mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu的摩爾比為1.5:1.5:1，室溫攪拌反應9小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH至2~3，有白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內 40°C 以下乾燥，得 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-0H15.56g，產率 84.75%。
[0047]5、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-COOSu
[0048]將15.56g 的 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH 置於 500mL 反應瓶中，加入 160mL 的
I,4- 二氧六環(即每克Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH加入IOmLl, 4- 二氧六環),採用步驟I的反應條件進行化學反應，得到溶有Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液。
[0049]6、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH
[0050]將70mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和70mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到F moc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5,室溫攪拌反應13小時，減壓蒸除二氧六環，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH為2~3，加乙酸乙酯萃取，分離有機相，有機相依次用水、質量濃度為26.5%氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己燒與乙醚體積比為1:3的混合液40KHz超聲洗滌三次，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH 純品 12.67g,產率 75.01%,純度大於 89%。
[0051]7、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp
[0052]將12.67g 的 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH 置於 500mL 反應瓶中，加入 190mL二氯甲燒(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒)，室溫攪拌,加入
3.67g對硝基苯酚，再加入5.05g的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫反應16小時，水洗滌除去鹽，有機相減壓濃縮至幹,得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp。
[0053]8、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0054]將步驟7所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃,室溫攪拌至完全溶解；
[0055]將52.8mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和52.8mL的0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1: 1.5:1.5,室溫攪拌反應13小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH至2~3，白色固體析出， 減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色譜分離，用乙酸乙酯衝洗雜質，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為1:3的混合液衝洗目標物，收集，減壓蒸乾，得到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 純品 9.7g,產率 70.96%,純度大於 99%。
[0056]9、合成 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0057]在9.7g 的 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 中加入 97mL 哌唳與 1，4_ 二氧六環體積比為1:9的混合液(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入IOmL混合液)，室溫反應30分鐘，減壓蒸乾，用水溶解，用二氯甲烷萃除雜質，水相減壓濃縮至幹，得NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-0H6.82g,產率 98.43%。
[0058]10、合成 NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0059]在6.82g 的 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 中加入 70mL 體積分數為 95% 的三氟乙酸水溶液，室溫反應10分鐘，減壓濃縮至20mL，加濃縮液體積7倍量的冷凍乙醚，攪拌，離心，分離出上清液，固體經真空乾燥箱內40°C以下乾燥,得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品5.98g，產率97.51%，純度大於80%，經反相色譜法純化，濃縮，凍幹得純度大於93%的序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽4.78g，總收率31.93%。
[0060]實施例2
[0061]以所用原料Fmoc-Tyr (tbu)-COOH的摩爾量為30mM合成成骨生長肽碳端五肽為例，其合成方法如下:
[0062]1、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu
[0063]將Fmoc-Tyr (tbu)-C00H13.78g 置於 500mL 反應瓶中，加入 140mL 的 1，4- 二氧六環(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-COOH加入IOmLl, 4-二氧六環)室溫攪拌,加入4.14g氮羥基丁二醯亞胺，再加入7.42g 二環己基碳二亞胺,攪拌至溶解,Fmoc-Tyr (tbu) -COOH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2:1.2，室溫反應10~12小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0064]2、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH
[0065]將72mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和72mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中,Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2:1.2，室溫攪拌反應5~8小時，減壓蒸除二氧六環，加I倍混合液體積的乙醚，攪拌。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0066]3、Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 活化
[0067]將Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 加入IOmL乙酸乙酯，室溫攪拌，加入3.82g氮羥基丁二醯亞胺，再加入6.85g 二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2:1.2，室溫反應12~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0068]4、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH
[0069]將步驟3所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu加入IOmL四氫呋喃，室溫攪拌，至完全溶解；
[0070]將66.4mL的0.5mM/mL苯丙氨酸懸浮液和66.4mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu的摩爾比為1.2:1.2:1，室溫反應8~10小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0071]5、合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu
[0072]該步驟與實施例1相同。
[0073]6、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH
[0074]將56mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和56mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2:1.2，室溫攪拌反應10~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0075]7、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp
[0076]將Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH 置於 500mL 反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒，室溫攪拌，加入2.94g對硝基苯酚，再加入4.04g的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.2:1.2，室溫反應15~17小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0077]8、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0078]將步驟7所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃,室溫攪拌至完全溶解；
[0079]將42.3mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和42.3mL的0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2:1.2,室溫攪拌反應10~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0080]其他步驟與實施例1相同。合成成序列為NH2_Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。
[0081]實施例3
[0082]以所用原料Fmoc-Tyr (tbu)-COOH的摩爾量為30mM合成成骨生長肽碳端五肽為例，其合成方法如下:
[0083]1、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu
[0084]將13.78g 的 Fmoc-Tyr (tbu) -COOH 置於 500mL 反應瓶中，加入 140mL 的 1，4- 二氧六環(即每克Fmoc-Tyr (tbu)-COOH加入IOmLl, 4- 二氧六環)室溫攪拌,加入6.21g氮羥基丁二醯亞胺，再加入12.37g 二環己基碳二亞胺,攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-COOH與氮輕基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.8:2，室溫反應10~12小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0085]2、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH
[0086]將108mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和120mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中,Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.8:2，室溫攪拌反應5~8小時，減壓蒸除二氧六環，加5倍混合液體積的乙醚，攪拌。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0087]3、Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 活化
[0088]將Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 加入IOml乙酸乙酯，室溫攪拌，加入5.73g氮羥基丁二醯亞胺，再加入11.42g 二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.8:2，室溫反應12~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0089]4、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH
[0090]將步驟3所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu加入IOmL四氫呋喃，室溫攪拌，至完全溶解；
[0091]將99.6mL的0.5mM/mL苯丙氨酸懸浮液和110.6mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu的摩爾比為1.8:2:1，室溫反應8~10小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0092]5、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-COOSu
[0093]該步驟與實施例1相同。
[0094]6、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH
[0095]將84mL的0.5mM/mL甘氨酸水溶液和93.3mL的0.5mM/mL碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.8:2，室溫攪拌反應10~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0096]7、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp
[0097]將 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH 置於 500mL 反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒，室溫攪拌，加入4.41g對硝基苯酚，再加入6.73g的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.8:2，室溫反應15~17小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0098]8、合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH
[0099]將步驟7所得的產物置於500mL反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃,室溫攪拌至完全溶解；
[0100]將63.4mL的0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和70.5mL的0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.8:2，室溫攪拌反應10~15小時。該步驟中的其他步驟與實施例1相同。
[0101]其他步驟與實施例1相同。合成成序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。
[0102]實施例4
[0103]在以上的實施例1~3的Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH活化步驟3中，所用的氮羥基丁二醯亞胺用等摩爾的對硝基苯酚替換，該步驟的其他步驟與相應的實施例相同。得 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp。在合成 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-OH 步驟 4 中，所用的Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu用等摩爾的Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-ONp替換，該步驟的其他步驟與相應的實施例相同。得Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-OH。
[0104]其他步驟與相應的實施例相同。合成序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。
[0105]為了驗證本發明的有益效果，發明人對實施例1合成的序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽採用液相色譜儀測定純度，見圖1，純度為93.04%,並採用質譜儀測定其結構，見圖2，所合成的序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽的分子量及分子尚子峰與相應的分子量以及分子離子峰一致。
【權利要求】
1.一種成骨生長肽碳端五肽的合成方法，由下述步驟組成:
⑴合成 Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu 將 Fmoc-Tyr (tbu)-COOH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu)-COOH 加入IOmLl, 4- 二氧六環，室溫攪拌，加入氮羥基丁二醯亞胺，再加入二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-COOH與氮羥基丁二醯亞胺、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應10~12小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液為溶有Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu 的 1，4- 二氧六環溶液；
⑵合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到 Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu 的 1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu 與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫攪拌反應5~8小時，減壓蒸除二氧六環，加I~5倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質量分數為10%的檸檬酸水溶液調pH至2~3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空乾燥箱內40 °C以下乾燥,得Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH ；
⑶ Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 活化 將 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH 加入 10mT,乙酸乙酯，室溫攪拌，加入氮羥基丁二醯亞胺或對硝基苯酚，再加入二環己基碳二亞胺，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-OH與氮羥基丁二醯亞胺或對硝基苯酚、二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應12~15小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液減壓濃縮至幹，得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-COOSu 或 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-ONp ；
⑷合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH 將步驟(3)所得的產物置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp加入IOmL四氫呋喃,室溫攪拌,至完全溶解； 將0.5mM/mL的苯丙氨酸懸浮液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合,混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-COOSu 或 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-ONp 的摩爾比為 1.2 ~1.8:1.2~2:1，室溫攪拌反應8~10小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調PH至2~3，有白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH ；
(5)合成Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-COOSu 將 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH 置於反應瓶中，按每克 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-OH加入IOmLl, 4- 二氧六環，採用步驟(1)的反應條件進行化學反應，得到溶有Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-COOSu 的 1，4- 二氧六環溶液；
(6)合成Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH 將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2,室溫攪拌反應10~15小時，減壓蒸除二氧六環，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH為2~.3，加乙酸乙酯萃取，分離有機相，有機相依次用水、質量濃度為26.5%氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷與乙醚體積比為1:3的混合液40KHZ超聲洗滌三次，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得到 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH 純品；
(7)合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp 將Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒，室溫攪拌，加入對硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)~碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2，室溫反應15~17小時，水洗滌除去鹽，有機相減壓濃縮至幹，得 Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp ；
⑶合成 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 將步驟(7)所得的產物置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃,室溫攪拌至完全溶解； 將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp 的四氫呋喃溶液中，Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.2~1.8:1.2~2,室溫攪拌反應10~15小時,減壓蒸除四氫呋喃，用質量分數為10%檸檬酸溶液調pH至2~3，白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空乾燥箱內4011C以下乾燥,得Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色譜分離，用乙酸乙酯衝洗雜質，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為1:3的混合液衝洗目標物，收集，減壓蒸乾，得到 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 純品；
⑶合成 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH 在每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mT,哌唳與1，4_ 二氧六環體積比為1:9的混合液，室溫反應30分鐘，減壓蒸乾，用水溶解，用二氯甲烷萃除雜質，水相減壓濃縮至幹，得 NH2-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-Gly-OH ；
(10)合成 NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH 在每克NH2-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入IOmL體積分數為95%的三氟乙酸水溶液，室溫反應10分鐘，減壓濃縮，加濃縮體積7倍量的冷凍乙醚，攪拌，離心，分離出上清液，固體經真空乾燥箱內40°C以下乾燥,得NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，經反相色譜法純化、濃縮、凍幹得純度大於93%的序列為NH2-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。
2.按照權利要求1所述的成骨生長肽碳端五肽的合成方法，其特徵在於:在合成Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-OH步驟(2)中，將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr (tbu)-COOSu的1，4- 二氧六環溶液中，Fmoc-Tyr (tbu) -COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5,室溫攪拌反應5~8小時，減壓蒸除二氧六環，加3倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質量分數為10%的檸檬酸水溶液調PH至2~3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空乾燥箱內40°C以下乾燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH。
3.按照權利要求1所述的成骨生長肽碳端五肽的合成方法，其特徵在於:在合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp 步驟(7)中，將 Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH 置於反應瓶中，按每克Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL 二氯甲燒，室溫攪拌，加入對硝基苯酚，再加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，Fmoc-Tyr (tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫反應15~17小時，水洗除去鹽，有機相減壓濃縮至幹， 得 Fmoc-Tyr (tbu) -Gly-Phe-Gly-ONp。
【文檔編號】C07K7/06GK103665109SQ201310578687
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】張騰, 張忠旗, 宋衛, 馮凌雲, 楊小琳, 趙金禮 申請人:陝西東大生化科技有限責任公司