一種提高百合多糖活性的酶法修飾製備方法
2023-06-04 22:25:11
一種提高百合多糖活性的酶法修飾製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高百合多糖活性的生物修飾製備方法，屬於農產品功能成分製備【技術領域】。採用複合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法對百合多糖(403.3kDa)進行生物修飾(即酶法可控降解)。修飾後經分離純化，產物百合多糖的分子量為8.0kDa～70.0kDa。採用體外巨噬細胞RAW264.7模型研究百合多糖及其修飾產物體外免疫調節活性。修飾後的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對巨噬細胞增殖活性增加40.5～77.2％。百合多糖的分子量過高或過低，其活性都較低。本發明創立了提高百合多糖免疫活性的方法，生物修飾後的百合多糖在醫藥和功能食品領域更具應用價值。
【專利說明】一種提高百合多糖活性的酶法修飾製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於農產品功能成分製備【技術領域】，涉及一種提高百合多糖活性的生物修飾製備方法。
【背景技術】
[0002]百合是國家衛生部審批通過的首批藥食兩用品之一，不僅在臨床上有著廣泛的應用，而且還具有很好的保健作用，百合多糖是百合的主要功能因子之一。研究表明百合多糖具有增強免疫，抗腫瘤等生物活性。通過超聲波輔助熱水浸提法，我們從百合中提取一種百合多糖，分子量為403.3kDa，主要由甘露糖、葡萄糖按1:1的摩爾比通過β _1，4糖苷鍵組成(含有少量I —2或1 — 6鍵型)，還含有微量的阿拉伯糖和少量硫酸基團。採用體外巨噬細胞RAW264.7模型研究百合多糖免疫調節活性，發現該百合多糖活性較低，主要原因可能是其分子量過大，粘度較高所致。因此，通過對百合多糖化合物結構進行改造，降低分子量，尋找活性更強的百合多糖修飾產物的研究具有重要意義。
[0003]對於化合物的分子修飾，可採用物理、化學或生物(酶法)。相對於物理或化學方法，採用酶法對百合多糖進行降解具有專一性強，反應可控，產物分子量分散度小等優點。β -甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，以內切方式降解β -1，4糖苷鍵，降解產物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及甘露聚糖。葡聚糖酶能專一性作用於葡聚糖的β_1，4和β_1，3糖苷鍵產生低聚糖。但是，我們前期的實驗表明兩種酶單獨作用於百合多糖時效率較低。因為兩種酶有著相似的最適作用溫度和ΡΗ，因此我們將兩種酶以一定的用量比複合應用於百合多糖的降解，獲得較好的作用效果O
[0004]本發明採用複合酶(β_甘露聚糖酶和β_葡聚糖酶)法對百合多糖進行可控降解修飾，通過反應條件控制，以期獲得系列高活性的百合多糖修飾產物。
【發明內容】
[0005]技術問題
[0006]本發明的目的在於針對百合多糖活性低的問題，提供一種提高百合多糖活性的生物修飾製備方法。
[0007]技術方案
[0008]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
[0009]採用複合酶(β -甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法對百合多糖(403.3kDa)進行生物修飾，酶作用條件為:底物百合多糖濃度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶濃度500?900U/L, β-葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS緩衝液);溫度40?55°C ;時間0.5?
1.0h。
[0010]反應結束後去除酶及產物分離製備方法為:反應結束後，將溶液加熱至100°C，保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物，百合多糖修飾產物的分子量是8.0kDa?70.0kDa0
[0011]採用體外巨噬細胞RAW264.7模型研究百合多糖及修飾產物體外免疫調節活性，修飾後的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對巨噬細胞增殖活性增加40.5?77.2%。
[0012]本發明技術與產品具有如下的有益效果:採用酶法對百合多糖進行降解修飾具有專一性強，反應可控，產物分子量分散度小等優點；通過可控降解修飾，修飾產物的免疫活性明顯提高，生物修飾後的百合多糖可廣泛應用於醫藥和功能食品領域。
【具體實施方式】
[0013]研究中所用的酶活力及生產公司如下甘露聚糖酶(10000U/g)，禾本生物工程有限公司；β-葡聚糖酶(50000U/g)，上海工碩生物技術有限公司。
[0014]實施例1
[0015]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度500U/L，β-葡聚糖酶250U/L;pH5.5(PBS緩衝液)；溫度40°C;時間0.5h。反應結束後，將溶液加熱至100 °C,保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:70.0kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加40.5%。
[0016]實施例2
[0017]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度35/L ；β-甘露聚糖酶濃度600U/ L，β-葡聚糖酶300U/L;pH6.0(PBS緩衝液)；溫度45°C;時間40min。反應結束後，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:50.3kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加45.2%。
[0018]實施例3
[0019]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度40/L ；β-甘露聚糖酶濃度700U/L，β-葡聚糖酶350U/L;pH6.5(PBS緩衝液)；溫度45°C;時間50min。反應結束後，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:40.5kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加55.0%。
[0020]實施例4
[0021]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度35/L ；β-甘露聚糖酶濃度800U/L，β-葡聚糖酶400U/L;pH6.0(PBS緩衝液)；溫度50°C:時間45min。反應結束後，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:30.5kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加77.2%。[0022]實施例5
[0023]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度850U/L，β-葡聚糖酶425U/L;pH6.5(PBS緩衝液)；溫度50°C;時間50min。反應結束後，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:18.3kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加60.8%。
[0024]實施例6
[0025]按下列條件及操作利用複合酶對百合多糖進行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度900U/L，β-葡聚糖酶450U/L ;pH6.5 (PBS緩衝液)；溫度55°C;時間Ih。反應結束後，將溶液加熱至100°C，保溫5min，而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物(分子量:8.0kDa)，與底物百合多糖相比，對巨噬細 胞增殖活性增加50.8%。
【權利要求】
1.一種提高百合多糖活性的生物修飾製備方法，其特徵在於採用複合酶(β-甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法對百合多糖(403.3kDa)進行生物修飾(即酶法可控降解)，通過反應條件控制，獲得系列高免疫活性百合多糖修飾產物。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於複合酶的作用條件為:底物百合多糖濃度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶濃度500?900U/L，β -葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS緩衝液);溫度40?550C ;時間0.5?1.0h。
3.根據權利要求1?2所述的方法，在複合酶中，β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶用量比為 2:1 (U/U)。
4.根據權利要求1?3所述的方法，其特徵在於反應結束後去除酶及產物分離製備方法為:反應結束後，將溶液加熱至100°C，保溫5min，而後離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內透析(4°C，12h)，透析結束後將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍乾燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產物，百合多糖修飾產物的分子量範圍是8.0kDa?70.0kDa0
5.根據權利要求1?4所述的方法，其特徵在於採用體外巨噬細胞RAW264.7模型研究百合多糖及修飾產物體外免疫調節活性，修飾後的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對巨噬細胞增殖活性增加40.5?77.2%。百合多糖的分子量過高或過低，其活性都較低。
6.根據權利要求1?5所述的方法，其特徵在於百合多糖、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶，pH，溫度及作用時間優選組合為35g/L、800U/L和400U/L、6.0 (PBS緩衝液)、50°C和45min。在此作用條件下，百合多糖修飾產物的分子量為30.5kDa。與底物百合多糖相比，對巨噬細胞增殖活性增加77.2%。
【文檔編號】C12P19/14GK103436571SQ201310404673
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】陳志剛, 張丹妮, 王芬, 郭曉玉 申請人:南京農業大學