一種以植物表皮作為組織工程支架材料的細胞培養方法與流程

2023-06-04 23:20:36

本發明屬於細胞培養技術領域，具體涉及一種以植物表皮作為組織工程支架材料的細胞培養方法。

背景技術：

組織工程材料是組織工程的基礎，構建組織工程的支架材料可以為細胞提供增殖和分化的基礎，支架材料的特性決定了構建成的組織的形態。近年來，人們一直在尋找具有良好生物相容性、機械性能較好、透光性強的適合作為構建組織工程角膜的支架材料。目前使用的支架材料主要有生物、人工合成、複合材料，另外還有免支架的培養方法。使用最成熟的材料為羊膜，但羊膜的使用存在處理不當和傳播疾病的風險；膠原是應用眼表重建的天然可降解材料，但其穩定性差、降解快限制了它的發展；殼聚糖是另一種天然支架材料，由於殼聚糖大分子具有穩定的環狀結構，存在較強的氫鍵相互作用，溶解性差，所以在組織工程支架材料中應用也較少。人工合成的高分子材料如聚乳酸(pla)和聚羥基乙酸(pga)具有良好的生物相容性，可以發生非酶性水解，但是親水性較差，體內代謝過程不完全清楚，可引起炎症反應、局部酸性產物堆積等，要作為組織工程角膜的支架材料，還需要深入研究。總之，目前的生物材料組織相容性好，但是可塑性不佳；人工合成材料的機械性能好，但會有細胞毒性；複合材料集合了生物材料和人工合成材料的優點，但其產生的新特性尚需進一步研究。

技術實現要素：

本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，提供了一種以植物表皮作為組織工程支架材料的細胞培養方法。

本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：

一種以植物表皮作為組織工程支架材料的細胞培養方法，從植物上分離出膜狀的具有單層細胞結構的植物表皮，將細胞接種於鋪展開的該植物表皮上進行培養。所述植物表皮可以來源於多種植物，只要易於分離成單層細胞結構的膜狀，且具有一定的物理強度及韌性，符合組織工程材料的要求即可。例如百合科蔥屬植物，多具有鱗莖，如洋蔥、大蔥等，較易分離得到符合要求的表皮。

一實施例中：從植物上分離出膜狀的具有單層細胞結構的植物表皮，消毒滅菌；然後將植物表皮鋪展固定在已去除了膜的細胞培養小室底部，得到植物表皮支架；將細胞接種於該植物表皮支架上進行培養。

一實施例中：將所述植物表皮支架置於培養基中，將細胞接種於該植物表皮支架上，進行培養；在細胞融合率小於100％時，採用浸沒培養法，每隔1～3天換液；當細胞融合率至100％時，改用氣液界面培養法培養。

一實施例中：所述氣液界面培養法為：將植物表皮支架置於培養孔板中，在每個植物表皮支架中加入培養基，另在培養孔板中每孔加入培養基，並使植物表皮處於氣液界面處；每隔1～3天換液。

一實施例中：所述細胞接種量為3～8×104個/cm2。

一實施例中：所述細胞為角膜上皮細胞。

一實施例中：所述角膜上皮細胞為原代角膜上皮細胞，其製備方法如下：

a)衝洗乾淨待取材的動物結膜囊，取角膜，漂洗後放入培養基中；除去角膜上帶有的結膜及鞏膜部分；

b)將步驟a)得到的角膜浸沒於含有1.5～2.5mg/mldispaseii的培養基中，0～5℃下消化12～18h，以分離出角膜上皮片；

c)消化結束後，分離角膜上皮片，並將其用0.2～0.3％胰酶在35～38℃消化10～25min，終止消化，混合均勻，離心，去除上清，沉澱用培養基混合均勻，得到角膜上皮細胞液，用於接種在所述植物表皮支架上。

一實施例中：所述培養基為shem培養基。

一實施例中：所述植物表皮為洋蔥鱗莖內表皮。

一實施例中：所述細胞為原代角膜基質細胞、乳腺癌細胞、小鼠成纖維細胞、人角膜上皮細胞系、人臍靜脈內皮細胞系。

本發明的方法應在嚴格的無菌條件下進行。

本技術方案與背景技術相比，它具有如下優點：

1.從植物上分離得到的膜狀的具有單層細胞結構的植物表皮是一層輕薄半透明的膜，僅一層細胞結構，由短而結實的細胞緊緻地排列在晶格中形成，以洋蔥鱗莖內表皮為例，通過撕取即可獲得，容易分離得到。將洋蔥鱗莖內表皮等植物表皮作為組織工程的支架材料，具有無毒、免疫原性小，生物相容性好，透明度高，具有一定的機械強度，可塑性好，價格低廉，易取材等優點。

2.本發明的方法尤其適合用於組織工程，首先，植物表皮材料具有一定的物理強度及韌性，有利於各種類型細胞(如原代角膜上皮細胞、原代角膜基質細胞、人角膜上皮細胞系等)在上面的培養，細胞在植物表皮上的增殖速度與在現有材料上的增殖速度相近。其次在培養細胞層面上，不僅適用各種類型細胞，更有利於上皮細胞復層化的生長，形成的上皮樣結構細胞排列緊密，說明洋蔥鱗莖內表皮等植物表皮能夠為細胞提供良好的增殖和分化基礎，為構建組織工程角膜奠定基礎。最後，以洋蔥鱗莖內表皮為例，其厚度為20～30μm左右，作為組織工程角膜上皮重建的支架材料，其透明性較好，可用於眼表重建的動物實驗。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

圖1為本發明的洋蔥表皮支架製備過程示意圖。

圖2為本發明的洋蔥表皮支架在乾濕兩種狀態下的透明度示意圖。

圖3為本發明實施例1中兔原代角膜上皮細胞在洋蔥表皮支架和pet兩種載體上不同培養時間的細胞增殖情況示意圖。

圖4為本發明實施例1中兔原代角膜上皮細胞在洋蔥表皮支架和pet兩種載體上的生長情況比較示意圖，採用掃描電鏡(sem)拍攝。

圖5為本發明實施例1中兔原代角膜上皮細胞在洋蔥表皮支架和pet兩種載體上用氣液界面培養5天後的he染色示意圖。

圖6為本發明實施例2和實施例3中在洋蔥表皮支架和普通培養皿上的細胞培養情況對比示意圖。

圖7為本發明實施例4至5中不同類型、不同種屬來源的細胞在洋蔥表皮支架和普通培養皿上的細胞生長情況對比示意圖。

具體實施方式

下面通過實施例具體說明本發明的內容：

實施例1：兔原代角膜上皮細胞培養

本實施例之中，採用的培養基及試劑如下：

shem培養基：在dmem/f12培養基500ml中加入5％fbs(胎牛血清)，0.5g/ml氫化可的松，1％its(胰島素、轉鐵蛋白和硒溶液)，0.5％dmso(二甲基亞碸)，10ng/mlhumanegf(人表皮生長因子)，1％ps(p即penicillin青黴素，s即streptomycin鏈黴素，青黴素和鏈黴素各自濃度為1％)。

dispase(中性蛋白酶)ii消化液：市售，工作濃度2u/ml。

10×pbs：nacl20g，kcl2g，na2hpo4·12h2o18.2g，kh2po42.4g，攪拌器攪拌均勻後，調節ph至7.2～7.4，稀釋成1×pbs滅菌後使用。

本實施例之中，選用洋蔥鱗莖內表皮，以洋蔥鱗莖內表皮作為支架材料的兔原代角膜上皮細胞培養方法如下：

1)如圖1a所示，首先將洋蔥外表幹的部分剝離捨棄，留下新鮮部分；然後在超淨工作檯上，用手術刀片將洋蔥鱗莖分成如圖1b的塊狀結構；如圖1c用鑷子輕輕挑起一邊，將鱗莖內表皮剝離下來，在10cm2的培養皿中(如圖1d)用75％酒精浸泡過夜做消毒滅菌處理；然後選用市售細胞培養小室(millipore公司的millicellhangingcellcultureinsert,polyethyleneterephthalate,1.0μm)，去除原有的polyethyleneterephthalate(聚對苯二甲酸乙二醇酯)膜，將消毒滅菌後的洋蔥鱗莖內表皮鋪展在小室底部(代替原有的聚對苯二甲酸乙二醇酯膜)，周邊用矽膠環固定好，得到如圖1e和圖1f所述的洋蔥表皮支架；洋蔥表皮支架在乾濕兩種狀態下的透明度如圖2所示。

2)兔子處死後，眼周局部碘伏充分消毒，嚴格進行無菌操作；予以含5％ps的1×pbs溶液衝洗結膜囊3次，用眼科剪剪取角膜，迅速放入含5％ps的1×pbs溶液中快速漂洗，然後放入含5％ps的shem培養基中；在無菌超淨臺中顯微鏡下，用眼科剪剪去角膜上帶有的結膜及鞏膜部分，操作過程中應儘量避免觸碰角膜緣上皮，減少對幹細胞的損傷；

3)將步驟2)得到的兔角膜浸沒於含有2mg/mldispaseii消化液、1％ps的shem培養基中，封口膜密封培養皿，4℃下消化14～16h，以分離出角膜上皮片；

4)消化結束後，無菌條件下分離角膜上皮片，並將其置於0.25％tripsin(胰酶)-edta中，37℃消化15～20min，隨後用血清終止消化，吹打混合均勻後離心，去除上清，沉澱再加shem培養基吹打混合均勻，得到角膜上皮細胞液；

5)將步驟4)得到的角膜上皮細胞液按照4～8×104個/cm2接種於步驟1)得到的洋蔥表皮支架上，進行培養；

6)在細胞培養初期即細胞融合率小於100％時，採用浸沒培養法，每隔2天換液；當細胞生長至完全融合狀態即融合率至100％時，改用氣液界面培養法(air-lifting)以促使角膜上皮細胞復層化生長。其中，氣液界面培養法為：將洋蔥表皮支架置於12孔培養板中，在每個洋蔥表皮支架中加入50μlshem培養基，另在12孔培養板中每孔加入1mlshem培養基，並使洋蔥表皮支架內的洋蔥鱗莖內表皮處於氣液界面處(即洋蔥鱗莖內表皮與洋蔥表皮支架外的培養板孔內培養基的液面齊平)；每天換液，繼續培養3～5天左右。

培養過程中利用相差顯微鏡對細胞形態進行觀察拍照，詳細記錄細胞生長過程。同時以同樣品牌和型號但未去除聚對苯二甲酸乙二醇酯膜的細胞培養小室(pet組)以及普通培養皿作為對照。

如圖3所示，為本實施例中兔原代角膜上皮細胞在洋蔥表皮支架和pet兩種載體上不同培養時間的細胞增殖情況示意圖。前三天，洋蔥表皮組與pet組的細胞基本完全貼壁生長，因pet組中的細胞培養小室已被廣泛應用於共培養實驗、趨化實驗、細胞遷移、細胞侵襲以及藥物轉運實驗等，其內的pet(聚對苯二甲酸乙二醇酯)膜是一種已廣泛用於細胞的不同條件培養的高分子聚合材料，其表面已經過很好的處理，所以就貼壁率而言pet組相對較好，但在5天時洋蔥表皮組的細胞增殖速度與pet組相比更快。

如圖4所示，待細胞融合率達到90％～100％時，掃描電鏡下觀察洋蔥內表皮組與pet組兩種載體上兔角膜上皮細胞生長情況。從形態上看，從圖中可以看出在洋蔥內表皮上生長的細胞立體感及細胞形態較pet膜上細胞更好，在pet膜上的細胞鋪的比較平；從微觀形態上看，可以看出在洋蔥內表皮上生長的兔角膜上皮細胞的微絨毛數量明顯多於pet膜上細胞形成的，且微絨毛排列更好。細胞表面微絨毛的主要作用是通過增大細胞表面，擴大吸收面積，參與細胞的吸收功能。因此，可以說洋蔥內表皮組的細胞生長情況更好。

如圖5所示，洋蔥內表皮組與pet組均先採用浸沒培養法，待兔角膜上皮細胞長滿後再改用氣液界面培養法培養3～5天左右，收樣包埋，冷凍切片後蘇木素-伊紅染色(he)。從圖5中可以看出，在洋蔥鱗莖內表皮上形成的結構較貼近上皮樣結構，細胞排列緊密；而在pet膜上形成的結構相對較疏鬆，雖然也有細胞復層，但是效果不太理想。

實施例2：兔原代角膜基質細胞培養

本實施例之中，採用的培養基及培養條件如下：

培養基：dmem(basic)，10％fbs，1％ps；培養條件：37℃，5％co2培養箱。

本實施例之中，洋蔥表皮支架的製備方法同實施例1中步驟1)。

如圖6中左側所示，為本實施例中兔原代角膜基質細胞(rabbitcornealstromacellsp0)在洋蔥表皮支架和普通培養皿上的細胞培養情況對比示意圖。培養4～6d後，在洋蔥表皮上生長的原代兔角膜基質細胞可以很好的維持角膜基質細胞形態，與培養皿上的細胞相比形態上無明顯差別，但細胞融合率較大。

實施例3：乳腺癌細胞培養

本實施例之中，採用的培養基及培養條件如下：

培養基：dmem(basic)，10％fbs，1％ps；培養條件：37℃，5％co2培養箱。

本實施例之中，洋蔥表皮支架的製備方法同實施例1中步驟1)。

乳腺癌細胞mda-mb-231按照上述條件，採用常規細胞培養方法培養、消化後製得細胞懸液，然後以5～8×104個/cm2接種于洋蔥表皮支架上，按照實施例1中步驟6)的方法進行培養。同時以在普通培養皿中培養的細胞作為對照。

培養1～2天後，結果如圖6中右側所示，洋蔥表皮支架組與普通培養皿組相比，細胞形態並無改變，表明洋蔥表皮支架可以維持乳腺癌mda-mb-231的細胞基本形態，且在洋蔥內表皮上生長良好。

實施例4：小鼠成纖維細胞培養

本實施例之中，採用的培養基及培養條件如下：

培養基：dmem(basic)，10％fbs，1％ps；培養條件：37℃，5％co2培養箱。

本實施例之中，洋蔥表皮支架的製備方法同實施例1中步驟1)。

小鼠成纖維細胞3t3按照上述條件，採用常規細胞培養方法培養、消化後製得細胞懸液，然後以4～8×104個/cm2接種于洋蔥表皮支架上，按照實施例1中步驟6)的方法進行培養。同時以在普通培養皿中培養的細胞作為對照。

培養1～2天後，結果如圖7所示，小鼠成纖維細胞3t3能夠在洋蔥表皮支架上生長，且洋蔥表皮支架組與普通培養皿組相比，細胞形態、細胞貼壁率及細胞融合率基本無差別改變，生長良好。

實施例5：人角膜上皮細胞系培養

本實施例之中，採用的培養基及培養條件如下：

培養基：dmem-f12(gibco)，6％fbs，8ng/mlhegf，1％ps；培養條件：37℃，5％co2培養箱。

本實施例之中，洋蔥表皮支架的製備方法同實施例1中步驟1)。

人角膜上皮細胞系hce細胞按照上述條件，採用常規細胞培養方法培養、消化後製得細胞懸液，然後以3～6×104個/cm2接種于洋蔥表皮支架上，按照實施例1中步驟6)的方法進行培養。同時以在普通培養皿中培養的細胞作為對照。

培養1～2天後，結果如圖7所示，人角膜上皮細胞系hce細胞能夠在洋蔥表皮支架上生長，且洋蔥表皮支架組與普通培養皿組相比，細胞形態、細胞貼壁率及細胞融合率基本無差別改變，生長良好。

實施例6：人臍靜脈內皮細胞系培養

本實施例之中，採用的培養基及培養條件如下：

培養基：dmem-highglucose(gibco)，15％fbs，1％ps；培養條件：37℃，5％co2培養箱。

本實施例之中，洋蔥表皮支架的製備方法同實施例1中步驟1)。

人臍靜脈內皮細胞系huvec細胞按照上述條件，採用常規細胞培養方法培養、消化後製得細胞懸液，然後以3～6×104個/cm2接種于洋蔥表皮支架上，按照實施例1中步驟6)的方法進行培養。同時以在普通培養皿中培養的細胞作為對照。

培養1～2天後，結果如圖7所示，人臍靜脈內皮細胞系huvec細胞能夠在洋蔥表皮支架上生長，且洋蔥表皮支架組與普通培養皿組相比，細胞形態、細胞貼壁率及細胞融合率基本無差別改變，生長良好。

本發明實施例之中，僅以洋蔥鱗莖內表皮為代表，但並不以此為限。植物來源的表皮結構，如大蔥葉表皮、大蔥蔥段內表皮等，只要有一定的物理強度及韌性，符合組織工程材料的其他要求，均可作為一種新的組織工程材料用於細胞的培養及其他方面。

以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的範圍，即依本發明專利範圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的範圍內。