胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法

2023-06-05 10:12:56

胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法
【專利摘要】本發明提供了一種簡單靈敏的檢測胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲直接毒性影響的測定方法。該方法通過把殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白均勻地混入所建立的以花粉為基礎的飼料直接飼餵給龜紋瓢蟲，並以混入蛋白酶抑制劑E-64的飼料（225μg?E-64/g花粉）為陽性對照，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料為陰性對照，通過比較處理組和對照組瓢蟲生存率、發育歷期、體重和產卵量等重要生命指標評價殺蟲化合物的潛在毒性。採用本方法測定了龜紋瓢蟲對不同濃度E-64的生物學反應，龜紋瓢蟲的不同生命參數隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應關係，證明了該方法的有效性和靈敏性。
【專利說明】胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法。
【背景技術】
[0002]捕食性瓢蟲(Coleoptera:Coccinellidae)是多種作物如棉花、玉米、水稻、蔬菜等田間生態系統中常見的重要天敵昆蟲，在作物害蟲防治中發揮著重要的作用。因此，在殺蟲劑及轉基因植物環境安全影響研究中，該類天敵昆蟲一直備受關注。特別是近些年，轉基因抗蟲作物的廣泛種植，其可能對天敵昆蟲帶來的負面影響引起了相關科學家的廣泛關注。轉基因抗蟲作物如Bt作物對瓢蟲類天敵昆蟲的潛在影響也成為了轉基因抗蟲作物環境安全評價的一個重要內容(Duan et al., 2002;Lundgren and Wiedenmann, 2002;Baiet al.，2005;Schmidt et al., 2009;Li et al.，2010a，2011a，b;dlvarez-Alfageme etal., 2009, 2011;Porcar et al.，2010)。
[0003]龜紋瓢蟲(Propylea japonica Thunberg)是我國多種農業生態體系中十分常見的捕食性天敵昆蟲，其成蟲和幼蟲均可捕食蚜蟲、甲殼蟲、飛蝨、蟎類、螟蛾類幼蟲等害蟲。除了捕食害蟲，在作物開花期，其還有取食花粉的習性。這樣，在作物田龜紋瓢蟲可能通過取食獵物間接地暴露於殺蟲劑或轉基因抗蟲作物如Bt棉花表達的外源殺蟲蛋白；通過取食花粉而直接地暴露於這些殺蟲化合物。因此，該天敵昆蟲作為指示性生物已被廣泛用於殺蟲劑及轉基因抗蟲植物環境安全研究。然而，目前還沒有相對完善的可用於評價殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲直接毒性影響的技術體系。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種能簡單靈敏地檢測胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲直接毒性影響的生物測定方法。
[0005]本發明提供的胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法，通過把胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白均勻地混入龜紋瓢蟲飼料直接飼餵龜紋瓢蟲，通過直接觀察龜紋瓢蟲的生命指標評價胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響，所述龜紋瓢蟲飼料的主要成分為花粉。
[0006]所述花粉優選為油菜花粉，也可採用其它如玉米、水稻等花粉。
[0007]飼餵龜紋瓢蟲的飼餵體系優選為:在龜紋瓢蟲幼蟲每個齡期第一天僅提供花粉，之後採用花粉和大豆蚜混合飼料飼餵瓢蟲直至下一齡期，當瓢蟲孵化後，鑑定瓢蟲雌雄後配對，單對飼養，採用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂。
[0008]花粉直接撒於培養皿底部提供給瓢蟲，花粉如果是蜜蜂採集的顆粒狀花粉，需要粉碎。
[0009]大豆蚜提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合飼料中花粉和大豆蚜的都為足量供應。[0010]所述飼餵體系可以通過將1%瓊脂水溶液凝固後與飼料一起提供給瓢蟲，給瓢蟲提供水源。
[0011]優選地，選擇蛋白酶抑制劑E-64為陽性對照化合物，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料作為陰性對照處理。
[0012]陽性對照處理蛋白酶抑制劑E-64的用量可以為200-400 iig E_64/g花粉。優選為 225ii g E-64/g 花粉。
[0013]優選地，每個處理至少測試幼蟲45頭，成30對，飼料每天更換，測試在26土1°C，75±5%RH，光照16:8H的培養箱中進行，每天分早晚兩次觀測生命指標。
[0014]所述生命指標可以包括生存率、發育歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產卵量中的兩種或多種。
[0015]採用本方法測定了龜紋瓢蟲對不同濃度已知毒性化合物E-64的生物學反應，龜紋瓢蟲的不同生命參數隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應關係，證明了該方法的有效性和靈敏性。本發明所提供的方法簡單可行，能有效地測定不同胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對瓢蟲類天敵昆蟲的直接毒性影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.利用本發明提供的飼餵體系瓢蟲幼蟲在不同齡期取食花粉量的情況；
[0017]圖2.利用本發明提供的方法測得的取食含不同濃度蛋白酶抑制劑E-64飼料的龜紋瓢蟲生存曲線。
【具體實施方式】
[0018]本發明提供了一種簡單靈敏地檢測胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲直接毒性影響的測定方法。該方法通過把殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白均勻地混入所建立的以花粉為基礎的飼料直接飼餵給龜紋瓢蟲，並以混入蛋白酶抑制劑E-64的飼料(225iigE-64/g花粉)為陽性對照，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料為陰性對照，通過比較處理組和對照組瓢蟲生存率、發育歷期、體重和產卵量等重要生命指標評價殺蟲化合物的潛在毒性。採用本方法測定了龜紋瓢蟲對不同濃度E-64的生物學反應，龜紋瓢蟲的不同生命參數隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應關係，證明了該方法的有效性和靈敏性。本發明所提供的方法簡單可行，能有效地測定不同胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對瓢蟲類天敵昆蟲的直接毒性影響。
[0019]I毒性測定體系的構建
[0020]下面說明本發明提供的胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法的一種【具體實施方式】。
[0021]建立測定殺蟲化合物對受試昆蟲的直接毒性，首先需要一個合適的昆蟲飼料，通過該飼料把殺蟲化合物飼餵給受試昆蟲(Romeis et al., 2011 ;Li et al.，2013)。基於龜紋瓢蟲取食花粉的習性，發展了一個以油菜花粉為基礎的龜紋瓢蟲飼料。在該飼餵體系中，在龜紋瓢蟲幼蟲每個齡期第一天僅提供花粉，之後採用花粉和大豆蚜混合飼料飼餵瓢蟲直至下一齡期。當瓢蟲孵化後，鑑定瓢蟲雌雄後配對，單對飼養。採用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂。花粉提供方法為市售的顆粒狀油菜花粉先用研缽磨碎後，直接撒在培養皿底部；大豆蚜蟲提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成2cm的小段，直接置於培養皿中。花粉和大豆蚜都為足量提供。為給瓢蟲提供水源，1%的瓊脂熔解後，加入1.5ml的去蓋離心管，凝固後與飼料一起提供給瓢蟲。
[0022]基於所建立的瓢蟲飼餵體系，建立了殺蟲化合物對瓢蟲毒性影響的測定體系，測定體系包括以下處理:1)陰性對照處理:花粉中不添加受試化合物；2)花粉中按一定濃度(根據需要)均勻混入受試殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白；3)陽性對照:花粉中均勻混入E-64(濃度一般為200-400 ii g/g花粉)。初孵幼蟲單頭飼養於塑料培養皿中(6.0cm直徑，1.5cm高)，每個處理推薦至少測試45頭瓢蟲幼蟲。如果檢測殺蟲化合物對瓢蟲繁殖力的影響，新羽化的瓢蟲成蟲配對飼養於上述培養皿中，每個培養皿中放置3-5個摺疊紙條(IOcm長，Icm寬)作為瓢蟲產卵介質。每個處理至少測試30對瓢蟲。如上述方式提供瓢蟲幼蟲和成蟲飼料。飼料每天更換，保證測試化合物生物活性。試驗在26 土 1°C，75 土 5%RH，光照16: 8H的培養箱中進行。每天上午9點和下午9點觀察瓢蟲生長發育，記錄死亡率、生長曆期、新羽化成蟲體重和雌蟲產卵量等生命參數。獲得數據後，採用合適的生物統計方法分析比較處理組和陰性對照組瓢蟲不同生命參數的差異。
[0023]2以花粉為基礎的飼餵體系有效性驗證
[0024]2.1花粉攝入量測定
[0025]在本毒性測定體系中，油菜花粉作為殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白的載體，因此瓢蟲只有足量取食到花粉才能起到把受試化合物有效傳遞給瓢蟲的作用。為了驗證所建立的飼餵體系瓢蟲能夠取食到大量花粉以滿足把足量受試殺蟲化合物傳遞給瓢蟲的需要，開展了花粉取適量檢測試驗，實驗步驟為:1)採用上述方法飼餵瓢蟲幼蟲；2)在每個齡期瓢蟲幼蟲取食花粉I天后，收集10頭幼蟲；3)解剖幼蟲，取出瓢蟲幼蟲整個消化道；4)把瓢蟲消化道中的花粉粒均勻混入一定量品紅溶液中，提取一定量溶液，在解剖鏡下查花粉粒的數量，然後計算整個幼蟲消化道中的花粉粒數。再根據油菜花粉粒的平均幹質量9.Sng/粒，計算不同齡期幼蟲體內含油菜花粉量。
[0026]結果發現:龜紋瓢蟲幼蟲從I齡到4齡分別取食6.9± 1.1, 15.8±3.1，47.8±6.5andl55.7±15.9iig油菜花粉(圖1)。這說明通過該飼餵體系，龜紋瓢蟲能取食到大量花粉，這樣就可把足量的混入花粉的受試殺蟲化合物傳遞給瓢蟲。
[0027]2.2花粉飼料對瓢蟲生長發育的影響
[0028]在該毒性測定體系中，所採用的飼料必須能滿足所測定昆蟲基本的正常生長發育(一般要求存活率>80%) (Romeis et al.,2011;Li et al.，2013)。試驗檢測了毒性測定體系中所採用飼料對瓢蟲生長發育的影響。試驗設立兩個處理:1)瓢蟲從孵化到成蟲，持續取食大豆蚜；2)瓢蟲取食花粉和蚜蟲。花粉和蚜蟲供應方式如上述。每個處理測試75個蟲子。每天上午9點和下午9點觀察瓢蟲生長發育，記錄死亡率、生長曆期、新羽化成蟲體重和雌蟲產卵量等生命參數。試驗在26±1°C，75±5%RH，光照16:8H的培養箱中進行。
[0029]生物測定結果顯示:取食花粉和蚜蟲的瓢蟲幼蟲化蛹率達92%，羽化率達90%，與取食蚜蟲的瓢蟲組均無明顯差異(P>0.05)。同樣，羽化成蟲體重方面，兩個處理間也沒有顯著差異。然而，與持續取食蚜蟲的瓢蟲相比，取食花粉和蚜蟲的瓢蟲幼蟲發育歷期有所延長(P〈0.001)，而雌蟲產卵量顯著提高(P〈0.01)(表I)。結果說明，取食花粉和蚜蟲飼料，瓢蟲幼蟲歷期雖有所延長，但生存率(>80%)與持續取食蚜蟲的瓢蟲沒有差異，且取食該飼料的瓢蟲成蟲的繁殖力明顯增強。因此，所建立的瓢蟲飼餵體系適合用於殺蟲化合物對瓢蟲毒性影響的測定體系。
[0030]表1.取食不同飼料的瓢蟲生命表參數
[0031]
【權利要求】
1.胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響的測定方法，其特徵在於，通過把胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白均勻地混入龜紋瓢蟲飼料直接飼餵龜紋瓢蟲，通過直接觀察龜紋瓢蟲的生命指標評價胃毒性殺蟲劑或轉基因殺蟲蛋白對龜紋瓢蟲毒性影響，所述龜紋瓢蟲飼料的主要成分為花粉。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，所述花粉為油菜花粉。
3.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，飼餵龜紋瓢蟲的飼餵體系為:在龜紋瓢蟲幼蟲每個齡期第一天僅提供花粉，之後採用花粉和大豆蚜混合飼料飼餵瓢蟲直至下一齡期，當瓢蟲孵化後，鑑定瓢蟲雌雄後配對，單對飼養，採用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂。
4.根據權利要求3所述的測定方法，其特徵在於，花粉直接撒於培養皿底部提供給瓢蟲，大豆蚜提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合飼料中花粉和大豆蚜都為足量供應。
5.根據權利要求3所述的測定方法，其特徵在於，所述飼餵體系通過將1%瓊脂水溶液凝固後與飼料一起提供給瓢蟲，給瓢蟲提供水源。
6.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，在該測定方法中，選擇蛋白酶抑制劑E-64為陽性對照化合物，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料作為陰性對照處理。
7.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，陽性對照處理蛋白酶抑制劑E-64的用量為 200-400 u g E-64/g 花粉。
8.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，陽性對照化合物蛋白酶抑制劑E-64的用量為225 u g E-64/g花粉。
9.根據權利要求3所述的測定方法，其特徵在於，每個處理至少測試幼蟲45頭瓢蟲，成蟲至少30對，飼料每天更換，測試在26± I°C，75土5%RH，光照16: 8H的培養箱中進行，每天分早晚兩次觀測生命指標。
10.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於，所述生命指標包括生存率、發育歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產卵量中的兩種或多種。
【文檔編號】G01N33/00GK103609877SQ201310541170
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】李雲河, 張小潔, 彭於發 申請人:中國農業科學院植物保護研究所