一種培養動物細胞生產疫苗的方法
2023-06-18 20:02:46
專利名稱：一種培養動物細胞生產疫苗的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種培養動物細胞生產疫苗的方法，更具體的說是涉及一種通過片狀載體培養動物基質細胞生產疫苗的方法。
背景技術：
傳統的疫苗生產技術往往是通過接種雞胚或動物的方法來分離、製備病毒液，但該方法因個體和種屬差異，許多病毒難以找到合適的敏感動物，而且因個體差異大而影響結果的判定。隨著細胞培養技術的發展，目前絕大多數病毒均可有相應的敏感細胞，為病毒的增殖創造了條件，隨著細胞大規模培養技術的發展，只要有敏感的細胞，就可以進行大規模疫苗生產。目前，疫苗的生產主要是通過轉瓶工藝進行，但是該方法自動化程度低，勞動強度大，並因為轉瓶細胞培養環境的不可控性，導致細胞和疫苗質量不穩定，產品批次差異大； 另一方面，單個轉瓶能提供的細胞吸附生長面積有限，細胞密度只能達到1 5 X IO5Cells/ ml，產能低，同時要擴大生產規模只能通過增加轉瓶數量的方法，結果是車間規模、設備通入、人員等需求更大，勞動量更大。最近，開始採用生物反應器進行疫苗生產的研究，通過生物反應器控制細胞或病毒增殖的最適培養條件，且環境均一，從而提高細胞密度和病毒產量，減少批間差異；另一方面，培養過程自動化控制，生產工藝穩定，易於規模放大，降低成本，提高效率。
發明內容
為了克服上述現有疫苗的生產技術所存在的缺陷和不足，實現簡便、高效的生產疫苗的目的，發明人經過研究，提供了一種培養動物細胞生產疫苗的方法。具體來講，本發明的技術方案如下
一種培養動物細胞生產疫苗的方法，其包括以下步驟
(1)用片狀載體培養動物細胞；
(2)步驟(1)獲得的動物細胞上接種病毒；
(3)繼續培養動物細胞及病毒；
(4)收穫病毒液，或/和反覆凍融片狀載體及感染細胞，然後將全部收液混合成病毒懸液，製成疫苗。研究發現，採用片狀載體在生物反應器中培養易感細胞從而生產疫苗，可以獲得質量穩定的疫苗。其一是因為片狀載體為細胞生長及病毒繁殖提供了三維空間及更大的比表面積，細胞可以生長到更高的細胞密度；其二是採用生物反應器可以實現自動控制培養環境參數，從而使得細胞生長和病毒繁殖處於最佳的生產環境，極大地提高了病毒滴度，從而可保證疫苗產量更大和質量更穩定。上述的步驟(4)可以採用各種方法來製備疫苗。比如，病變型疫苗可以將所收穫的上清病毒液凍存於_20°C中，片狀載體及細胞_20°C反覆凍融2 3次，然後和上清病毒
3液混合製成病毒懸液，過濾，滅活，後製備疫苗；分泌型疫苗可以將所收穫的上清病毒懸液-20 0C凍存，檢驗合格後製備疫苗。本發明的片狀載體包括但不限於M、N、W、Z、星型、五角形、正方形、菱形等多邊形狀。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的步驟(1)用片狀載體培養細胞按以下方法進行在已經過滅菌和浸泡處理後的片狀載體上接種動物細胞，在培養條件溫度為37°c、pH值為6. 8 7. 6及DO (溶氧)為30 60%下培養細胞，片狀載體上的細胞量達到1 3 X 108cellS/g。片狀載體上接種動物細胞，在生物反應器控制培養條件下，檢測營養消耗，進行補液或換液處理，培養細胞達到1 3X108cellS/ g時，片狀載體上的細胞形成健康、緻密的單層，有利於病毒的吸附、感染並在細胞上實現增殖。過高的細胞密度容易導致營養供應不足，過低的細胞密度則無法實現片狀載體培養可實現高密度的優點，生產成本會增加。滅菌採用本領域通用的技術手段即可，比如將片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌。浸泡處理採用本領域通用的技術手段處理即可，比如將片狀載體首先用PBS緩衝液浸泡，排盡PBS後再用培養液浸泡。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的片狀載體上接種動物細胞，其接種量為0. 5 2X 107cells/g。接種量過高或過低在本發明的片狀載體上都不能獲得好的動物細胞培養效果。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的步驟(2)中，按病毒感染複數MOI為0. 001-0. 2的量接種病毒。在本文中，術語「病毒感染複數MOI 」是指每一個細胞上所感染病毒的數量。MOI=有感染力的病毒量/細胞總量。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的步驟(3)的繼續培養細胞及病毒的條件為溫度為30 37°C、pH值為6. 8 7. 8,DO為30 60%,以及病毒繁殖所需要的營養條件。根據接種的病毒，按照本領域現有技術提供其繁殖所需要的營養條件即可。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的步驟(4)中，病毒液直接收穫並於-20°C凍存；片狀載體及感染細胞於-20°C下反覆凍融2 3次，最終將病毒液或/和反覆凍融收液混合成病毒懸液，製成疫苗。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的培養動物細胞採用批式、流加、灌注或半連續的培養工藝。更優選地，所述培養細胞採用灌注培養方式。細胞灌注培養是指在細胞培養過程中，往生物反應器中不斷地流加新鮮培養液， 同時通過載體對細胞的吸附使得培養液不斷流出，帶走代謝副產物如乳酸，氨等，使其維持在低濃度水平，不會成為細胞生長的抑制因素，所以細胞可生長在良好的培養環境中，能獲得很高的細胞培養密度和產物生產速率。灌注培養具有反應器體積小，回收培養液上清體積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收產品至低溫下保存，有利於保持產品活性等顯著特點。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的動物細胞選自Marc-145細胞、MDCK細胞、ST細胞、BHK-21細胞或DF-I細胞等。作為優選方案，根據本發明所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其中所述的培養動物細胞生產疫苗的方法是在生物反應器中進行的。在本發明中，所採用的生物反應器包括但不限於激流式生物反應器、鼓泡式生物反應器、攪拌式生物反應器，氣升式生物反應器，wave生物反應器和中空纖維反應器等。生物反應器可以實現自動控制培養環境參數， 從而使得細胞生長和病毒繁殖處於最佳的生產環境，極大地提高了病毒滴度，從而可保證疫苗產量更大和質量更穩定。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施並不局限於下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護範圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例採用的方法為本領域通用技術。
培養液DMEM培養基(DMEM培養液)，GIBCO公司。實施例1 (IOL生物反應器培養Marc-145細胞製備藍耳病疫苗) 豬繁殖和呼吸症候群病毒CH-1R株。片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌後，首先用PBS浸泡，接著用PBS衝洗後，再用培養液過夜浸泡，備用。生物反應器中的片狀載體上接種1 X IO7個Marc-145細胞，於DO控制在30 60%， PH值維持在7. 0 7. 2，溫度37°C的條件下培養生長5 7天時間，期間檢測葡萄糖消化， 根據糖耗情況進行換液處理，以使糖量維持在日耗糖量為lg/L以上為準，隨著細胞密度的提高，日耗糖量逐漸增加直到達到2. 5g/L以上。排出培養液，用無菌PBS清洗兩次，按病毒感染複數MOI為0. 001-0. 01的量接種豬繁殖和呼吸症候群病毒。其中豬繁殖和呼吸症候群病毒PRRSV，無論是歐洲型還是美洲型，強毒株還是弱毒株，對Marc-145細胞或其他易感細胞普遍具有適應性和敏感性，所以本發明所述的方法適用於所有的PRRSV毒株。繼續培養所述的易感細胞Marc-145，採用流加培養方式，維持pH在7. 2-7. 4，D0維持在30 60%，溫度37°C，以及病毒繁殖所需要的營養條件。在病毒感染易感細胞一段時間 (10-20小時)後，可以採用流加培養方式往生物反應器中添加病毒維持液，或添加葡萄糖濃縮液，維持合適營養成分，30 40h後收穫細胞及病毒液。將所收穫的上清病毒液於-20°C 放置，片狀載體及細胞於_20°C反覆凍融2 3次，然後和上清病毒液混合製成病毒懸液，檢驗合格後凍幹製備獲得藍耳病疫苗。病毒滴度TCID50的測定按照常規方法進行。收穫階段收集的病毒液的病毒滴度與轉瓶培養工藝相比，提高了 1-2個TCID50/ml (即病毒滴度是轉瓶培養工藝的101—2倍)， 每次收穫體積是轉瓶10倍，病毒總產量是轉瓶工藝的100倍。經檢測，疫苗質量控制的結果符合中國藥典2005年版三部和中國生物製品規程 2000年版要求。將本實施例中的N型片狀載體替換為Μ、W、Ζ、星型、五角形、正方形或菱形等多邊形狀，也能實現同樣的技術效果，此處不再一一贅述。實施例2 (IOL生物反應器培養MDCK細胞製備禽流感疫苗)片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌後，首先用PBS浸泡，接著PBS衝洗後，再用培養液過夜浸泡，備用。生物反應器中的片狀載體上接種0.5 X IO7個MDCK細胞，DO控制在30 60%，pH 維持在7. 2 7. 4，溫度37°C。檢測葡萄糖消化，根據糖耗情況進行換液或補液處理，使糖量維持在lg/L以上，基本上5 7天時間，細胞密度達到最大值。排空培養液，無菌PBS清洗兩次，按病毒感染複數MOI為0. 01 0. 1接種H5W病毒。對MDCK細胞或其他易感細胞普遍具有適應性和敏感性的所有毒株，本發明的方法均適用。繼續培養所述的易感細胞MDCK，採用流加培養方式，維持pH在7. 3-7. 5，DO維持在30 60%，溫度37°C，以及病毒繁殖所需要的營養條件。在病毒感染易感細胞一段時間後，比如10-20小時後，可以採用流加培養方式往生物反應器中添加病毒維持液，或添加葡萄糖濃縮液，3 4天後收穫病毒液。將所收穫的上清病毒液放置於_20°C中，片狀載體及細胞於-20°C反覆凍融3次，然後和上清病毒液混合製成病毒懸液，過濾，滅活，乳化後製得禽流感疫苗。病毒血凝價的測定按照常規方法進行。收穫階段收集的病毒液的病毒HA與轉瓶工藝相比，提高了 4-8個HA，即病毒滴度是轉瓶培養工藝的22_3倍；病毒液的病毒HA與雞胚工藝相比，提高了 1-2個HA，即病毒滴度是雞胚培養工藝的21—2倍。經檢測，疫苗質量控制的結果符合中國藥典2005年版三部和中國生物製品規程 2000年版要求。將本實施例中的N型片狀載體替換為M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多邊形狀，也能實現同樣的技術效果，此處不再一一贅述。實施例3 (IOL生物反應器培養ST細胞製備豬瘟疫苗)
片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌後，首先用PBS浸泡，接著用PBS衝洗後，再用培養液過夜浸泡，備用。生物反應器中的片狀載體上接種2 X IO7個ST細胞，DO控制在30 60%，pH維持在7. 0 7. 2，溫度37°C。檢測葡萄糖消化，根據糖耗情況每2 3天全換液1次，使糖量維持在lg/L以上，5 7天達到最大細胞密度。排出全部培養液，無菌PBS清洗片狀載體及細胞兩次，以2 3%脾毒的濃度接種於ST細胞。對ST細胞或其他易感細胞普遍具有適應性和敏感性的所有毒株，本發明的方法均適用。繼續培養所述的ST細胞，採用流加培養，批次收穫的方式，維持pH在7. 2-7. 4，DO 維持在30 60%，溫度37°C，以及病毒繁殖所需要的營養條件。在病毒感染易感細胞後，每 12h檢測糖耗，可以採用流加培養方式往生物反應器中添加病毒維持液，或添加葡萄糖濃縮液，接毒後第5天開始收穫病毒液，以後每4天收穫一次。將所收穫的上清病毒液，凍幹後製得豬瘟疫苗。滴度的測定按照定型熱反應實驗方法進行。收穫階段收集的病毒液的病毒滴度與轉瓶培養工藝相比，轉瓶工藝最好情況能達到每毫升含病毒> 100，000個家兔感染量，片狀載體培養生產豬瘟疫苗可達到每毫升含病毒> 500, 000個家兔感染量，提高5倍以上。經檢測，疫苗質量控制的結果符合中國藥典2005年版三部和中國生物製品規程
62000年版要求。將本實施例中的N型片狀載體替換為M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多邊形狀，也能實現同樣的技術效果，此處不再一一贅述。實施例4 (IOL生物反應器培養BHK-21細胞製備狂犬疫苗)
片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌後，首先用PBS浸泡，接著用PBS衝洗後，再用培養液過夜浸泡，備用。生物反應器中的片狀載體上接種1 X IO7個BHK-21細胞，DO控制在30 60%，pH 維持在7. 0 7. 4，溫度37°C。檢測葡萄糖消化，根據糖耗情況換液或補液，使糖量維持在 lg/L以上，5 7天細胞密度達到最大。排出全部培養液，無菌PBS清洗片狀載體及細胞兩次，按病毒感染複數MOI為 0. 01-0. 2的量接種狂犬病毒。對BHK-21細胞或其他易感細胞普遍具有適應性和敏感性的所有毒株，本發明的方法均適用。繼續培養所述的BHK-21細胞，採用流加培養，批次收穫的方式，維持pH在 7. 2-7. 6，DO維持在30 60%，溫度35 36°C，以及病毒繁殖所需要的營養條件。在病毒感染易感細胞後，每12小時檢測一次培養液殘糖，可以採用流加培養方式往生物反應器中添加病毒維持液，或添加葡萄糖濃縮液，接毒後開始連續或分批收穫病毒液20天以上。將所收穫的上清病毒液滅活後製得狂犬疫苗。病毒滴度的測定按照常規方法進行，收穫階段收集的病毒液的病毒滴度與轉瓶培養工藝相比，提高了 1-2個LD50/ml (即病毒滴度是轉瓶培養工藝的101—2倍)，每次收穫體積是轉瓶10倍，病毒總產量是轉瓶工藝的100倍。經檢測，疫苗質量控制的結果符合中國藥典2005年版三部和中國生物製品規程 2000年版要求。將本實施例中的N型片狀載體替換為Μ、W、Ζ、星型、五角形、正方形或菱形等多邊形狀，也能實現同樣的技術效果，此處不再一一贅述。實施例5 (IOL生物反應器培養DF-I細胞製備法氏囊疫苗)
片狀載體經伽馬射線MkGy輻照殺菌後，首先用PBS浸泡，接著用PBS衝洗後，再用培養液過夜浸泡，備用。生物反應器中的片狀載體上接種1 X IO7個DF-I細胞，DO控制在30 60%，pH維持在7. O 7. 2，溫度37°C。檢測葡萄糖消化，根據糖耗情況換液或補加培養液，使糖量維持在lg/L以上，5 7天時間細胞密度達到最大。排出全部培養液，無菌PBS清洗片狀載體及細胞兩次，按病毒感染複數MOI為 0. 01-0. 1的量接種法氏囊病毒。繼續培養所述的DF-I細胞，採用流加培養，批次收穫的方式，維持pH在7. 2-7. 4， DO維持在30 60%，溫度37°C，以及病毒繁殖所需要的營養條件。在病毒感染易感細胞一段時間後，可以採用流加培養方式往生物反應器中添加病毒維持液，或添加葡萄糖濃縮液， 接毒後第3 4天收穫病毒液及細胞。將所收穫的全部收液混合成病毒懸液，放置於-20°C 中，檢驗合格後製得法氏囊疫苗。病毒滴度TCID50的測定按照常規方法進行。收穫階段收集的病毒液的病毒滴度與轉瓶培養工藝相比，提高了 1-2個TCID50/ml (即病毒滴度是轉瓶培養工藝的101—2倍)。
經檢測，疫苗質量控制的結果符合中國藥典2005年版三部和中國生物製品規程 2000年版要求。將本實施例中的N型片狀載體替換為M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多邊形狀，也能實現同樣的技術效果，此處不再一一贅述。儘管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對於本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者採用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用於對本發明技術方案的闡述和理解，並不能構成對本發明的限制。
權利要求
1.一種培養動物細胞生產疫苗的方法，其包括以下步驟(1)用片狀載體培養動物細胞；(2)步驟(1)獲得的動物細胞上接種病毒；(3)繼續培養動物細胞及病毒；(4)收穫病毒液，或/和反覆凍融片狀載體及感染細胞，然後將全部收液混合成病毒懸液，製成疫苗。
2.根據權利要求1所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的步驟(1) 用片狀載體培養細胞按以下方法進行在經過滅菌和浸泡處理後的片狀載體上接種動物細胞，在培養條件溫度為37°C、pH值為6. 8 7. 6及DO為30 60%下培養細胞，片狀載體上的細胞量達到1 3X 108cells/g。
3.根據權利要求2所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的片狀載體上接種動物細胞，其接種量為0. 5 2X107cellS/g。
4.根據權利要求1中所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的步驟(2)中，按病毒感染複數MOI為0.001-0. 2的量接種病毒。
5.根據權利要求1中所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的步驟(3)的繼續培養細胞及病毒的條件為溫度為30 37°C、pH值為6.8 7. 8、DO為30 60%,以及病毒繁殖所需要的營養條件。
6.根據權利要求1中所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的步驟(4)中，病毒液直接收穫並於-20°C凍存；片狀載體及感染細胞於-20°C下反覆凍融2 3 次，最終將病毒液和/或反覆凍融收液混合成病毒懸液，製成疫苗。
7.根據權利要求1所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的培養動物細胞採用批式、流加、灌注或半連續的培養工藝。
8.根據權利要求1所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的動物細胞選自Marc-145細胞、MDCK細胞、ST細胞、BHK-21細胞或DF-I細胞。
9.根據權利要求1所述的培養動物細胞生產疫苗的方法，其特徵在於所述的培養動物細胞生產疫苗的方法是在生物反應器中進行的。
全文摘要
本發明屬於疫苗製備領域，提供了一種在片狀載體培養動物細胞生產疫苗的方法，其包括通過在片狀載體上培養疫苗基質細胞，以一定濃度接種病毒，在生物反應器控制條件下繼續培養細胞及病毒，收穫病毒液，同時反覆凍融片狀載體及感染細胞，將全部收液混合成病毒懸液，製成疫苗。該方法應用片狀載體培養技術在生物反應器中培養動物細胞來生產疫苗，片狀載體為細胞生長及病毒繁殖提供三維空間及更大的比表面積，細胞實現更高的細胞密度，生物反應器控制培養條件等參數，可為細胞生長和病毒繁殖提供最佳生產環境，極大地提高病毒滴度，疫苗產量和質量都更穩定。
文檔編號A61K39/00GK102205116SQ20111007693
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者宋羚羚, 惠覓宙, 戚西京, 李巒峰, 杜春玲 申請人:杭州安普生物工程有限公司, 杭州安瑞普生物科技有限公司