一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型及構建方法
2023-06-19 01:50:16
專利名稱：一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型及構建方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質組學技術領域技，尤其涉及一種蛋白質組學技術領域，尤其涉及一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型及構建方法。
背景技術：
血清蛋白參與機體免疫、凝血、物質交換、運輸、代謝、生長信號調節等多種重要的生理功能，尤其是低豐度蛋白質的組成和數量變化往往受一些病理狀態的影響。血清蛋白質組學通過比較某種疾病血清中表達的全部蛋白質，尋找和鑑定有顯著差異的蛋白，進一步研究其結構和功能，為研究疾病致病機理、生物標記物、藥物作用靶點開闢新的途徑。相對和絕對定量同位素標記(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術可同時對八個樣本中的所有蛋白質進行精確鑑定、定量和比較。該試劑已被廣泛應用於生命科學的許多領域，包括生物標誌物的發現、信號轉導及翻譯後修飾研究、基因與蛋白質表達相關分析、細胞膜與亞細胞結構分析和藥物靶點分析等。
發明內容
本發明可以提供一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型和一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型的構建方法，為應用蛋白表達差異質譜技術，尋找血清生物標誌物提供新的途徑。本發明實施例是這樣實現的，一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型包括肺結核與健康對照組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白I3DLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD, IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOUl、TTHY、HBA、LDHB、TLNl、NPC2、TENA、HABP2、TRMLl、CAH2、ITBl、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下調蛋白PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRY1、CBG、LUM、IBPl、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRFE, LMAN2、NGAL, LCAT, IPSP, APOF, NRPl、GPV, K2C1、P0N3、AP0A1、PHLD、ICAM2、FAl1、ANAG, C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 構成。肺結核與肺炎組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNGl、PLSL、THBG、C05、A2AP、LUM、MASPl、LBP、HABP2、GPX3、HYOUl、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、NEO1、PPIA、GPV、CBG, C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QS0X1、TLNl、C08B、HRG, KAIN、LYSC, C02、GP1BA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF、NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB,CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、D0P0,CALR、ZYX、CRACl、S0DE、PTCDS、FA10、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、NOEl 和下調蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA、ALBU、IGHM、HBA、HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA、AP0L1、LCAT、KlClO、APOF、IBPl、PRDX2、ANAG、MAlAl、SEPPl、PODXL、SRCRL、PONl、CLUS、GGH、CXCL7構成。肺結核與肺癌組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白TAGL2、FLNA, TRMLU ALBU,PROFU SHBG, ZYX、PDLIU FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、DOPO,SODE, NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD, HYOUl、CHLl、C07、CD14 和下調蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLP1、PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、APOLl、PROS、MAlAl、IGHAl、ATRN、FCN2、COIAl、C1R、CATD,PCSK9、C0L11、LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP, HEP2、APOCl、K1C10、HGFL,SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、ICAMU TRYl 構成。肺結核與COPD組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA,FETUB、PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRIS 3、TLNl、PROP、GPV1、PDLI1、PPIA、FKB1A, CBG, GPlBA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Ζ、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下調蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP、C4BPB、SAA4、ADIPO、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT,FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF、C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA、FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRC1、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 構成。蛋白表達差異質譜由相對和絕對定量的同位素標記血清全蛋白，經串聯質譜分析檢測蛋白質譜，再通過軟體ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software統計分析報告離子的相對定量。在相對定量分析中，採用質荷比114報告離子峰面積，以質荷比113、115、116、117的報告離子峰為對照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值^ 1.25^0.8的結果進行報告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達上調，比值彡0. 8的為蛋白表達下調。本發明實施例的另一目 的在於提供一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型的構建方法，包括以下步驟分別採集活動性肺結核組、健康對照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標本，分別對血清進行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測定，將蛋白進行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記，得到相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記的肽段。再將多肽進行強陽離子交換和反向液相色譜分離，再進行串聯質譜鑑定和相對定量分析，得到活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型。串聯質譜鑑定過程中，採用噴霧電壓2. 2kV，MS掃描範圍400-1500U，MS/MS掃描範圍100-2000u,並增加20%碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的報告離子更易分離。一個譜圖選擇20個最強的母離子進行串級掃描。相對定量分析使用軟體為ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software。相對定量分析過程中設定蛋白置信度大於95 %或ProtScore (unused)大於1. 5。相對定量分析過程中，採用質荷比114報告離子峰面積，以質荷比113、115、116、117的報告離子峰為對照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值彡1. 25 ^ O. 8的結果進行報告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達上調，比值彡O. 8的為蛋白表達下調。根據分析報告，通過活動性肺結核組與健康對照組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與肺炎組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與肺癌組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與COPD組的蛋白表達差異質譜，建立活動性肺結核的表達差異質譜模型。上述得到的活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型，為應用相對和絕對定量的同位素標記血清全蛋白，經串聯質譜分析檢測蛋白質譜，提供了新的方案。本發明提供了一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型及構建方法，通過比較活動性肺結核組與健康對照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的蛋白質組學差異，獲得活動性肺結核的蛋白表達差異質譜。此外，本發明還涉及活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型構建的新方法，利用相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記及串聯質譜技術，能有效地對血清裡的蛋白進行鑑定和相對定量，採用該技術能獲得活動性肺結核病人血清中的蛋白表達差異質
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖
及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。血清蛋白質組學通過比較某種疾病血清中表達的全部蛋白質，尋找有顯著差異的蛋白，鑑定疾病相關蛋白質，並進一步研究其結構和功能，為研究疾病致病機理、生物標記物、藥物作用靶點開闢新的途徑。相對和絕對定量同位素標記技術，可同時對八個樣本中的所有蛋白質進行精確鑑定、定量和比較。該試劑已被廣泛應用於生命科學的許多領域，包括生物標誌物的發現、信號轉導及翻譯後修飾研究、基因與蛋白質表達相關分析、細胞膜與亞細胞結構分析和藥物祀點分析等。本實施提供了一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型的構建方法，具體步驟如下分別採集活動性肺結核組、健康對照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標本，分別對血清進行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測定，將蛋白進行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記，得到相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記的肽段。再將多肽進行強陽離子交換和反向液相色譜分離，再進行串聯質譜鑑定和相對定量分析，得到活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型。實施例1 :樣本的採集及資料整理肺結核病人清晨空腹抽血，抽取前臂靜脈全血5ml於一次性未經過抗凝處理的真空採血管，並在2-3小時內分離血清。不抗凝的血4°C、3000g/min離心IOmin取血清並分裝，置_80°C冰箱內保存。活動性肺結核組女5例，男5例，平均年齡37. 00±11. 85 ；健康對照組女5例，男5例，平均年齡36. 20±8. 44 ;肺炎組女6例，男4例，平均年齡40. 90±9. 28 ;肺癌組女2例，男8例，平均年齡57. 50±9. 36 ;C0PD組女4例，男6例，平均年齡59. 50±4. 70。標本採集經醫院倫理委員會批准和患者本人或家屬的知情同意。實施例2 :血清高豐度蛋白的去除用安捷倫多重親和去除系統Agilent multiple affinity removal LCcolumn-Human 14 (MARS)去除人血清中的高豐度蛋白。Buffer A與Buffer B為該柱子自帶緩衝液。血清混合物用Buffer A稀釋4倍，通過裝有O. 22um孔徑濾膜的離心管16000Xg離心Imin過濾去除顆粒雜質。以O. 125mL/min的速度進樣200ul稀釋的血清,紫外檢測波長為214nm/280nm，於5-7.5min收集流出的低豐度蛋白組分，儲存於-20°C。用100% BufferB以流速為1. OmL/min洗脫約5. 5min。再用100% Buffer A以1. OmL/min的流速平衡柱子9min。收集第一個峰(低豐度蛋白組分)，用Millipore的3K分子量截留超濾，去除洗脫液中的鹽成分。用Bradford法測定蛋白質濃度。實施例3 ITRAQ標記選用Applied Biosystem的ITRAQ試劑盒標記。取各組樣品各IOOug,每管加入預冷的丙酮(丙酮樣品體積比=5 I), -20°C沉澱lh。然後12000rpm離心15min,棄上清。用試劑盒中自帶的溶解液20uL溶解緩衝液(含有O. 5M TEABtriethylammoniumbicarbonate)和Iul變性劑(含有2% SDS)充分混懸溶解樣品。加入2ul還原試劑(含有 50mM TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine)，60°C還原 lh。再加入 Iul 半胱氨酸封閉試劑(含有 20mM MMTS s-methyl methanethiosulfonate),混合後室溫燒基化 IOmin 後，按照酶蛋白質=I 20的比例加入Trypsin酶(TPCK處理過的)，混合後37°C酶解過夜。將5種標記試劑離心，各加入異丙醇60uL混勻，加入各自對應樣品液中，混勻離心，室溫靜置2h。標記和樣品對應關係如下113-健康對照組，114-肺結核病組，115-大葉性肺炎組，116-肺癌組，117-C0PD組。合併各管標記好的樣品，真空冷凍乾燥。實施例4 2D LC-MS/MS 分析採用waters公司 的Sep-Pak Vac C18柱子脫鹽。即將標記過程中的標記試劑和相關buffer的鹽除去，以便 於後續分析。首先是100 %乙腈衝洗柱子3次，然後用0. 1%TFA (水溶)，衝洗柱子三次。用400uL O. 1% TFA溶解樣品，加載到柱子上，0. 1% TFA衝洗柱子3-5次後，用50%乙腈0.1% TFA 400uL洗脫下樣品。將樣品冷凍乾燥後進行後續分析。第一維強陽離子柱(SCX)分離所用的柱子為Polysulfoethyl column,
2.5u, 200A, The Nest Group, Inc. MA。流動相 A 液含 10mmol/LKH2P04 和 25%ACN(acetonitrile)，pH 2. 6 ；B 液含 lOmmol/L KH2P04、350mmol/L KCl 和 25 % ACN, pH2.6。混合樣品用陽離子交換加載緩衝液BuffferA SOuL溶解並上樣。設紫外檢測波長為214nm/280nm，流速為 200uL/min。線性梯度洗脫程序為5_40min，5% -25% B ;40_45min，25% -80% B ；45-50min,80% B ；50-60min,0% B。根據峰形和時間共收取20個梯度，真空離心濃縮(rotation vacuum concentrators, Christ RVC 2-25, Christ, Germany)後，每餾分用50uL反相液相色譜的A相溶解，進行第二維分析。第二維反相液質聯用RPLC-MS :流動相A液為5% (體積分數)ACN和0.1 %甲酸溶液，流動相B液為95% ACN和0.1 %甲酸溶液。第一維的每組餾分真空乾燥後，用反相液相色譜的A相溶解,通過QSTAR質譜儀(Applied Biosystem, USA)進行分析。肽段先經裝有反相分離柱 ZORBAX 300SB-C18 column (5 μ m, 300A, 0.1x 150mm, microm, USA)的反相
液相色譜RPLC (島津20AD)進行分離,色譜分離120min。流速為300nL/min。RPLC柱梯度洗脫程序為0-5min，上樣；5-90min,5% -35% B ；90-95min, 35% -80% B ；95-100min, 80%B ；100-105min,80% -5% B ；120min 停止。質譜鑑定納噴霧針直接連接於反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2. 2kV。MS掃描範圍400-1800u, MS/MS掃描範圍100_2000u，並增加20 %碰撞能量(collisionenergy)使iTRAQ的報告離子更易分離。一個譜圖選擇4個最強的母離子進行串級掃描。實施例5 :質譜數據分析通過ProteinPilot 3. O軟體檢索SwissProt資料庫，搜索參數為物種為H. sapiens,消化酶為trypsin,燒化劑為甲基甲燒巰基磺酸(MMTS, MethylMethanethiosulfonate),樣品採用iTRAQ標記賴氨酸和氨基末端。鑑定的原始結果經thePro Group Algorithm (Applied Biosystems)處理後導出。根據軟體對鑑定到的蛋白質打分，設定報告閾值。鑑定蛋白所採用的置信Cutoff值為 ProtScore (unused) >1. 5, Confidence Interval > 95 %,滿足 EF (error factor)< 2，且!) < 0.05。軟體依據同位素報告基團的相對含量進行蛋白質定量，選擇差異顯著(P ( O. 05)的結果報告。鑑定的蛋白比值彡1. 25或者< O. 8被認為存在表達差異。結果分析肺結核組與健康對照組的比較蛋白質組學與健康對照組相比，肺結核組有45個蛋白表達上調，見表I ;55個蛋白表達下調，見表2。表I肺結核組與健康對照組相比表達上調的蛋白質
權利要求
1.一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型，其特徵在於，該活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型包括 肺結核與健康對照組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白PDLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD、IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOU1、TTHY、HBA、LDHB、TLN1、NPC2、TENA、HABP2、TRML1、CAH2、ITB1、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下調蛋白 PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRYU CBG, LUM、IBP1、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRi7E、LMAN2、NGAL、LCAT、I PSP、APOF、NRP1、GPV、K2C1、PON 3、APOA1、PHLD、ICAM2、FA11、ANAG、C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 構成； 肺結核與肺炎組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNG1、PLSL、THBG、⑶5、A2AP、LUM、MASP1、LBP、HABP2、GPX3、HYOU1、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、ΝΕΟ1、PPIA、GPV、CBG、C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QSOXl、TLNl、C08B、HRG, ΚΑΙΝ、LYSC, C02、GPlBA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF, NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB, CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、DOPO, CALR、ZYX、CRACl、SODE、PTCDS、FAlO、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、ΝΟΕΙ 和下調蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA, ALBU, IGHM、HBA, HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA, AP0L1、LCAT,K1C10、AP0F、IBPl、PRDX2、ANAG, MAlAl、SEPPl、PODXL, SRCRL, PONl、CLUS、GGH、CXCL7 構成；肺結核與肺癌組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白TAGL2、FLNA, TRMLl、ALBU, PR0F1、SHBG, ZYX、PDLI K FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、D0P0, SODE,NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD,HY0U1、CHLl、C07、CD14 和下調蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLPI, PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、AP0L1、PROS、MAlAl、IGHAU ATRN, FCN2、C0IA1、C1R、CATD, PCSK9、C0L1U LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP、HEP2、APOC1、KICIO、HGFL、SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、I CAMl、TRYl 構成； 肺結核與COPD組的蛋白表達差異質譜，由上調蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA, FETUB,PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRI S3、TLN1、PROP、GPV1、PDL11、PPIA、FKB1A, CBG, GP1BA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Z、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下調蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP, C4BPB、SAA4、ADIP0、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT, FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF, C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA, FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRCl、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 構成。
2.如權利要求1所述的活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型，其特徵在於，蛋白表達差異質譜由相對和絕對定量的同位素標記血清全蛋白，經串聯質譜分析檢測蛋白質譜，再統計分析報告離子的相對定量。
3.如權利要求1所述的活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型，其特徵在於， 在相對定量分析中，採用質荷比114報告離子峰面積，以質荷比113、115、116、117的報告離子峰為對照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值^ 1.25^0.8的結果進行報告，其中，比值彡1. 25的為蛋白表達上調，比值彡O. 8的為蛋白表達下調。
4.一種權利要求1的活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型的構建方法，其特徵在於，該構建方法包括以下步驟 分別採集活動性肺結核組、健康對照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的血清標本，分別對血清進行高豐度蛋白的去除和蛋白濃度的測定，將蛋白進行還原、封閉、烷基化、酶解消化，用相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記，得到相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記的肽段；再將多肽進行強陽離子交換和反向液相色譜分離，再進行串聯質譜鑑定和相對定量分析，得到活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型。
5.如權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，串聯質譜鑑定過程中，採用噴霧電壓2. 2kV, MS掃描範圍400-1500U，MS/MS掃描範圍100_2000u，並增加20 %碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的報告離子更易分離；一個譜圖選擇20個最強的母離子進行串級掃描。
6.如權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，相對定量分析使用軟體為ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA)Software。
7.如權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，相對定量分析過程中設定蛋白置信度大於 95 %或 ProtScore (unused)大於1. 5。
8.如權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，相對定量分析過程中，採用質荷比114報告離子峰面積，以質荷比113、115、116、117的報告離子峰為對照，按照114 113、114 115,114 116,114 117的比值，選擇比值彡1. 25彡O. 8的結果進行報告，其中，比值>1. 25的為蛋白表達上調，比值< O. 8的為蛋白表達下調。
9.如權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，根據分析報告，通過活動性肺結核組與健康對照組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與肺炎組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與肺癌組的蛋白表達差異質譜、活動性肺結核組與COPD組的蛋白表達差異質譜，建立活動性肺結核的表達差異質譜模型。
全文摘要
本發明公開了一種活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型及構建方法，通過比較活動性肺結核組與健康對照組、肺炎組、肺癌組、COPD組的蛋白質組學差異，獲得活動性肺結核的蛋白表達差異質譜。此外，本發明還涉及活動性肺結核蛋白表達差異質譜模型構建的新方法，利用相對和絕對定量的同位素ITRAQ標記及串聯質譜技術，能有效地對血清裡的蛋白進行鑑定和相對定量，採用該技術能獲得活動性肺結核病人血清中的蛋白表達差異質譜。
文檔編號G01N30/02GK103065065SQ20121049963
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月18日 優先權日2012年11月18日
發明者李繼承, 徐丹丹 申請人:浙江大學