一種高溫誘導型啟動子的製作方法
2023-06-18 13:07:41 3
專利名稱：一種高溫誘導型啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高溫誘導型啟動子。
背景技術：
植物在進化的過程中，具備了適應不同環境的能力。在逆境如高溫的脅迫下，植物 通過一定的機制，誘發一些基因的表達，這些基因蛋白通過調節細胞的生理生化功能，應對 逆境的壓力，維持細胞的正常活性。 基因的誘導表達通常與基因的啟動子序列有關。許多研究已經證實，基因啟動子 區域有許多調控基因轉錄的特殊序列，如TATA盒為RNA聚合酶的結合位點，CAAT盒以及GC 盒等也都與基因轉錄的效率有關，另外還有一些激素的作用元件、轉錄因子結合區等順式 或反式元件位點等，通過各種作用方式調控基因的轉錄。 目前，研究逆境下的基因表達調控，是植物分子生物學研究中的熱門領域。杜娟以 小麥基因組DNA為模板，克隆了逆境誘導表達啟動子mwcs120。瞬時表達實驗表明，在單子 葉和雙子葉植物中，mwcs120啟動子均受低溫和高鹽逆境誘導，使GUS基因的表達增強。在 高溫脅迫研究方面，裴華麗從擬南芥的基因組DNA中擴增出熱激蛋白AtHSP70b基因的啟 動子，並將其與gus基因連接，通過農桿菌轉化技術導入菸草中獲得再生植株，GUS組織化 學法檢測證明該啟動子在菸草中具有高溫誘導表達的能力，但在常溫下也有不同程度的表 達。文春描從擬南芥中克隆了熱激蛋白基因HSP18. 2的啟動子，並構建了由HSP18. 2啟動 子引導的GUS融合基因，經農桿菌介導導入秈稻愈傷組織中。對熱激和常溫條件下轉基因 秈稻愈傷組織中GUS活性的比較測定表明，HSP18. 2啟動子在熱激條件下可驅動GUS報告基 因在轉基因愈傷組織中高效表達，而常溫條件下GUS活性在檢測水平以下，證明HSP18. 2啟 動子在秈稻中對基因的調控十分靈敏。伊淑瑩從番茄中克隆了 LeMTshsp基因上遊1915bp 的調控區，並構建了該啟動子與GUS基因的融合載體，利用農桿菌介導的葉圓盤法轉化番 茄，GUS組織化學染色結果表明LeMTshsp啟動子對熱激、低溫、外源ABA及重金屬脅迫都有 應答。 非生物逆境嚴重影響植物的正常生長發育。近年來，多種抗逆基因被克隆，並轉入 抗逆性較差的物種，顯著提高了作物對非生物逆境的抵抗能力。但是，在植物抗逆基因工程 中，多採用組成型強啟動子啟動抗逆基因過量表達，雖然使轉基因植物的抗逆性得以提高， 但對植物的一些生理代謝活動卻有抑制作用。據Kasuga等報導，組成型啟動子CaMV35S啟 動DREB基因在擬南芥中表達，雖提高了抗逆性，但植株矮化、生長畸形、籽粒數減少；而由 誘導型啟動子rd29A啟動的DREB基因在擬南芥中的表達，不僅提高了植株的抗逆性，而且 避免了對生長的負面影響。因此鑑定和克隆誘導型啟動子，對於植物抗逆基因工程的研究 是必要的。
發明內容
本發明的目的是提供一種高溫誘導型啟動子。
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本發明提供的DNA分子(啟動子)，來源於草坪草(品種PenA4)，為如下l)或2) 或3): 1)序列表中序列1所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分 子。 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65t:下雜交，然後用 2XSSC，0. 1% SDS和IXSSC，O. 1% SDS各洗膜一次。 含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的 保護範圍。 所述重組載體可為在pCAMBIA 1301的多克隆位點插入所述DNA片段得到重組質 粒。所述重組載體具體可為將序列1所示DNA分子插入pCAMBIA 1301的Sail和Ncol酶 切識別位點間得到的重組質粒。 擴增所述DNA分子的全長或其任意片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。
所述DNA分子可應用於啟動目的基因表達。所述啟動可受高溫誘導。所述高溫可 為35-45°C ，如40°C 。所述目的基因具體可為GUS基因。 本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是在出發植物中用所述DNA分子啟動 目的基因的表達，得到高溫誘導表達所述目的基因的轉基因植物。所述出發植物可為水稻， 如水稻品種kasalatha。所述高溫可為35_45°C ，如40°C 。所述目的基因具體可為GUS基 因；所述方法具體可為將所述重組載體導入所述出發植物，從而得到用所述DNA分子啟動 GUS基因表達的轉基因植物。 本發明公開了草坪草PenA4的高溫誘導型基因的啟動子(pAS)序列。本發明的啟 動子可被高溫誘導表達，能作為植物源的誘導型表達載體，在生物工程中具有很好的應用 前景。
圖1為啟動子(pAS)的發現過程。
圖2為啟動子和部分基因的序列。
圖3為啟動子的功能驗證。
圖4為啟動子的高溫誘導活性驗證。
具體實施例方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。 草坪草(剪股穎"PenA4"):購買自"北京中種草業有限公司"，產品目錄號為 M65-5-A-4-2。 水稻kasalatha :北京林業大學；參考文獻Lin SY， Sasaki T， Yano M. M即pingqimntitative trait loci controlling seed dormancy and heading date in
4rice， Oryzasativa L using backcross inbred lines. Theor Appl Genet，1998，96(8): 997-1003。 pCAMBIA 1301 :北京林業大學；參考文獻翟文學，李曉兵，田文忠，周永力，潘學 彪，曹守雲，趙顯峰，趙彬，章琦，朱立煌。由農桿菌介導將白葉枯抗性基因Xa2i轉入我國的 5個水稻品種。中國科學(C輯)，2000,30(2) :200-206。 農桿菌LBA4404 :北京林業大學；參考文獻閆雙勇，智慶文，劉欣潔，張紅偉，譚振 波，李仕貴。水稻T-DNA插入突變體庫的構建及突變類型的分析。遺傳學報，2004，31(12): 1388-1394。 實施例1、啟動子(pAS)的發現 提取草坪草(品種PenA4)的基因組DNA，利用限制性內切酶PSTI酶切半小時，然
後97t:高溫處理以終止反應，獲得部分酶切的基因組片段。 設計PSTI酶切位點的接頭(#96 :5' -CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3'禾P #97 : 3' -CATCTGACGCATGT-5')並與部分酶切的基因組片段連接。 設 計特異引物(Ul :5' -CGTGCAAGGAAGCAGAAGGCG-3')。利用弓|物組合Ul和#96擴 增上述連接產物，將片段回收、克隆後進行DNA測序，獲得一個775bp的DNA片段U1。進一 步在片段U1的5'端設計特異引物U2(5' -ACGGATGGGCATATATCACG-3')，利用引物組合U2 和#96擴增連接產物，將片段回收、克隆後進行DNA測序，獲得一個417bp的DNA片段U2。
將U1和U2的序列進行比對和拼接，對拼接的調控區序列進行分析，鑑定出基因的 起始密碼子ATG，去除結構基因的部分。獲得基因的5'端的調控區序列(U1、U2和5'端的 調控區的發現流程見圖1，5'端的調控區和部分基因見圖2)。 在拼接的啟動子序列兩端設計特異引物組合U3F/U3R(U3F : 5， -AATCACCGGAGAAGCTCTCG-3' ;U3R :5' -TGCAGAGAGGGAAGCTAGCT-3')。利用PenA4的基 因組DNA為模版，利用高保真的TAG酶，用U3F/U3R進行PCR擴增，將PCR產物連接到質 粒pMD18-T(寶生物工程有限公司，D103A)上，並進行測序驗證。結果表明，PCR產物長度 為962bp，如序列表的序列l所示。將序列l所示的核苷酸命名為pAS。其中TATA盒位 於-132 -127區，與CAAT盒形似功能的AGGA盒位於-152 -147區。另外有大量的激素調 控元件分布於啟動子區段，如與ABA相關的DRE2元件"ACCGAC"位於-139區，DPBF-land-2 元件"ACACNNG"位於-438區，MYBRS元件"CANNTG"位於-417等。將pAS與pMD18-T連接 得到的重組質粒命名為pMD18-T :pAS。
實施例2、啟動子的高溫誘導活性驗證
—、重組表達載體的構建 1、用限制性內切酶Sal I和Nco I酶切實施例1製備的pMD18-T :pAS，回收酶切
產物(PAS); 2、用限制性內切酶Sal I和Nco I酶切雙元載體pCAMBIA 1301，獲得去除CaMV35S 啟動子的pCAMBIA 1301載體骨架； 3、將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接，得到重組質粒，進行測序驗證， 測序結果表明，得到了目的質粒pAS-GUS(用序列1所示的pAS取代pCAMBIA 1301的Sail 和Nco I酶切識別位點間的小片段)。
二、轉化愈傷組織
將pAS-GUS轉化農桿菌菌株LBA4404，在AB培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物 5g/L，氣化納5g/L，利福平10mg/L，卡那毒素50mg/L， pH7. 4) (Agrobacteriumtumefaciens DNA and Ps8 bacteriophage DNA not detected in crown gall t咖ors。 PNAs， 1974,71:3672-3676)上培養兩天後，將獲得的轉化克隆在NB/AS培養基(Efficient transformation of rice(0ryza sativa L)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of boundaries of the T-DNA. Plant J. 1994， 6， 271-282) (NB培養基+乙醯丁香 酮10-20mg/L)上培養至0D600 = 0. 2-0. 4。將水稻kasalatha的愈傷組織於上述菌液中浸 泡30分鐘，然後轉移至NB/AS培養基上，25t:暗培養2天後，轉移至NB/HC培養基(NB培養 基+50mg/L潮黴素B+250mg/L cefotaxime, pH5. 8)上繼代培養2個月。
將pCAMBIA 1301通過農桿菌LBA4404轉化水稻kasalatha的愈傷組織，方法同 上，得到轉空載體對照愈傷組織。
三、啟動子的功能驗證 啟動子的活性檢測通過GUS染色實驗進行，實驗方法如下將步驟二得到的愈傷 組織(轉pAS-GUS愈傷組織或轉pCAMBIA 1301愈傷組織)切割後放入一個印pendorf管 中，加入X-Gluc染色液，37t:培養箱暗處過夜。第二天觀察愈傷的染色。染色結果見圖3。 圖3A顯示，轉pAS-GUS愈傷組織呈現大片的藍色，顯示GUS基因已經大量表達。圖3B顯示， 轉pCAMBIA 1301愈傷組織也呈現大片的藍色，顯示GUS基因已經大量表達。結果表明，pAS 和CaMV35S啟動子一樣具有啟動基因轉錄的活性。
四、啟動子的高溫誘導活性驗證 依據GUS基因的序列，設計特異擴增引物GUSP1和GUSP2，利用Actin基因作為待 檢測基因轉錄產物的對照。GUSP1:5' -CTGCGACGCTCACACCGATACC-3';
GUSP2:5' -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3'。
ActinF:5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3，；
ActinR :5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3，。 將步驟二得到的愈傷組織(轉pAS-GUS愈傷組織或轉pCAMBIA 1301愈傷組織) 各分為兩份，分別於常溫(20°C )和高溫(40°C )下處理1小時。分別提取總RNA，並逆轉 錄生成cDNA。利用上述引物對不同溫度處理下的cDNA樣品進行real time-PCR檢測(ABI PRISM 5700 Sequence Detector)。以轉pCAMBIA 1301愈傷組織在20。C下處理1小時的 GUS基因表達量為l，將兩種愈傷組織在不同溫度下GUS基因的表達量繪製柱形圖，見圖4。 結果顯示在常溫下的轉pAS-GUS愈傷組織，GUS基因的表達量很少(相對表達量為O. 15)， 而高溫處理後的轉化愈傷組織有大量的GUS基因轉錄產物(相對表達量為1. 11)，差異量達 到近10倍；在常溫下的轉pCAMBIA 1301愈傷組織，GUS基因的表達相對量為1. 04，而高溫 處理後的轉化愈傷組織，GUS基因的表達相對量為1. 09，均與高溫處理後的轉pAS-GUS愈傷 組織的GUS基因表達量相仿，差異量不顯著。結果表明，pAS具有高溫誘導特徵。
實施例2的實驗重複進行三次，都得到的同樣的結果。
權利要求
一種DNA分子，為如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2. 含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3. 如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為在pCAMBIA 1301的多 克隆位點插入權利要求1所述DNA分子得到重組質粒。
4. 如權利要求3所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將序列1所示DNA分 子插入pCAMBIA 1301的Sal I和Nco I酶切識別位點間得到的重組質粒。
5. 權利要求1所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述啟動受高溫誘導。
7. 如權利要求5或6所述的應用，其特徵在於所述目的基因為GUS基因。
8. —種培育轉基因植物的方法，是在出發植物中用權利要求1所述DNA分子啟動目的 基因的表達，得到所述目的基因的表達受高溫誘導的轉基因植物。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述出發植物為水稻，優選水稻品種 kassalatha ;所述高溫為35-45。C，優選40°C 。
10. 如權利要求8或9所述的方法，其特徵在於所述目的基因為GUS基因；所述方法 為將權利要求4所述重組載體導入所述出發植物，從而得到用權利要求1所述DNA分子啟 動GUS基因表達的轉基因植物。
全文摘要
本發明公開了一種高溫誘導型啟動子。本發明提供的啟動子為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發明公開了草坪草PenA4的高溫誘導型基因的啟動子序列。本發明的啟動子可被高溫誘導表達，能用於植物源的誘導型表達載體，在生物工程中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK101781652SQ20101011072
公開日2010年7月21日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者周鵬, 徐吉臣, 徐筱, 朱旗 申請人:北京林業大學