Tcrp1基因在製備腫瘤細胞鉑類耐藥逆轉劑中的應用的製作方法
2023-06-19 05:41:56 3
專利名稱：Tcrp1基因在製備腫瘤細胞鉑類耐藥逆轉劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地講，涉及TCRPl基因在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的新用途。
背景技術：
自1967年發現順鉬(cisplatin )具有抗腫瘤活性以來，鉬類金屬抗腫瘤藥物的合成、應用和研究得到了迅速的發展，目前其發展已經歷了三代順鉬、卡鉬和奧沙利鉬。憑藉其良好的療效，鉬類藥物已被廣泛應用於多種惡性實體腫瘤的一線治療，如卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、結腸癌、鼻咽癌等頭頸部實體瘤，成為癌症化療不可或缺的藥物。據統計，在中國以鉬類藥物為主或有其參加配伍的化療方案佔所有化療方案的70%-80%。但腫瘤細胞對鉬類藥物耐藥性的產生常使化療難以奏效並最終導致化療失敗。因此研究鉬類藥物耐藥分子機制及尋找逆轉耐藥的靶點已成為目前腫瘤治療研究中的一個焦點。腫瘤鉬類耐藥的產生是一個多因素參與的複雜過程，其耐藥機制尚需進一步闡明。目前認為耐藥的主要機制有1.胞內藥物蓄積減少。包括胞內藥物攝取減少和藥物排出增多。如與攝取鉬類藥物相關的膜蛋白CTRl (copper transporter I)的表達降低；與藥物排出相關的多藥耐藥蛋白，MDR、MRP2、ATP7A/7B等表達增高。2.活化減少，失活增加。一些內生的親核物質，如穀胱甘肽，蛋氨酸和金屬硫蛋白能與鉬類藥物結合導致其在體內失活。3. DNA修復能力增強。如DNA修復系統蛋白ERCCl、BRCA1/BRCA2的活性與鉬類藥物敏感性負相關。4.鉬類藥物對細胞損傷能力減弱。如p53基因的突變，導致細胞凋亡抑制，存活能力增強。5. DNA甲基化以及信號傳導通路異常等。TCRPl (Tongue Cancer Resistance-associated Protein I )基因是本課題組前期在分析自主建立的多藥耐藥 細胞株人舌鱗癌細胞Tca8113/PYM (對平陽黴素、順鉬、奧沙利鉬等耐藥，耐藥指數RI>18)與其親本敏感細胞株Tca8113的cDNA晶片結果時，得到一個新的EST序列。通過利用生物信息學分析技術，申請人對這一個EST序列(GenBank ID:AL707095; UniGene Cluster ID:Hs475334)進行 Blast 延伸拼接分析，結合 PCR 擴增，得到一個全長cDNA序列，命名為TCRPl基因(NCBI提交號EF363480)。TCRPl 基因位於人類染色體 Ilql3. 4 (NCBI Human Genome Project database,Build37. 3)也命名為 FAM168A 或者 KIAA0280。其於 1996 被日本 Kazusa DNA ResearchInstitute報導為預測基因，命名為KIAA0280，但生物學功能一直不明。TCRPl在NCBIBuild 37.3中確定其mRNA全長為1834bp，共8個外顯子，預測可轉錄編碼235個胺基酸。
發明內容
本發明的目的是提供TCRPl基因作為腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑的新的應用，為腫瘤耐藥機制提供新的資料，並且為抗腫瘤耐藥藥物的設計和篩選提供了新的靶點。具體的講，我們利用RT-PCR和Western blot發現TCRPl在多種繼發性鉬類耐藥細胞株(A549/DDP、COCI/DDP, Tca8113/PYM)表達相對於其親本敏感細胞株升高，在肺癌原發性鉬類耐藥細胞株95D中也明顯高於其他鉬類敏感肺癌細胞株。進一步，我們發現利用SiRNA幹擾技術，通過降低TCRPl的表達水平可逆轉繼發性和原發性耐藥細胞株對鉬類藥物的反應，增強其對鉬類藥物(順鉬、奧沙利鉬)的敏感性。因此首次提出TCRPl基因是腫瘤細胞耐藥相關基因，主要為鉬類耐藥相關基因。另外TCRPl的siRNAs分子可作為腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑，在逆轉腫瘤鉬類耐藥性中發揮重要作用。此外本發明還涉及該核酸分子TCRPl的抗體製備，包含TCRPl核酸分子的重組表達載體。發明保護了 TCRPl基因在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1所不；
以及TCRPl多肽在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用，所述的TCRPl多肽的序列如 SEQ ID NO:2 所示；
以及TCRPl基因抑制劑在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用；
以及TCRPl基因的幹擾siRNAs在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用。上述的幹擾siRNAs的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。上述的逆轉劑為原發性腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑或繼發性腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑。優選地，所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。優選地，所述的腫瘤細胞為肺癌細胞、卵巢癌細胞、和/或舌鱗癌細胞。作為優選的方案 ，所述腫瘤細胞為繼發性鉬類耐藥細胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和舌癌Tca8113/PYM ;或原發性鉬類肺癌耐藥細胞株95D ；
優選地，鉬類藥物為順鉬和奧沙利鉬。本發明的有益效果主要體現在
TCRPl不僅在鉬類繼發性耐藥腫瘤細胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達升高，也在原發性鉬類耐藥細胞株，如肺癌％D細胞中表達明顯高於肺癌其他敏感細胞株。降低TCRPl基因的表達可增強細胞株對鉬類藥物的敏感性。該基因定位於人染色體llql3. 4，序列全才1834bp，開放讀碼框708 bp，編碼235個胺基酸。本發明不僅為腫瘤耐藥機制提供新的資料，而且為抗腫瘤耐藥藥物的設計提供了新的靶點。本發明的TCRPl基因可作為抗鉬類耐藥腫瘤藥物的作用靶點，進行抗腫瘤耐藥的設計和抗耐藥腫瘤治療。以這一基因為靶點，在基因水平上和蛋白水平上設計新的化學實體，避免腫瘤細胞鉬類耐藥的產生或者逆轉已經產生的耐藥性，從而提高治療的療效。
圖1為繼發性耐藥腫瘤細胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鱗癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，對順鉬耐藥性的檢測圖，顯示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM繼發性耐藥細胞株，相對各自敏感細胞株A549、Cocl、Tca8113，對順鉬有強的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對順鉬敏感，無耐藥性。圖2為繼發性耐藥腫瘤細胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鱗癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，對奧沙利鉬耐藥性的檢測圖，顯示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM繼發性耐藥細胞株，相對各自敏感細胞株A549、Cocl、Tca8113，對奧沙利鉬有強的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對奧沙利鉬敏感，無耐藥性。圖3為TCRPl在繼發性耐藥腫瘤細胞株中表達量；
A :TCRP1基因的實時定量PCR檢測圖，顯示TCRPl在mRNA水平上，在順鉬和奧沙利鉬耐藥性強的繼發性腫瘤耐藥細胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達水平高於各自敏感株，而在對順鉬和奧沙利鉬無耐藥性的MCF7/5FU中TCRPl的表達沒有改變；
B: Western Blot檢測圖，顯示TCRPl在蛋白水平上，在順鉬和奧沙利鉬耐藥性強的繼發性腫瘤耐藥細胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表達高於各自敏感株，而在對順鉬和奧沙利鉬無耐藥性的MCF7/5FU中TCRPl的表達沒有改變。圖4為siRNAs幹擾TCRPl後可逆轉繼發性耐藥腫瘤細胞株對鉬類藥物的敏感性；
A C0C1/DDP, A549/DDP 和 Tca8113/PYM 中 siRNA 幹擾組(-sitcrpl)與對照組(-con)比較，幹擾組對順鉬的藥物敏感性增強；
B C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的IC50值減小；
C C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的藥物敏感性增強；D C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的IC50值減小。圖5為人肺癌先天性鉬類藥物耐藥株的篩選；
A、B :顯示人非小細胞肺癌細胞H1299、人非小細胞肺腺癌細胞H1975、人大細胞肺癌H460、人肺腺癌細胞SPC-A-1、人肺腺癌細胞LTEP-a-2、人小細胞肺癌H446、高轉移肺癌95D、人肺鱗癌細胞SK-MES-1對順鉬的藥物敏感性，表明肺癌95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1細胞對順鉬敏感性較其他細胞低；
C :不同肺癌細胞對順鉬的IC50值，其中肺癌高轉移細胞9邪對順鉬的IC50值明顯高於其他細胞；
D :肺癌％D和H1299細胞對奧沙利鉬藥物敏感性；
E :肺癌95D和H1299細胞對奧沙利鉬的IC50值。圖6為TCRPl在不同人肺癌腫瘤細胞株中表達量；
A :實時定量PCR檢測圖，顯示在原發性耐藥肺癌細胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在mRNA水平上表達高於其他敏感細胞株，其中％D細胞尤其明顯；
B Western Blot檢測圖，顯示原發性耐藥肺癌細胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在蛋白水平上表達高於其他敏感細胞株。圖7為siRNAs幹擾TCRPl後可逆轉原發性鉬類耐藥肺癌細胞株95D的敏感性； A :原發性耐藥肺癌％D細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的藥物敏感
性增強。而敏感肺癌H1299細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的藥物敏感性無明顯區別；
B :原發性耐藥肺癌％D細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的IC50值減小。而敏感肺癌H1299細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對順鉬的IC50值無明顯區別；C :原發性耐藥肺癌％D細胞中SiRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對奧沙利鉬的藥物敏感性增強。而敏感肺癌H1299細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對奧沙利鉬的藥物敏感性無明顯區別；
D :原發性耐藥肺癌％D細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對奧沙利鉬的IC50值減小。而敏感肺癌H1299細胞中siRNA幹擾組與對照組比較，幹擾組對奧沙利鉬的IC50值無明顯區別。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步的描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此
實施例1 :細胞培養
A549 (人肺癌細胞系)，A549/DDP (A549細胞耐藥亞株)，Cocl (人卵巢癌細胞系)，Cocl/DDP (Cocl細胞耐藥亞株)，Tca8113 (人類舌鱗癌細胞系)，購自中國典型培養物保藏中心。Tca8113/PYM由本室誘導建立。採用4個劑量的平陽黴素(PYM) (1、2、5和l(^g/mL)反覆間歇24 h或48 h暴露法處理舌癌細胞系Tca8113細胞，最後直到細胞能在含PYM100 ng/mL培養基中呈指數生長，得到耐藥細胞系命名為Tca8113/PYM。
人肺癌腫瘤細胞系，SK-MES-1 (肺鱗癌細胞)，LTEP_a_2 (肺腺癌細胞)，SPC-A-1(肺腺癌細胞)，95D (高轉移肺癌細胞)，NC1-H1299 (非小細胞肺癌細胞)，NC1-H1975 (肺腺癌細胞)和NC1-H446 (小細胞肺癌細胞)，NC1-H460 (大細胞肺癌細胞)購自上海中科院細胞庫。SK-MES-1用含10%胎牛血清及1. OmM丙酮酸鈉，O.1mM非必需胺基酸和1. 5g/L碳酸氫鈉的DMEM培養，其餘細胞均用含10%胎牛血清的RPM1-1640培養，置於37°C，5% CO2培養箱培養。實施例2 :細胞系耐藥性分析
選取生長至對數期的培養細胞，棄去細胞培養液，1*PBS液漂洗2次，消化後製成細胞懸液，計數器計數以每孔1000-5000接種到96孔培養板中(180 μ I/孔)，37° C，5%C02培養箱中孵育至細胞貼壁。在96孔培養板中加入不同濃度藥物(如順鉬，奧沙利鉬)，每種濃度5孔，於37° C培養箱中孵育72h ;每孔加入MTS 20 μ I,混勻後孵育3小時，於酶標儀上檢測490波長下各組OD值。計算平均細胞存活率(Survival Rate)，以藥物濃度為橫坐標，細胞存活率(Survival Rate)為縱坐標繪製回歸曲線，並通過曲線計算IC50值。以上實驗重複3次。結論繼發性耐藥細胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，相對各自敏感細胞株A549、CocU Tca8113，對順鉬和奧沙利鉬有強的耐藥抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU對順鉬和奧沙利鉬敏感，無耐藥性(如圖1、2所示)。肺癌95D，LTEP-a-2和SPC_A_1，SK-MES-1細胞對順鉬敏感性較其他細胞低，其中肺癌高轉移細胞％D對順鉬和奧沙利鉬的敏感性明顯低于于其他肺癌細胞(如圖5所示)。實施例3 :實時定量PCR分析TCRPl在各細胞系中的表達
取生長至對數期的各種培養細胞，TRIZOL方法提取總RNA。DNaseI消化後，測量RNA.以 oligdT 為引物取等量的 RNA 按照 Fermentas 公司 Reverse Transcription System 程序逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBGreen操作說明，用以下引物進行實時定量PCR擴增，TCRPl基因編碼區引物
SEQ ID NO:6 Forward :5』-CCAATAGTCCCAGTTATGCTCCA-3』
SEQ ID NO:7 Reverse :5』-TGCTTGGTAAGTTCGGTTCTCG-3』
擴增片段為134bp GAPDH基因編碼區引物
SEQ ID NO:8 Forward :5』-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3』
SEQ ID NO:9 Reverse :5』-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3』
擴增片段為156bp PCR 反應參數95°C 5min ；95°C 30sec, 59°C 30sec, 72°C 30min 共 40 個循環。70°C至95°C繪製溶解曲線。以上實驗重複三次。以GAPDH為內對照，通過2_Λ 法計算各組之間目標基因TCRPl表達水平的差異；按照下列公式計算樣本的相對表達量其中Λ ACt =Δ Ct 處理組一Λ Ct 對照組；Λ Ct = Ct TCRPl - Ct GAPDH ；
結論在繼發性順鉬和奧沙利鉬耐藥細胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的表達明顯高於各自敏感細胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在對順鉬和奧沙利鉬敏感的而乳腺癌MCF7/5FU細胞中，TCRPl表達無明顯的改變(如圖3A所示)。在原發性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的表達明顯高於其他敏感肺癌細胞。表明TCRPl的表達與順鉬和奧沙利鉬的耐藥性成正相關(如圖6A所示)。實施例4 :Western Blot分析TCRPl在各細胞系中的表達
取生長至對數期的培養細胞，用含蛋白酶抑制劑的新鮮細胞裂解液，裂解細胞提取總蛋白。用Bio-Rad公司Bradford方法測定蛋白濃度。按每個泳道加40Pg蛋白質計算細胞蛋白體積，按1:4的比例加5XSDS上樣緩衝液將其溶解，100° C變性5min，立即置於冰上5min，短暫快速離心。上樣後進行電泳，先在80V下電泳至溴酚藍染料進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部。Bio-Rad電泳儀120mV恆壓進行70min蛋白質的電轉移，使分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上。濾膜用PBST溶劑配製的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2H。反貼法孵育一抗4H，一抗孵育後用PBST洗膜3次，每次15min。辣根過氧化物酶標記的抗兔及鼠二抗以1:4000稀釋在5%脫脂牛奶中，室溫孵育濾膜1H，PBST洗膜3次，每次15min。洗膜後進行ECL化學發光、X光片曝光並顯影、定影，分析結果。結論在繼發性順鉬和奧沙利鉬耐藥細胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的蛋白表達水平高於各自敏感細胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在對順鉬和奧沙利鉬敏感的而乳腺癌MCF7/5FU細胞中，TCRPl蛋白的表達無明顯的改變(如圖3B所示)。在原發性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的蛋白表達水平高於其他敏感肺癌細胞。表明TCRPl在蛋白水平上的表達與順鉬和奧沙利鉬的耐藥性也成正相關(如圖6B所示)。實施例5 :篩選高效的幹擾TCRPl的siRNAs片段
設計和合成針對TCRPl基因的瞬時幹擾寡核苷酸序列三條 SEQ ID NO:3 5』 -AACCGAACUUACCAAGCAU-3，
SEQ ID NO:4 5』 -ACCCUAAGAACAUGGCCUA-3』
SEQ ID NO:5 5』 -AUGGCAACCCUAAGAACAU-3』按Lipofectamin2000說明書進行轉染,步驟如下於轉染前24小時接種細胞於六孔板，待細胞融合至60 80%時進行轉染。將IOOpM siRNA溶於250 μ I無血清細胞培養基中混勻，5. O μ I Lipofectamin2000溶於另外250 μ I無血清細胞培養基中混勻，室溫放置5min後將以上兩者混合，總體積為500 μ 1，室溫放置20min後將其加入待轉染孔中，再加入1. 5ml無血清細胞培養基，置於37°C細胞培養箱中培養，5小時後更換成含血清細胞培養基，於細胞培養箱中繼續培養。培養24小時後，提取細胞總蛋白驗證siRNA幹擾效果。結果SEQ ID NO: 3幹擾序列，轉染入各組細胞後其幹擾效果顯著。遂本實驗皆採用SEQ ID NO:3處理細胞進行下一步研究。實施例6 :siRNA幹擾TCRPl的表達可逆轉繼發性和原發性腫瘤細胞對順鉬和奧沙利鉬的敏感性
用TCRPl的siRNA幹擾序列SEQ ID NO: 3，按Lipofectamin 2000說明書進行轉染繼發性順鉬和奧沙利鉬耐藥細胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原發性順鉬和奧沙利鉬耐藥肺癌細胞95D ;同時以轉染幹擾序列的相應的腫瘤細胞作為對照(Control);具體步驟如下於轉染前24小時接種細胞於六孔板，待細胞融合至60 80%時進行轉染。將IOOpM siRNA溶於250 μ I無血清細胞培養基中混勻，5. O μ I Lipofectamin2000溶於另外250 μ I無血清細胞培養基中混勻，室溫放置5min後將以上兩者混合，總體積為500 μ 1，室溫放置20min後將其加入待轉染孔中，再加入1. 5ml無血清細胞培養基，置於37°C細胞培養箱中培養，5H後更換成含血清細胞培養基，於細胞培養箱中繼續培養。培養24H後，分析腫瘤細胞耐藥性的改變。結果降低TCRPl在繼發性耐藥細胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原發性耐藥肺癌細胞95D的表達,可增強其 對順鉬和奧沙利鉬的敏感性,逆轉其對順鉬和奧沙利鉬的耐藥性。顯示TCRPl的siRNA幹擾序列可作為一個鉬類藥物耐藥逆轉劑(如圖4、7所示)。發明所涉及的序列
權利要求
1.TCRPl基因在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.TCRPl多肽在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用，所述的TCRPl多肽的序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.TCRPl基因抑制劑在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用。
4.TCRPl基因的幹擾siRNAs在製備腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於所述的幹擾siRNAs的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
6.如權利要求1-4任意權利要求所述的應用，其特徵在於所述的逆轉劑為繼發性腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑或原發性腫瘤細胞鉬類耐藥逆轉劑。
7.如權利要求6任意權利要求所述的應用，其特徵在於的腫瘤細胞為實體瘤細胞。
8.如權利要求6任意權利要求所述的應用，其特徵在於的腫瘤細胞為肺癌細胞、卵巢癌細胞、和/或舌鱗癌細胞。
9.如權利要求6任意權利要求所述的應用，其特徵在於所述的腫瘤細胞為繼發性鉬類耐藥細胞肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和/或舌鱗癌Tca8113/PYM ;或原發性鉬類肺癌耐藥細胞95D。
10.如權利要求1-4任意權利要求所述的應用，其特徵在於所述的鉬類藥物為順鉬(cDDP)和奧沙利鉬(L-OHP)。
全文摘要
本發明公開了一個自主克隆的新的人類腫瘤耐藥相關基因——TCRP1,此基因與腫瘤化療鉑類藥物的耐藥產生有密切的關係。TCRP1不僅在鉑類繼發性耐藥腫瘤細胞株Tca8113/PYM、A549/DDP、Coc1/DDP表達升高，也在原發性鉑類耐藥細胞株，如肺癌95D細胞中表達明顯高於肺癌其他敏感細胞株。降低TCRP1基因的表達可增強細胞株對鉑類藥物的敏感性。該基因定位於人染色體11q13.4，序列全長1834bp，開放讀碼框708bp，編碼235個胺基酸。本發明不僅為腫瘤耐藥機制提供新的資料，而且為抗腫瘤耐藥藥物的設計提供了新的靶點。
文檔編號C12N15/113GK103055326SQ20121055651
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者賀智敏, 谷依學, 鄭國沛, 張志傑 申請人:廣州醫學院附屬腫瘤醫院