重組人肝細胞生長因子rhHGFα的製備方法
2023-06-18 21:53:36 1
專利名稱：重組人肝細胞生長因子rhHGFα的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質rhHGFα因子的生產方法。該方法通過對完整的hHGFαcDNA進行克隆，獨立構建rhHGFα鏈的原核表達體系、並表達出具有野生活性的rhHGFα因子。
背景技術：
肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)是由674個胺基酸組成的異二聚體蛋白質，分子量為80KDa；成熟的活性HGF蛋白由一條含440個胺基酸的重鏈和一條含234個胺基酸的輕鏈在空間盤曲折繞而成。HGF可以促進肝細胞及多種內皮細胞、上皮細胞的分裂、分化；參與肝臟及其他重要組織器官損傷後的修復和生理條件下死亡細胞的再生；能明顯抑制肝癌等腫瘤細胞增殖，是治療各種肝病的最理想藥物。但HGF的來源問題還尚未解決。以往使用的HGF均從含量極微的組織中提取，過程複雜、成本昂貴，很難適應HGF研究和開發的需要。尋找並建立一個體外大量獲得HGF的方法和途徑是國內外許多實驗室競相努力的目標。由於HGF合成加工的特殊性，即活性HGF是由異源蛋白二聚體組成的特點，以及原核表達體系缺乏對真核基因翻譯後的剪切、加工作用，用HGF全序列cDNA作原核表達，表達產物不會有野生HGF活性。為此，本實驗室提出將基因工程和蛋白質工程技術相結合，分別構建HGF重鏈(α鏈)表達體系和HGF輕鏈(β鏈)表達體系，分別表達HGF的重鏈蛋白和輕鏈蛋白。然後，利用異源蛋白體外共復性技術，製備有野生活性的HGF蛋白(該項技術已申請專利，專利申清號)。本實驗室通過研究進一步發現單獨表達的rhHGFα因子，通過稀釋復性後，具有促進肝細胞增殖的活性，由於其生產工藝更簡單，成本更低廉，有望取代完整的rhHGF因子。
發明要點本發明的目的在於提供一種rhHGFα因子的製備方法，為大量製備rhHGFα因子奠定基礎。為達到上述目的，本發明採用了以下技術路線和步驟一、技術路線1.rhHGFα基因的獲取；2.pBV220-rhHGFα重組質粒的構建；3.PLYSS-rhHGFα工程菌的構建；4.rhHGFα蛋白質的表達和分離純化；5.rhHGFα蛋白質的復性(圖1)。
二、步驟1.rhHGFα基因的獲取.根據對hHGFα基因序列分析和真核基因在原核細胞中表達的要求，設計合成一對引物，上遊引物是5』-ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA-3』下遊引物是5』-ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTCTTTCG-3』上遊引物長度為27個核苷酸，含有EcoRI識別位點，起始密碼ATG及與編碼HGF的N末端基因相同的18個核苷酸；下遊引物長度為29個核苷酸，含有終止密碼子，BamHI識別位點及與編碼HGF的C末端基因互補的20個核苷酸。以重組質粒pRC/CMV-HGF(由美國著名科學家閆佔清饋贈)為模板，通過聚合酶鏈反應(PCR)，擴增得到了去除N端54肽前體序列(包括信號肽在內)，並加上起始密碼ATG、串聯終止密碼TAA、TGA及適於克隆和表達的酶切位點EcoRI和BamHI的hHGFαcDNA(1.34bp)。2.pBV220-hHGFα重組表達質粒的構建.將hHGFαcDNA基因片段用Xhol酶切為386bp、954bp兩個片段，將386bp片段與954bp片段分別與線性化載體pBSKS進行重組連接，形成pBSKS-HGF386、pBSKS-HGF954兩個亞克隆重組質粒(圖2)；轉化後篩選陽性克隆，酶切鑑定正確無誤。
用EcoRI/XhoI從pBSKS-HGF386中酶切回收EcoRI-XhoI(386bp)片段，再用XhoI/BamHI從pBSKS-HGF954中酶切回收XhoI-BamHI(954bp)片段，之後將EcoRI-XhoI(386bp)片段和XhoI-BamHI(954bp)片段重組到表達載體pBV220上(經EcoRI、BamHI消化)，pBV220經篩選、酶切分析、克隆片段全序列測定證實，正確構建了pBV220-hHGFα重組表達質粒。該質粒在rhHGFα外源基因上遊串聯λPRPL強啟動子，含有編碼λ阻遏蛋白(repressor)的CIts857基因。
hHGFα的基因序列為1 aattcatgcc agcactgaag ataaaaacca aaaaagtgaa tactgcagac caatgtgcta61 atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt tttgataaag301 caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg aaaaaagaat361 ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc atcattggta421 aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa tgtcagccct481 ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc541 tacaggaaaa ctactgtcga aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa601 gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca661 tgacctgcaa tggggagagt tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt721 gtcagcgctg ggatcatcag acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg781 acaagggctt tgatgataat tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct841 atactcttga ccctcacacc cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata901 ctatgaatga cactgatgtt cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag961 gctacagggg cactgtcaat accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc1021 agtatcctca cgagcatgac atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa1081 attactgccg aaatccagat gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca1141 tccgagttgg ctactgctcc caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt1201 atcgtgggaa tggcaaaaat tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat1261 gttcaatgtg ggacaagaac atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg1321 caagtaagct gaatgagaat tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt1381 gctacacggg aaatccactc attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg1441 ataccacacc tacaatagtc aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac1501 aattgcgata ag3.PLYSS-hHGFα工程菌的構建將經限制性內切酶酶譜分析證實重組正確的重組表達質粒pBV220-hHGFα用氯化鈣轉化方法轉化到大腸桿菌PLYSS(由本室保存)中。正確構建了PLYSS-hHGFα工程菌株，這為hHGFα蛋白質的表達和分離純化奠定了基礎。4.hHGFα蛋白質的表達和分離純化。
1)工程菌的轉化將構建正確的pBV220-hHGFα重組表達質粒用氯化鈣轉化方法轉化到大腸桿菌PLYSS中，採用改良的M9+LB培養基用溫控誘導表達的方法表達人肝細胞生長因子重鏈蛋白，SDS-PAGE(10％)分析表達產物。
2)菌體破碎目前細胞破碎的方法有機械法和非機械法兩大類。超聲破碎法是應用較多的機械破碎法之一，它的缺點是不能用於大規模生產；溶菌酶法是非機械法常用方法之一，其特點是條件溫和但破菌效果較差。
本發明的關鍵之一在於超聲前先用1mg/mL溶菌酶消化菌體一定時間，再使用超聲法，破菌效果比單獨使用超聲法要好，然後再用機械法即可提高細胞的破碎率。關鍵之二在於用溶菌酶破菌之前加入濃度為20％的蔗糖，包涵體的回收率從10％提高到13％，而且使細菌破碎更加完全，並提高包涵體的回收率，為下一步復性處理奠定了基礎。
3).包涵體粗提取和純化將沉澱充分重懸於緩衝液中靜置、離心；繼續將沉澱溶於緩衝液中，回收溶包上清，用透析液攪拌透析24h。
4).凝膠過濾層析和陰離子交換層析將透析液上樣，分別做凝膠過濾層析和陰離子交換層析，純化目的蛋白，將含重組蛋白純度較高的收集液合併，用於復性。5.rhHGFα因子的復性將變性蛋白溶液加入到245ml稀釋用變性液中，攪拌混合後裝入預先處理過的透析袋中，將透析袋放入燒杯中攪拌透析5h，繼而放入復性液中攪拌透析；將透析袋取出放入緩衝液中，4℃，攪拌透析10-15h，離心透析袋中溶液，上清即可進行活性測定。6.活性測定經過MTT法測定，rhHGFα因子有刺激原代培養成年大鼠肝細胞增殖的生物學活性，與HGF標準品(其活性為50U/ng)相比，rhHGFα因子的活性為18U/ng；與本實驗室( )專利申請中所述的rhHGF因子(活性20U/ng)在統計學上無顯著性差異；rhHGFα因子與HGF相比，半衰期縮短，但由於rhHGFα不需要和β鏈共復性而大大簡化了生產工藝，是有希望取代rhHGF的一種活性蛋白質。
實施例1.PBSKS-HGF386、PBSKS-HGF954亞克隆質粒的構建和酶切鑑定1.HGF基因片段的製備用XhoI酶切1.34kb的HGFa鏈基因，總反應體積為150μl，消化3h後，取5μl電泳觀察酶切程度，回收純化386bp、954bp長的兩個片段。分別以EcoR I、BamH I酶切386bp、954bp兩個片段，DNA各3μg，分別加入EcoR I(12u/μl)、BamH I(10u/μl)1μl，總反應體積為100μl，同前保溫回收酶切後的兩個片段。
2.PBSKS線性載體的製備建立兩個酶切反應體系，在50μl反應體積中各消化5μgPBSKS質粒，其中一個體系中加入EcoR I、Xho I各1μl聯合酶切，另一體系中加入BamH I、Xho I各1μl聯合酶切，保溫3h後，分別回收2.96kb長的兩個線性化載體。
3.HGF基因片段與線性化載體PBSKS的連接、轉化及陽性克隆的篩選建立兩個連接反應體系。回收的EcoR I-Xho I(386bp)片段與線性化PBSKS(經EcoRI、Xho I消化)載體、Xho I-BamH I(954bp)片段與線性化PBSKS(經BamH I、Xho I消化)載體以3∶1摩爾比混勻，先於68℃水浴10min，迅速放回冰中冷卻後加10×連接反應buffer2μl，T4DNA連接酶2μl，去離子水補足體積20μl，10-13℃反應10h後轉至30℃水浴反應30min。
4.各取15μl連接產物進行細菌轉化。取200μl轉化混合物均勻塗布於含氨苄青黴素100μg/ml的90mm直徑瓊脂板上，37℃溫育過夜。分別挑取數個陽性克隆快速提取質粒，經單酶、多酶切鑑定分析，構建的質粒連接方向和連接位點正確，挑取含有正確重組質粒的轉化菌，大量提取質粒，-20℃保存。實施例2.pBV220-hHGFα重組質粒的構建。
1.克隆基因片段的製備用EcoR I、Xho I雙酶消化15μgPBSKS-HGF386、用BamH I、Xho I雙酶消化15μgPBSKS-HGF954，反應體積為100μl，電泳證實酶切完全後，用低熔點膠分別回收純化386bp、954bp兩個片段，調整DNA濃度為0.05μg/μl。
2.載體pBV220的製備用EcoR I酶切15μg質粒PBV220，電泳證實酶切完全後，回收純化3.66kb的線性片段。再以BamH I酶切此回收片段，37℃保溫3h後，低熔點膠回收純化3.66kb的線性片段。調整濃度為0.1μg/μl。
3.克隆基因片段與線性化載體pBV220的連接、轉化及陽性克隆的篩選建立15μl連接反應體系。將回收的386bp、954bp兩個片段與線性化載體pBV220以3∶3∶1摩爾比混勻，先在55℃水浴5min，置冰上冷卻後，加10×連接酶反應緩衝液1.5μl及T4DNA連接酶2.5μl，去離子水補足體積15μl，10-13℃反應16h，取10μl連接混合物進行細菌轉化。取200μl轉化混合物均勻塗布於含氨苄青黴素100μg/ml的90mm直徑瓊脂板上，37℃溫育過夜。分別挑取數個陽性克隆快速提取質粒，進行單酶、多酶切鑑定分析，連接位點和連接方向正確(圖3)。鑑定完成後，挑取含有正確重組質粒的轉化菌，大量提取質粒，-20℃保存。實施例3.pBV220-HGFα重組質粒轉化至大腸肝菌PLYSS1.感受態工程菌製備(以下步驟需在無菌條件下進行)a.用接種環分別從含有工程菌PLYSS的LB培養板上挑取單菌落，接種於含有5mL LB培養基的試管中，37℃160r/min振蕩培養4～6h，使工程菌生長至對數期OD值＝。b.將培養好的試管取出，迅速放在冰浴中(也可以放在0℃冰箱中)30min，0℃離心，5000r/min×15min，棄上清液。注意從此步驟開始要保持0℃，一定在實驗前製備足夠的冰。c.將上述離心好的工程菌用0.1mol/L CaCl2300μL(預冷)重懸，放置30min，離心(條件同上)，棄上清液。d.工程菌加60μL 0.1mol/L CaCl2(預冷)，混勻，分別標記感受態PLYSSα、感受態JM109、感受態pLysS，0℃放置，在12～24h內進行轉化。2.pBV220-HGFα轉化工程菌a.取感受態菌各兩管。b.其中一管加重組質粒(1μg/μL)1μL，另管加空質粒pBV220(2μg/μL)1μL作對照，輕輕指彈，使之混勻，在冰浴上放置30min。c.42℃水浴靜置90s。d.每管加LB培養基800μL，混勻，37℃水浴放置1h。e.將各管分別取200μL，平鋪於含氨苄青黴素(60μg/mL)LB瓊脂板表面。平放置20min後，倒置培養12h以上，待菌落形成後取出，0℃保存。實施例4.hHGFα蛋白質的表達和分離純化1)工程菌的轉化將構建正確的pBV220-hHGFα重組表達質粒用氯化鈣轉化方法轉化到大腸桿菌PLYSS中。菌種接種量2~4％(V/V)，採用改良的M9+LB培養基(以M9+LB培養基為基礎，經正交實驗設計出的最適細菌生長和蛋白表達的培養基利用正交實驗設計方法，以胰蛋白腖(5g/L)和NaCl(10g/L)為基礎培養基，將酵母提取物(A)、葡萄糖(B)、Na2HPO4/KH2PO4緩衝液(C)和氯化鎂(D)四種培養基成分按照L9(34)正交表安排9組實驗，用溫控誘導表達的方法，培養溫度30℃，誘導溫度42℃，讓陽性克隆菌株PLYSSα-hHGFα表達人肝細胞生長因子重鏈蛋白，SDS-PAGE(10％)分析表達產物(圖4)。
2)菌體破碎
(1)人肝細胞生長因子重鏈蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式存在，表達菌體的沉澱以1∶10比例重懸於緩衝液I(20mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，20％蔗糖，pH8.0)中，4℃靜置1h，4000r/min×10min，離心棄上清。
(2)將菌體沉澱以1∶10比例重懸於緩衝液II(20～50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，50～150mmol/L NaCl，1～4mmol/L CaCl2，0.1％Triton X-100)，加入1g/L溶菌酶，4℃消化1h後，冰浴超聲破菌，加入終濃度為0.2％脫氧膽酸鈉，6000-10000rpm×10min，離心取沉澱。
3).包涵體粗提取和純化(1)將沉澱充分重懸於緩衝液III中(20～50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，1～3mmol/L EDTA，0.2％Triton X-100)，靜置20-50min，條件同上，離心棄上清。用含有4mol/L尿素的緩衝液III洗滌沉澱，每次30min，直到上清無明顯變化為止。
(2)將包涵體沉澱溶於含8mol/L尿素，20～50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，10mmol/L DTT，1～3mmol/L EDTA的緩衝液中，10000rpm×10min，回收溶包上清，將上清放在透析袋內，以50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，1～3mmol/L EDTA，20μmol/LCuSO4的透析液攪拌透析24h。
4).凝膠過濾層析用Sephadex G 75裝柱(1.5×40cm)，柱床用1～3mmol/L EDTA，20～50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，溶液平衡，將透析後樣品直接上樣，蛋白濃度8mg/mL，洗脫液流速0.5ml/min；收集洗脫峰，SDS-PAGE鑑定目的蛋白所在峰。
5).陰離子交換層析填料POROS HQ平衡液50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，將目的蛋白所在峰的溶液濃縮後上樣，洗脫液50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0～3mmol/LNaCL梯度洗脫。收集洗脫峰，SDS-PAGE鑑定目的蛋白所在峰(圖5)。將含重組蛋白純度較高的收集液合併，用於復性。實施例5.rhHGF蛋白質的復性1.材料變性蛋白溶液5ml含8mol/L尿素，10mmol/L DTT，20mmol/L Tris·Cl pH8.0，蛋白濃度約5mg/ml；稀釋用變性液8mol/L尿素，20mmol/L Tris·CL，pH8.0；復性液0.8mol/L尿素0.1mmol/L氧化型穀胱甘肽，0.9mmol/L還原型穀胱甘肽，20mmol/L Tris·Cl pH8.0；透析袋截留分子量為3000道爾頓；試劑A(1)4％Na2CO3；(2)0.2mol/L NaOH；(3)1％CuSO4；(4)2％酒石酸鈉；使用前，將(1)、(2)、(3)、(4)試劑以50∶50∶1∶1的比例混合均勻，當天使用。試劑B酚試劑2.透析復性1)將8ml變性蛋白溶液加入到254ml稀釋用變性液中，攪拌混合。
2)稀釋後的變性蛋白溶液裝入預先處理過的φ10mm×90mm透析袋中，兩端用透析袋夾夾緊。
3)將透析袋放入一隻裝有0.5L復性液的燒杯中，4℃，攪拌透析8小時。
4)將透析袋取出，放入另一裝有0.5L復性液的燒杯中，4℃，攪拌透析10-15h。
5)將透析袋取出放入另一裝有0.5LTE緩衝液的燒杯中，4℃，攪拌透析10-15h。
6)將透析袋中溶液合併。
7)用低溫高速離心機，以10000r/min的轉速，4℃離心30分鐘。
8)上清用0.45μm的微孔濾膜過濾。濾液即可用於重組蛋白的生物學活性測定。實施例6 rhHGF蛋白質的活性測定1.培養成年大鼠肝細胞，細胞用含10％小牛血清、青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(100μg/ml)的DMEM培養基，按每孔100ul(細胞數1×104)
接種96孔板，37℃，5％CO2條件下培養18-20h。
2.每孔加0.1ml稀釋的待檢樣品，每個稀釋度8個重複孔，8個陰性對照孔，每孔加0.1ml含空載體工程菌(plyss-PBV220)提取物(用與rhHGFα同樣分離純化方法製備的提取物)，37℃，5％CO2條件下培養18-20h。
3.吸去培養液，每孔加0.1mlPBS和10ulMTT染液(5mg/ml溶於PBS中，濾過除菌)，在37℃，5％CO2條件下培養4-6h，每孔加0.1mlDMSO或酸化的10％SDS，用空白孔(不含肝細胞及HGF樣品的培養液)調零，在570nm處於酶聯檢測儀測OD值。以OD值每增加0.01定義為100個活性單位(U)。用HGF標準品(Sigma公司)10ng/mL作為陽性對照。
4.HGF標準品(Sigma公司)的活性為50U/ng；以此標化rhHGF樣品活性為18U/ng。
發明效果HGF一種能有效促進肝細胞損傷後有序再生的重要細胞因子。它在肝炎、肝硬化、肝癌等肝損傷的修復中起不可替代的作用。目前市場無此類作用藥物。近年來，國內外許多科研機構都致力於對HGF的開發和研製，但由於受到來源和相關技術的限制，一直未能投入生產。本實驗室曾申報rhHGF製備工藝(專利申請號 )，填補了國內外通過基因工程方法製備HGF的空白；rhHGFα是rhHGFα基因單獨表達的蛋白質因子，該因子經研究證實也具有促進肝細胞增殖的生物學活性，雖然其半衰期較rhHGF短，但由於其生產成本低，製作工藝簡單，簡化了rhHGF的生產過程，是有希望取代HGF治療各種肝病的蛋白質因子，rhHGFα及其製備工藝從理論和實踐上解決了肝因子的來源問題，為廣大的肝病患者帶來了福音，同時也為進一步研究和開發其它基因工程藥物提供了一種新思路和新方法。
圖1-重組人肝細胞生長因子rhHGFα製備技術路線；圖2-pBSks-HGF386、pBSks-HGF954亞克隆質粒構建圖；圖3-表達質粒pBV220-HGFα構建示意圖；
圖4-plyss-rhHGFα的SDS-PAGE結果其中1-plyss-pBV220 42℃誘導2-plyss-rhHGFα42℃誘導前3、4-plyss-rhHGFα42℃誘導圖5-rhHGFα陰離子過濾色譜圖110待定120重組人肝細胞生長因子rhHGFα的製備方法160121012111512212DNA213人220221CDS222(6)...(1511)22340011 aattcatgcc agcactgaag ataaaaacca aaaaagtgaa tactgcagac caatgtgcta61 atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt tttgataaag301 caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg aaaaaagaat361 ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc atcattggta421 aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa tgtcagccct481 ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc541 tacaggaaaa ctactgtcga aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa601 gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca661 tgacctgcaa tggggagagt tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt721 gtcagcgctg ggatcatcag acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg781 acaagggctt tgatgataat tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct841 atactcttga ccctcacacc cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata901 ctatgaatga cactgatgtt cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag961 gctacagggg cactgtcaat accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc1021 agtatcctca cgagcatgac atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa1081 attactgccg aaatccagat gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca1141 tccgagttgg ctactgctcc caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt1201 atcgtgggaa tggcaaaaat tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat1261 gttcaatgtg ggacaagaac atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg1321 caagtaagct gaatgagaat tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt1381 gctacacggg aaatccactc attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg1441 ataccacacc tacaatagtc aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac1501 aattgcgata ag
權利要求
1.一種重組人肝細胞生長因子rhHGFα的製備方法，其特徵是對hHGFα基因進行克隆，單獨構建HGFα鏈原核表達體系，獲得具有生物學活性的rhHGFα因子，具體步驟包括構建pBV220-rhHGFα表達質粒；轉化plyss宿主菌；表達、分離純化rhHGFα蛋白質；對rhHGFα進行復性。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFαcDNA序列的相應表達載體質粒，含有與所述rhHGFαcDNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的表達載體，但不限於pBV220、pET、pMR等載體。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFαcDNA序列的相應表達載體質粒，含有與所述rhHGFαcDNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的相應宿主細胞，但不限於細菌、酵母細胞、昆蟲以及哺乳動物細胞。
4.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵是用氯化鈣轉化法將pBV220-hHGFα轉化到大腸桿菌plyss中，構建得到plyss-hHGF工程菌。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFα蛋白質的表達系採用改良的M9+LB作為培養基，經正交實驗設計出的最適合細菌生長和蛋白表達的培養基成分，即胰蛋白腖5g/L、NaCl 10g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖2g/L、Na2HPO4/KH2PO450mmol/L。在菌種接種量2～4％(V/V)條件下，採用溫控誘導的方法誘導rhHGFα表達，即30℃培養5h，42℃誘導表達5h。
6.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFα包涵體的提取中菌體的破碎，關鍵之一在於超聲前先用1mg/mL溶菌酶消化菌體一定時間，再使用超聲法，破菌效果比單獨使用超聲法要好，然後再用機械法即可提高細胞的破碎率；關鍵之二在於用溶菌酶破菌之前加入濃度為20％的蔗糖，包涵體的回收率從10％提高到13％，而且使細菌破碎更加完全，並提高包涵體的回收率，為下一步復性處理奠定基礎。
7.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFα蛋白質的分離純化是將提取的包涵體用8mol/L尿素變性處理後，12000rpm離心取上清，用凝膠過濾層析和離子交換層析分離純化蛋白，凝膠過濾層析填料為Sephadex G-75，柱子規格1.5×40cm，柱床用3mmol/L EDTA，40mmol/L Tris-Cl，8mol/L的尿素，pH7-8的緩衝液平衡，將變性上清上樣，用平衡緩衝液洗脫，SDS-PAGE鑑定目的蛋白所在峰，收集洗脫液，用聚乙二醇濃縮；陰離子交換層析用POROS HQ為填料，利用HPLC系統，進一步分離rhHGFα，平衡液50mmol/L Tris-Cl，pH7-8；洗脫液50mmol/L Tris-Cl，pH7-8，0～3mmol/LNaCL梯度洗脫，收集目的蛋白所在峰，濃縮洗脫液後，0.22μm濾膜除菌後，冷凍乾燥分裝。
8.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是rhHGFα蛋白質的復性，使用的變性蛋白溶液含8mol/L尿素，10mmol/L DTT，20mmol/L Tris·Cl pH8.0，蛋白濃度約5mg/ml；
9.根據權利要求1或8所述的製備方法，其特徵是rhHGFα蛋白質的復性，稀釋用變性液含8mol/L尿素，20mmol/L Tris·CL，pH8.0；；復性液含0.8mol/L尿素0.1mmol/L氧化型穀胱甘肽，0.9mmol/L還原型穀胱甘肽20mmol/L Tris·Cl pH8.0；
10.根據權利要求1、8或9所述的製備方法，其特徵是rhHGFα蛋白質的復性，使用試劑A(1)4％Na2CO3；(2)0.2mol/L NaOH；(3)1％CuSO4；(4)2％酒石酸鈉；使用前，將(1)、(2)、(3)、(4)試劑以50∶50∶1∶1的比例混合均勻，當天使用；試劑B酚試劑。
全文摘要
本發明公開了一種重組人肝細胞生長因子rhHGFα的製備方法，該方法是通過單獨構建hHGFα鏈的原核表達體系表達具有活性的rhHGFα因子，經過活性測定rhHGFα具有促進肝細胞增殖的活性，與rhHGF因子相比，rhHGFα除半衰期較短外，具有生產成本低廉、生產工藝簡單、產量高的優點，特別是以單獨的rhHGFα因子代替了完整的rhHGF，與真核表達體系相比，該方法操作簡單，容易放大，所製備的rhHGFα是代替rhHGF治療各種肝病的理想藥物，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K14/435GK1401784SQ0211782
公開日2003年3月12日 申請日期2002年5月22日 優先權日2002年5月22日
發明者牛勃, 楊濤, 向前, 胡曉年, 解軍, 常冰梅, 楊琦, 張悅紅, 閻佔清, 郭勇 申請人:山西生物治療中心, 四川漢龍高新技術開發有限公司