使用雙方向多聚合酶Ⅲ啟動子來表達小核糖核酸的製作方法
2023-06-07 06:47:06
專利名稱：使用雙方向多聚合酶Ⅲ啟動子來表達小核糖核酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及RNA多聚合酶III啟動子，更進一步講它涉及雙方向的RNA多聚合酶III啟動子，該啟動子指導短的RNA序列表達，如用於沉默基因的RNA序列表達。
背景技術：
RNA多聚合酶(以下稱作多聚合酶III)啟動子用來表達不同的基因已經使用多年。由於U6和H1多聚合酶III啟動子的特性很多人選擇它們用來表達短的RNA序列，這些序列可以減少或「沉默」真核細胞的基因表達。這種用來沉默基因短的RNA序列通常有髮夾結構。這種結構導致了一個雙鏈區，具有這種短的RNA序列被稱作短髮夾RNA幹擾序列(shRNAi)。本文將使用名詞「短RNA序列」，它的意思不僅包括了shRNAi序列，還包括了長度大致在300個核苷酸的RNA序列。如反義的序列和核酶等。使用U6和H1啟動子存在如下幾個主要問題，(1)這些啟動子只能表達一個短的RNA序列；(2)這些啟動子在不同的細胞內表達效率不同；(3)如果需要使用一個以上的按順序排列的多個啟動子來表達多個短的RNA序列時，這些重複的序列就會引起載體的不穩定，最終導致表達終止。
發明內容
本發明是高效、快速、節省成本的產生短的RNA序列的方法。由於已知的多聚合酶III啟動子存在的上述缺陷，本發明提供了一個新的雙方向的多聚合酶III啟動子來指導短的RNA序列在真核細胞內的表達。每一個雙方向的多聚合酶III啟動子可以指導兩個短的RNA序列表達。當需要表達一個以上的短的RNA序列時，雙方向的多聚合酶III啟動子就會提高表達的效率和效力。雙方向的多聚合酶III啟動子與以前任何傳統的單個多聚合酶III啟動子或單方向多個串連的多聚合酶III啟動子相比具有更多優點。
為此本發明所提供的多聚合酶III啟動子具有兩個控制成分。其中一個控制成分指導一個方向的短的RNA序列的轉錄，另一個控制成分被加到相反的方向來指導另一個方向的短的RNA序列的轉錄。本文對本發明的雙方向的多聚合酶III啟動子的構成進行了描述。
雙方向的多聚合酶III啟動子由以下部分構成(1)一個完整的多聚合酶III啟動子，其中包括了3種控制成分TATA序列、一個近端序列成分(PSE)和一個遠端序列成分(DSE)。(2)一個被加到第一個完整啟動子DSE相反方向5末端的基本啟動子，此基本啟動子僅包括了一個TATA序列和一個近端序列成分。這樣就使兩個傳統的無方向的多聚合酶III啟動子(U6和H1啟動子)被變成雙方向的啟動子。
本文也描述了一種質粒的組成成分，其中包括了一個或多個雙方向多聚合酶III啟動子，這些成分利於質粒在細菌和真核細胞內的繁殖。
本發明包括了一種腺性病毒的組成成分，其中包括了一個或多個雙方向多聚合酶III啟動子，這些成分利於病毒在真核細胞內的繁殖。
本發明還提供了指導兩個或更多不同的短的RNA序列構成的載體的表達方法，此載體包括了一個或多個指導短的RNA序列轉錄的雙方向的多聚合酶III啟動子。
本發明公開了沉默兩個或多個基因表達的方法，此方法包括了在一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子指導下的兩個或者多個短的RNA序列的表達。
本發明描述了提高表達短的RNA序列數目的方法，這種表達是用含有一個或者多個雙方向多聚合酶III啟動子的單個載體來完成的。
本發明也公開了使用一種含有雙方向RNA多聚合酶III啟動子的載體來研發治療人類和其他動物疾病藥物的一種方法。
本發明包括了使控制成分體積最小化的方法，這些由一個或者多個雙方向多聚合酶III啟動子組成的控制成分可以指導短的RNA序列的轉錄。
本文公開了一種便利構建載體的試劑盒，這種含有一個或者多個雙方向多聚合酶III啟動子的載體可以有效表達一個或者多個短的RNA序列。
以上內容描述了本發明的重要特徵，其他特徵將在後續部分逐一介紹。
本發明的目的包括如下內容(1)提供雙方向多聚合酶III啟動子克服了以前傳統的多聚合酶III啟動子的缺點。
(2)提供雙方向U6多聚合酶III啟動子指導兩個不同的短的RNA序列表達。
(3)提供了一種含有一個或者多個雙方向多聚合酶III啟動子的單個載體來表達多個短的RNA序列的方法，這種表達是在調控成分指導下進行的。
(4)提供了一個雙方向多聚合酶III啟動子，該啟動子比傳統的多聚合酶III啟動子在沉默基因表達方面更為有效，因為它可以同時表達多個短的RNA序列來攻擊一個基因中的不同區域。
(5)降低了使用單個短的RNA序列來沉默基因表達效果所遇到的不確定性，因為本發明的載體可以同時表達多個短的RNA序列。
(6)使用協調的方式可以沉默兩個或多個基因的表達，因為一個含有雙方向多聚合酶III啟動子的單一載體可以同時表達多個短的RNA序列。
(7)由於最小化了雙方向多聚合酶III啟動子的體積，因此它可以被插入到任何載體中，特別是那些有體積限制的載體，如腺性相關病毒和慢病毒等。
(8)提供一個雜交的很少或沒有重複序列的雙方向多聚合酶III啟動子以使轉錄活性達到最大化。
具體實施例方式
RNA多聚合酶III啟動子(比如U6和H1)可能適合用來表達單個的短RNA序列，但它們並不適合用於表達兩個以上的短RNA序列。表達多個短RNA序列可以用本發明的雙方向多聚合酶III啟動子來完成。本發明所描述的雙方向多聚合酶III啟動子與傳統的概念和設計有顯著的差別。新構建的啟動子使得雙方向多聚合酶III啟動子的每一個方向都可用於表達短RNA序列。
據估計在最適合的條件下，U6和H1啟動子可以表達多達40000個RNA轉錄子在一個細胞中。這樣的基因表達水平足以有效地抑制特異基因的表達(Tuschl，T，2002，Nat.Biotechnol.，48446-448)。但是目前選擇有效的shRNA序列是一個令人頭痛的問題。有一些規則可以幫助人們選擇有效的shRNA序列。但即使使用複雜的電腦程式也不能夠保證選擇的每一個shRNA序列有效地沉默基因的表達。很顯然選擇shRNA序列的效率是變化不定的，完全依賴人們的經驗。目前有數個公司提供4個一套的合成RNAi序列，每個RNAi序列可攻擊一個基因的不同區域用以提高有效沉默基因的可能性。此策略大大地降低了檢測有效RNAi序列所需的時間和費用。
U6和H1啟動子一直用於表達反義RNA，最近它們又被用於表達沉默基因shRNA。基因沉默技術比如合成的RNAi和載體表達的shRNA已經成為研究基因功能的重要工具，這些技術已廣泛用於功能基因組和藥物靶標的鑑定等。進一步地這些技術對於治療重要人類疾病如愛滋病、肝炎、癌症、發炎疾病和代謝失調等有巨大地應用前景。
本發明地啟動子由如下成分組成(1)一個完整的多聚合酶III啟動子，其中包括了3種控制成分TATA序列、一個近端序列成分(PSE)和一個末(遠)端序列成分(DSE)。(2)一個僅包括PSE和TATA序列的基本多聚合酶III啟動子。這樣的基本啟動子可以被連接到完整多聚合酶反方向的5末端。TATA序列是多聚合酶III特性的主要決定體，它常常定位於轉錄起始點上遊第20-30核苷酸地位置上，PSE則常常位於轉錄起始點上遊第45-66核苷酸處。DSE可提高基本多聚合酶III啟動子的活性。U6啟動子的DSE通常定位於轉錄起始點上遊190-260個核苷酸處。H1啟動子的PSE緊連著DSE序列。本發明提供兩個雙方向的啟動子作為例子，它們被稱為雙方向U6和雙方向H1。
圖1描述的是現在發明的雙方向多聚合酶III啟動子。
圖2是人類雙方向U6啟動子的核苷酸序列。
圖3是人類雙方向H1啟動子的核苷酸序列。
圖4描述了一種用於檢測雙方向U6啟動子的質粒特徵。
圖5對照比較了雙方向U6啟動子正方向和反方向表達的短RNA序列沉默一種報導基因的效果。
圖6描述了一種用於檢測雙方向H1啟動子的質粒特徵。
圖7對照比較了雙方向H1正反兩方表達的短RNA序列沉默一種報導基因的效果。
圖8對照比較了雙方向H1和U6啟動子正反兩方表達的短RNA序列沉默一種報導基因的效果。
圖中描述的兩個雙方向多聚合酶III啟動子可以單個使用，也可以結合起來一併使用表達多個短RNA序列。這些圖僅代表了一類多聚合酶III啟動子。U6和H1屬於此類多聚合酶啟動子。它們可以區別於其他的多聚合酶III啟動子的特徵在於它們的控制成分位置。它們的控制成分位於轉錄序列之外，U6和H1的雙方向特徵描述於圖1。每一個雙方向啟動子由以下部分組成(1)一個完整的傳統的無方向的多聚合酶III啟動子，它含有3個外部控制成分一個DSE，一個PSE和一個TATA序列。(2)一個基本多聚合酶III啟動子，它包括了一個PSE和一個TATA序列。基本多聚合酶啟動子被連接到完整啟動子的DSE反方向5末端上。TATA序列是基本的多聚合酶結合區域，也可以被TATA結合蛋白質所認識。SNAPs與PSE的相互關係保持了TATA結合蛋白質與TATA序列形成的結合體的穩定性，為了達到多聚合酶III啟動子全部活性，PSE存在也是必要的(Murphy等.1992.Mol.Cell Biol.123247-3261，.Mittal等，1996 Mol.Cell Biol.161955-1965；Ford等，1997，JBC，27216048-16055；Frod等，1998，GenesDev.，123528-3540；Hovde等，2002，Genes Dev，162772-2777.)。轉錄成分Oct-1和DSE相互作用將提高轉錄活性100倍(Kunkeland Hixon，1998，Nuk.Acid Res.261536-1543)。由於正反方向定位的基本啟動子可指導雙鏈DNA模板相反鏈的轉錄，反方向定位的基本啟動子的正鏈被連到DSE的負鏈5末端上。連續的4-5個胸腺嘧啶(T)序列可結束U6和H1啟動子的轉錄活性。
圖1表明U6和H1啟動子有相似的基本結構，但是它們的PSE和DSE構成並不相同。H1啟動子有非常緊湊的結構，它的DSE很靠近PSE和TATA序列Myslinski等，2001，Nucl.Acid Res.292502-2509)。而U6啟動子的DSE則與PSE和TATA序列有150個核苷酸的距離，當我們構建反方向的基本啟動子的時候，這樣的空間距離被保留下來。圖2描述詳細的結構。圖3描述了一個雜交的H1啟動子，一個基本的U6啟動子被連接到H1的DSE反方向的5末端。這樣的結構有利於保持H1啟動子的緊湊結構。為了便於構建雙方向的H1啟動子，一個小的片斷序列被插入基本U6啟動子和H1啟動子之間。令人滿意的轉錄結果指明多聚合酶III的DSE和PSE之間的距離並不是一個影響啟動子轉錄的關鍵因素。
本發明進一步表明雙方向的多聚合酶III啟動子不僅可以單獨使用，而且也可以和多個雙方向或者傳統無方向的多聚合酶啟動子一起使用。
試驗一為了演示正反兩方向的轉錄活性，雙方向的U6啟動子被插入到一個質粒中。圖4表明其結構除了雙方向的啟動子外，該質粒含有4個不同限制酶切點，以便於分別在正反兩個方向插入兩個寡核苷酸片斷。我們進一步構建了兩個指導shRNAi序列轉錄的寡核苷酸片斷。這兩個片斷被設計用於沉默一種報導基因(β-半乳糖苷酶)的表達。一個片斷末端含有限制酶Bgl II和Not I切點，以便於插入啟動子的正方向，另外一個片斷末端則含有限制酶BsaI和SpeI切點便於連接到啟動子的反方向。兩個構建的質粒被稱為雙方向U6F和雙方向U6R。雙方向U6F指導正方向的短RNA序列表達，而雙方向U6R則指導反方向的短RNA序列的表達。在人類HEK239細胞測試中雙方向的U6F和U6R大大減少報導基因(β-半乳糖苷酶)的表達水平(圖5)。這一結果表明雙方向U6啟動子可以有效指導正反兩個方向的短RNA序列的轉錄。
試驗二相同策略也被用於檢測雙方向的H1啟動子。在這個試驗中，我們構建了兩個質粒(稱作雙方向H1F和雙方向H1R)詳細的結構見圖6。兩個指導shRNAi序列轉錄的多聚核苷酸片斷被合成，然後插入雙方向H1啟動子的正反兩個方向，正方向的片斷含有限制酶NcoI和ClaI切點。而反方向片斷含有限制酶XhoI和BamHI切點。用人類HEK239細胞試驗結果表明β-半乳糖苷酶的活性可以被表達的RNAi所抑制。圖7表明了我們的試驗結果。從圖中可見雙方向的H1F和H1R顯著減少報導基因β-半乳糖苷酶的表達水平。這一結果也證明了雙方向H1啟動子可以有效指導正反兩個方向的短RNA序列的轉錄。
試驗三為了進一步檢查雙方向多聚合酶III啟動子的效果，我們構建了四種含有同樣短RNA序列的質粒。此短RNA序列被分別連接到雙方向U6和H1的正反方向啟動子上，建成了4個新的質粒，這些質粒稱作U6F，U6R，H1F和H1R。這些質粒被轉入小鼠Mlcar細胞中，結果表明所有4種質粒都能顯著地沉默報導基因β-半乳糖苷酶的表達(圖8)。這一結果進一步證明了雙方向U6和H1可以有效指導正反兩個方向的短RNA序列表達。
權利要求
1.一種雙方向的RNA多聚合酶III啟動子，包含在一個方向指導短RNA序列轉錄的控制成分和其他指導另一個方向短RNA序列轉錄的控制成分。
2.一種含有有一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子的質粒和其他有利於在細菌和真核細胞中繁殖的成分。
3.一種含有一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子的腺病毒及其他便於在真核細胞繁殖的成分。
4.一種指導兩個或多個不同的短RNA序列表達方法其中包含有能指導短RNA序列表達的一個或多個雙方向雙方向RNA多聚合酶III啟動子的載體。
5.權利要求4方法中的載體包括質粒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒。
6.權利要求4方法中包含了無方向的啟動子。
7.權利要求6方法中表達的短RNA序列數目是2、3和4個。
8.一種沉默兩個或多個基因表達的方法，其中含有一個和多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子指導下表達兩個或多個短RNA序列。
9.權利要求8方法中的載體包括質粒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒。
10.提高表達短RNA序列數量的方法，這種提高表達是用同一種單個含有一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子載體來完成的。
11.權利要求10方法中的載體包括質粒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒。
12.使用含有雙方向RNA多聚合酶III啟動子的載體來研發治療人類和其他動物疾病藥物的方法。
13.權利要求12方法中的載體包括質粒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒。
14.最小化控制成分長度的方法，這些控制成分子包括一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子和指導短RNA序列的轉錄的序列。
15.構建載體的試劑盒，這些載體含有一個或多個雙方向RNA多聚合酶III啟動子和指導兩個或多個短RNA序列的表達。
16.權利要求15項試劑盒中的載體包括質粒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒。
全文摘要
本發明是高效、快速、節省成本的生產短RNA序列的方法。本發明也提供了一個新的雙方向的RNA多聚合酶啟動子來指導短RNA序列在真核細胞內的表達。這些啟動子具有兩個控制成分，其中一個控制成分指導一個方向的短RNA序列轉錄，當需要表達一個以上的短RNA序列時，雙方向的RNA多聚合酶III啟動子就會大大提高表達的效率和效力。因此，它比任何傳統單個多聚合酶III啟動子或單方向多個串連的多聚合酶III啟動子更具先進性和更多優點。
文檔編號C12N15/63GK1624134SQ200310117110
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者羅科, 杜鴒, 彼特·弗裡克 申請人:羅科, 杜鴒