生產脫膠的脂肪酸烷基酯的製作方法

2023-06-07 11:43:46 2

專利名稱：：生產脫膠的脂肪酸烷基酯的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生產脫膠的(degummed)脂肪酸烷基酯，即其中雜質(如磷月旨)含量降低的脂肪酸烷基酯的筒化方法。該方法包括通過在一溶液中使用一種或多種脂解酶和一種或多種磷脂酶將脂肪和油轉變成脂肪酸烷基酯。
背景技術：
：生物柴油，其通常被分類為源自植物或動物脂肪和油的脂肪羧酸的烷基酯，近來由於其環境裨益而變得越來越具有吸引力。雖然生物柴油目前用化學方法通過酯基轉移作用成功生產(例如使用NaOH和/或曱醇鈉(sodiummethoxide)作為催化劑)，有若干相關問題限制了其發展，例如由於高含量的游離脂肪酸而需對油進行預加工、從酯和甘油相中除去化學催化劑、在甘油回收過程中除去無機鹽、和在酯基轉移步驟之前降低磷脂含量。通過使用脂解酶作為催化劑很大程度上防止了化學催化劑帶來的缺點，近年來人們已經對使用脂肪酶、並在酯基轉移作用中進行或不進行固定化來生產生物柴油發生興趣。真菌酯酶可以用於酯的酶促生產，在此方法中其可代替催化劑，如無機酸(例如硫酸、氯化氫和氯磺酸)，I、II、III和IV族金屬的兩性氫氧化物，和其它。現有技術已描述了酶在酯合成中的用途，特別是根據酶命名法(國際生物化學與分子生物學聯盟命名委員會的建議，1992或更遲)歸類於EC3.1.1羧酸酯水解酶的酶。WO88/02775公開了來自CawWda的脂肪酶A和B。其說明Caw&daa"torc"ca脂肪酶B(CALB)對酯合成更有效。角質酶是能夠水解底物角質的脂解酶。角質酶已知來自各種真菌(P.E.Kolattukudyin"Lipases",Ed.B.Borgstr6mandH.L.Brockman,Elsevier1984，471-504)。來自特異腐質黴(/fw附/co/fl/rao/em)的角質酶的胺基酸序列已公布(US5,827,719)。許多研究者報導說，在有機溶劑存在下可達到烷基酯的高產量，但是由於有機溶劑的毒性和可燃性，更希望在無溶劑的介質中進行脂肪酶催化的醇解(alcoholysis)。已顯示由脂肪酶催化的甲醇分解在不含有機溶劑的含水系統中發生。在這樣的系統中，對曱醇較不敏感的脂肪酶是有利的(Kaiedaetal.J.Biosci.Bioeng.2001，91:12-15)。眾所周知，過量短鏈醇例如曱醇可4吏脂肪酶嚴重失活。然而，為了將油完全轉變成其相應的曱基酯，至少需要三摩爾當量的曱醇。Du等(Biotechnol.Appl.Biochem.2003，38:103-106)比較地研究了油/曱醇摩爾比在不連續分批和連續分批操作過程中的效應。為了防止脂肪酶失活，通過在整個反應過程中逐步添加曱醇來保持曱醇低濃度(Shimadaetal.JMol.CatalysisEnzymatic,2002，17:133-142;Xuetal.2004,Biocat.Biotransform.22:45-48)。在EC3丄1.3中定義的真菌脂肪酶可被用於甘油三酯的醇解，並代替鹼性化學催化劑，例如曱醇鈉或氫氧化鉀。Bouturetal.(J.Biotechnol.1995，42:23-33)報導了來自Cam^^de/wmara的脂肪酶，其能催化甘油三酯(TG)的醇解和游離脂肪酸(FFA)的酯化，但二者不是在相同的反應條件下。在Bouturetal.描述的條件下，僅酯化得到催化。為了能夠更經濟地生產脂肪酸烷基酯用於生物柴油，需要更簡單和集成的過程，使脂肪和油更快地轉變成其相應的曱基或乙基酯，在所述轉變過程中有更高產率，並將工藝設備所需的投資減到最少。此外，通過對含程中得到的脂肪和油含有雜質，例如主要由磷脂、以及脂肪酸、色素(pigment)、氣味成分等組成的極性脂質。需要通過精煉過程除去這些雜質，所述精煉過程可能需要脫膠步驟。使用各種物理和化學方法來使油脫膠(如Bochisch,M.在FatsandOilsHandbook,AOCSPress,1998，p.428-433所描述的)。本領域已知使用磷脂酶用於食用油的酶促脫膠(US5,264,367;JP-A-2153997;和EP622446)，以降低所述水脫膠的油中的磷含量。酶促脫膠條件在Clausen,KinEur.J.LipidSci.Technol.103(2001)，333-340中描述。關鍵步驟是檸檬酸處理、將pH調節至大約5.0、添加酶和使用高剪切混合器進行混合。發明概述本發明涉及生產具有低雜質水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述雜質例如磷脂。本發明的方法通過將兩個加工步驟組合成一個單一加工步驟而得以簡化，因此在經濟上更便宜。所述方法包括混合水、醇、甘油三酯和/或游離脂肪酸，以及一種或多種脂解酶和選自A,、A2、B型和溶血磷脂酶的一種或多種磷脂酶。隨後將含有甘油、殘餘的酶和大多數被水解的磷脂的水相與非水相分離，由此降低非水相中的磷脂含量。脂解酶和磷脂酶在同一混合物中的組合允許從甘油三酯和/或游離脂肪酸中快速、簡便和高產率地生產磷降低的脂肪酸烷基酯。本發明的方法的混合物在水相中具有相對高的醇濃度。如上所述，這對於由脂肪酶進行的酯基轉移作用(transesterification)而言是有利的。在現有技術中，已報導了微生物褲脂酶在高濃度有機溶劑中相對不穩定(參見Songetal,BiochemicaetBiophysicaActa,1547(2001)370-378)。因此，令人驚訝的是，在本發明方法中的酶促脫膠步驟(通過磷脂酶進行的磷脂酶促水解)與通過脂肪酶所進行的酯基轉移作用在相同條件下發生。此外，本發明涉及如上所述使用脂解酶和磷脂酶生產磷降低的脂肪酸烷基酯的分批方法或連續、分階段的方法，其中連續或逐步加入醇，並且其中酶被回收或僅使用一次。此外，酶可被固定在二氧化矽;朱上，或游離在溶液中。應該強調的是，本發明的方法所生產的脂肪酸烷基酯不單單用於生物柴油，也可用作石油化學工業更下遊過程中的基本石油化學產品。磷降低的短語"磷降低的"指含磷成分(如磷月旨)的含量被降低。非水相中的不能水合的磷脂被磷脂酶水解，並轉變成能水合的磷脂，其隨後被從油相提取入水相。脂肪相中的磷含量通過Clausen,KinEur.J,LipidSci.Technol.103(2001)，333-340中描述的方法測量。根據本文的實施例，其為24小時反應時間後的P值。因此，本發明的磷降低的脂肪酸烷基酯含有不超過500ppm的磷，優選不超過200ppm的磷，更優選不超過100ppm的磷，更優選不超過75ppm的磷，更優選不超過50ppm的磷，更優選不超過^ppm的磷，更優選不超過30ppm的磷，更優選不超過25ppm的磷，更優選不超過20ppm的磷，更優選不超過15ppm的磷，更優選不超過10ppm的磷，甚至更優選不超過5ppm的石岸，最Y尤選不超過lppm的石壽。發明詳述本發明涉及生產具有低雜質水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述雜質例如磷脂。本發明的方法通過將兩個加工步驟組合成一個單一加工步驟而得以簡化，因此在經濟上更便宜。所述方法包括混合水、醇、甘油三酯和/或游離脂肪酸，以及一種或多種脂解酶和選自A,、A2、B型和溶血磷脂酶的一種或多種磷脂酶。隨後將含有甘油、殘餘的酶和大多數被水解的磷脂的水相通過靜置、過濾或離心與非水相分離，由此降低非水相中的磷脂含量。底物根據本發明用來生產脂肪酸烷基酯的合適底物為多種多樣的植物油和脂肪；油菜籽油和大豆油是最常用的，雖然其它農作物例如芥菜(mustard)、向日葵、芸苔(canola)、椰子、大麻(hemp)、棕櫚的油和甚至藻類也顯示出應用前景。底物可以是粗製的、或水脫膠品質的、或進一步加工的(精煉的、漂白的和除臭的)。也可使用動物脂肪，包括牛脂(tallow)、豬油(lard)、家禽、海產油(marineoil)以及廢棄的植物和動物脂肪和油，通常稱為黃色和棕色油脂。合適的脂肪和油可以是純甘油三酯，或在廢棄的植物油和動物脂肪中常見的甘油三酯和游離脂肪酸的混合物。底物也可獲自植物油除臭劑蒸餾物。底物中的脂肪酸類型包括那些在植物和動物脂肪和油中作為甘油酯天然存在的那些。僅舉幾例，這些包括油酸(oleicacid)、亞油酉吏(linoleicacid)、亞麻酉交(linolenicacid)、才宗才閣&復(palmeticacid)牙口月才圭酉臾(lauricacid)。粗製植物油中的次要成分典型地是磷脂、游離脂肪酸和偏甘油酯(partialglyceride)，即單酸甘油酯和甘油二酯。在本文中使用時，短語"脂肪酸殘基，，指脂肪酸，其或者是游離的，或者如在甘油三酯、甘油二酯、單酸甘油酯或脂肪酸烷基酯中是酯化的。原油中的磷脂含量可為0.5-3%w/w不等，相應於磷含量在200-10,000ppm的範圍，更優選在250-1200ppm的範圍。除磷脂外，原油還含有低濃度的碳水化合物、糖化合物和Ca、Mg和Fe的金屬/磷脂酸複合物(metal/phosphatideacidcomplexes)。生物柴油脂肪酸烷基酯，例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯也被稱為生物柴油，因為它們被用作化石柴油(fossildiesel)的添加物。因為生物柴油生產自可更新的資源，其構成基於石油(fossiloil)的柴油燃料的曰益重要的添加物或代替物。藍用於本發明方法的醇優選為具有1-5個碳原子(d-C5)的低級醇。優選的醇是曱醇和乙醇。脂解酶本發明方法的脂解酶可以是選自來自下組的脂解酶和脂解酶變體的一種月旨角罕酶C朋d/(iaflwtorc"ca、//j^/202ywas;.、近平滑念J朱菌(C""d/(ia/^ra/z577os7'力、鈹落念王朱菌(Ca"(i/(iflrwgcwa)、洋蔥j叚單月包菌(i^ew/omowcwcepac/a)、白i也黴(Geo^'cwmcawd/t/wm)、曼赫才艮毛黴(W/z/zcw7wcorw/e/e/)、隱J求菌屬菌種(CV7toc0ccMspp.)S陽2、近平滑念3朱菌、特異腐質黴(7/謂/co/az>wo/e—和糹田毛嗜熱黴(77ze渭麵^yc&y/a"wg7.wos^)(以前稱為疏棉狀腐質黴(//"照'0^/0"^/"0^))。所述脂解酶包括脂肪酶、角質酶和醯基轉移酶，並可與選自由上述菌種組成的組的脂解酶具有60%同一性。優選地，本發明的方法的脂解酶與選自由上述菌種組成的組的脂解酶具有70%同一性，更優選75%同一性，更優選80%同一性，更優選85%同一性，更優選90%同一性，更優選95%同一性，甚至更優選97或98%同一性，或最優選99%同一性。優選的脂解酶是根據WO00/60063的細毛嗜熱黴(以前稱為疏棉狀腐質黴))脂肪酶變體、親本細毛嗜熱黴脂肪酶和C""&Wa朋torc/7,ca月旨肪酶B。另一方面，本發明包括兩種不同的脂解酶，其中第一種脂解酶的特徵在於與游離脂肪酸相比其對甘油三酯顯示出更高活性，而第二種脂解酶與甘油三酯相比對游離脂肪酸顯示出更高活性。因此，將第一種脂解酶定義為對甘油三酯的活性(測量為甘油三酯變為脂肪酸烷基酯的轉化率)與對游離脂肪酸(FFA)的活性(測量為FFA變為脂肪酸烷基酯的轉化率)的比率在0.2以下的脂解酶。將第二種脂解酶定義為對甘油三酯的活性(測量為甘油三酯變為脂肪酸烷基酯的轉化率)與對FFA的活性(測量為FFA變為脂肪酸烷基酯的轉化率)的比率在0.5以上的脂解酶。磷脂酶優選地，用於本發明的方法的磷脂酶(PL)為荻自微生物的磷脂酶，所述微生物優選絲狀真菌、酵母、或細菌，並選自A!、A2、B型磷脂酶和溶血石舞月旨酶(lyso-phospholipases)。就本發明而言，如本文中所使用的，術語"獲自"連同具體的微生物來源是指酶和由此編碼所述酶的DNA序列是由該具體來源產生的。酶因而通過標準的已知方法從所述具體來源獲得，以使本領域技術人員能獲得包含酶的樣品，並能用於本發明的方法。所述標準方法可以是從所述具體來源直接純化，或克隆編碼所述酶的DNA序列，然後在相同來源(同源重組表達)或在不同來源(異源重組表達)中重組表達。更優選地，用於本發明方法的磷脂酶獲自鐮孢屬(i^san'Mm)內的絲狀真菌菌種,例長口大刀鐮孑包cw/worwm)、異孑包鐮孑包(FwsaWww/zeferas^oram)、腐皮鐮孑包(Fi^ar/wmso/"m-)的菌才朱,或尤其是尖鐮孑包(Fwsan'wmra:，/www)的菌牙朱；或麴黴屬(Aperg/〃w)內的絲狀真菌菌種，例如泡盛麴黴C^/wg/〃wawamo",)、臭麴黴(J^sperg〃/ws^e/7'(iM力、日本麴黴(^5perg7'〃Ms乂apom'CM力、黑麴黴(y^pwgi〃z""扭r)或尤其是米麴黴(/^/ew7/w^w少z"e)的菌抹。合適的鐮孢屬磷脂酶的實例公開於1)Tsung-Cheetal.(Phytopathologicalnotes58:1437-38(1968))(來自腐皮鐮孑包CF^ar/wmso/am')的石舞月旨酶)；和2)歐洲專利申請No.97610056.0,其披露了合適的大刀鐮孢磷脂酶(參見該文件的實施例18)和合適的尖鐮孢磷脂酶(參見實施例1-17)。合適的麴黴屬磷脂酶公開於3)EP575133,其披露了多種不同的麴黴屬磷脂酶(參見權利要求14),並特別是來自米麴黴(Awyzae)的磷脂酶(權利要求17或18)和來自黑麴黴(Am'ge。的磷脂酶(權利要求19);和4)DE19527274A1，其披露了合適的麴黴屬製備物(參見實施例)。此外，被認為包含麴黴屬磷脂酶的商業上可得到的磷脂酶製備物DegommaVOD(Roehm,Germany)適合被用於本發明的方法。優選的磷脂酶是公開於WO00/32758實施例5中的細毛嗜熱黴磷脂酶變體，和商業產品免Lecitase^Ultra(NovozymesA/S，Denmark)。酶可作為凍乾粉、固定化的或在水溶液中施用。就本發明而言，可根據Needleman,S.B.andWunsch,C.D.，(1970),JournalofMolecularBiology,48,443-45中描述的方法，利用多肽序列比較的如下設定來合適地確定同一性程度GAP生成罰分3.0，GAP延伸罰分O.l。可以藉助GCG程序包中提供的例如稱為GAP的電腦程式進行確定(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1994,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711》兩個給定序列可以根據Needleman(見上)描述的方法使用相同參數加以比對。這可藉助GAP程序(見上)進行。此外，本發明涉及使用如上所述的第一種和第二種脂解酶生產脂肪酸烷基酯的分批方法和/或連續、分階段的方法，其中連續或逐步加入醇，並且其中酶被回收或僅使用一次。如果酶在水相中，則此相可通過傾析器(decanter)、沉降器或通過離心與脂肪相分離。在連續過程中，可以對兩相(分別是油相和水相)逆流進4亍加工。Kosugi,Y;Tanaka,H.andTomizuka,(1990),BiotechnologyandBioengineering,vol.36，617-622描述了通過固定化的脂肪酶水解一直物油的連續、逆流過程。對製備磷降低的脂肪酸烷基酯的一般性描述將包含甘油三酯和/或脂肪酸的底物與醇，優選曱醇或乙醇混合，並在往復振蕩水浴(200rpm)上加熱至30-70°C,優選大約50°C。優選加入水，將溶液混合，並進一步加熱至所需溫度。加入酶，將溶液劇烈混合，於所需溫度(優選50。C)和200rpm置於往復振蕩水浴中反應。反應混合物中的各相可通過使用高剪切混合器，例如來自Silverson或IKALabortechnik類型的高剪切混合器進行混合，如在植物油的酶促脫膠中所使用的(Clausen,K.(2001),EuropeanJournalofLipidScienceandTechnology,vol.103,333-340)。通常，酶促脫膠於pH3-7時發生。為了對過程進行優化，通常需要調節pH以適合該過程的其它條件，包括底物類型和螯合劑濃度。優選pH4-5。/[脂肪酸殘基]摩爾比應為至少0.1和最大10,優選在0.3-5的範圍，更優選0.4-2。可隨時間逐步向反應中加入醇。水可分開加入，或在水性酶溶液中加入。反應混合物中水的終濃度可為0-50%(w/w)、優選5-40%、更優選5-30%。底物包含l-99。/。(w/w)甘油三酯，優選在75-90%範圍。此外，底物可包含總計0.01-95%(w/w)的游離脂肪酸，優選在0.01-30%的範圍。此外，也可存在單酸甘油酯、甘油二酯和磷脂。可通過在一定反應時間後從反應混合物中取出樣品來跟蹤反應進程。樣品於14000rpm離心14分鐘。上層由不溶於水相的脂肪物質組成，通過'HNMR(用CDCl3作為溶劑)對其進行分析。酶促處理後分離水相和油相。可通過傳統手段，例如離心、傾析或沉降器進行此分離。所加入的脂解酶的量可以根據對三丁酸甘油酯(tributyrin)的脂解活性(LU)來確定。可使用阿拉伯樹膠(gumAbrabic)作乳化劑通過乳化三丁酸甘油酉旨(甘油三丁酸酯(glycerintributyrate))來製備脂解酶底物。在30。C、pH7水解三丁酸甘油酯，隨後進行pH恆穩的(pH-stat)滴定實驗。一脂肪酶活性單位(lLU)等於每分鐘能夠在標準條件下釋放1iamol丁酸的酶量。如Clausen,K.Eur.J.LipidSci.Technol.103(2001),333-340所述測定24小時反應時間後脂肪相中的磷含量。通過添加螯合劑可進一步優化本發明的方法，所述螯合劑螯合反應混合物中的金屬成分，因而增加水相中可水合磷脂的量。螯合劑例如檸檬酸或乙二胺四乙酸(EDTA)可以基於油含量以0.01-1%w/w的範圍加入。優選的量是0.04-0.1%。在從排出的水相中除去含磷化合物後，通過將水相回混入包括新底物的反應混合物，可完全或部分回收存在於水相中的酶。通過用吸收磷脂及其它物質的二氧化矽進行處理，可進一步降低反應混合物脂肪相中含磷成分的含量。克隆編碼脂解酶或磷脂酶的DNA序列使用本領域已熟知的各種方法，可從生產所述酶的任何細胞或微生物中分離編碼親本脂解酶或磷脂酶的DNA序列。首先，可以使用來自產生待研究的酶的生物體的染色體DNA或信使RNA,構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然後，如果已知脂解酶或磷脂酶的胺基酸序列，可以合成標記編碼脂解酶或磷脂酶的克隆。可替換地，使用雜交和較低嚴緊度的洗滌條件，可將含有與另一已知脂解酶或磷脂酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針用作探針以鑑定相關的編碼酶的克隆。鑑定編碼脂解酶或磷脂酶的克隆的另一方法涉及將基因組DNA片段插入表達載體，例如質粒中，用所得到的基因組DNA文庫轉化角質酶陰性細菌，然後將轉化的細菌塗布在含有脂解酶或磷脂酶底物(即甘油三S旨)的瓊脂上，從而允許鑑定出表達脂解酶的克隆。可替換地，可通過已建立的標準方法，例如S丄.BeaucageandM.H.Caruthers,(1981),TetrahedronLetters22,p.1859-1869描述的亞磷醯胺(phosphoroamidite)方法，或Matthesetal.,(1984),EMBOJ.3,p.801-805描述的方法，合成地製備編碼酶的DNA序列。在亞磷醯胺方法中，合成寡核芬酸(例如在自動DNA合成儀中)，純化，退火，連接，並克隆至適當載體中。最後，DNA序列可以是混合的基因組和合成來源的、混合的合成和cDNA來源的、或混合的基因組和cDNA來源的，其根據標準技術通過連接合成的、基因組的或cDNA來源的片段(適當時，片段對應於整個DNA序列的各個部分)來製備。也可使用特定引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)製備DNA序列，例如在US4,683,202或R.K.Saikietal.，(1988),Science239,1988，pp.487-491中所描述的。表達載體攜帶編碼本發明方法的脂解酶或磷脂酶的DNA序列的重組表達載體可以是可方便地進行重組DNA步驟的任何載體，並且載體的選擇通常取決於待引入載體的宿主細胞。載體可以是當引入宿主細胞時被整合入宿主細胞基因組、並與已整合入載體的染色體一起複製的載體。合適的表達載體的實例包括pMT838。本發明的表達載體也可包含合適的轉錄終止子，並且在真核細胞中包含聚腺苷化序列，其與編碼本發明方法的脂解酶或磷脂酶的DNA序列可操作連接。終止和聚腺苷化序列可合適地與啟動子源自同一來源。載體可進一步包含使得載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。這些序列的例子是質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的複製起點。質粒也可包含選擇標記，例如，其產物對宿主細胞中的缺陷進行補償的基因，例如來自枯草芽孢桿菌(B.^to7/力或地衣芽孢桿菌(及//c/zemy^m/力的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的基因。此外，載體可包含麴黴屬選擇標記，如amdS、argB、niaD和sC,產生潮黴素抗性的標記，或者所述選擇可通過共轉化完成，例如WO91/17243中所描述的。用來連接分別編碼角質酶變體、啟動子、終止子和其它元件的本發明DNA構建體，並將它們插入含有複製所需信息的合適載體的方法對於本領i或4支術人員而言是熟知的(參見，例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarbor,1989)。啟動子在載體中，DNA序列應該與合適的啟動子序列可操作地連接。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何DNA序列，並可源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用於指導編碼脂解酶或磷脂酶的DNA序列的轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的合適啟動子的例子是大腸桿菌/ac操縱子的啟動子、天藍色鏈黴菌0S^e/3tow少c^￡/^0/0。瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)的啟動子、解澱粉芽孢桿菌(x-澱粉酶基因(amyQ)的啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因的啟動子等。對於在真菌宿主中的轉錄，有用的啟動子的例子是那些源自編碼米麴黴TAKA澱粉酶的基因的啟動子，釀酒酵母(Sacc/zaramyceycerevWae)的TPI(磷酸丙糖異構酶)啟動子(Alberetal.(1982),J.Mol.Appl.Genet1,p.419-434)，曼赫根毛黴(i/z/zcwwcwm/e/ze/)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性a-澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴磷酸丙糖異構酶、或構巢麴黴乙醯胺酶啟動子。宿主細胞將包含如上所定義的本發明的DNA構建體或表達載體的、產生用於本發明方法的酶的宿主細胞，有利地用作重組生產脂解酶或磷脂酶的宿主細胞。可以方便地通過將DNA構建體(以一個或多個拷貝)整合入宿主染色體來用編碼脂解酶或磷脂酶的DNA構建體轉化所述細胞。這種整合通常被認為是優點，因為DNA序列更有可能在細胞中穩定地保持。可以根據傳統方法，例如通過同源或異源重組，將DNA構建體整合入宿主染色體。可替換地，可如上所述結合不同的宿主細胞類型用表達載體轉化細胞。宿主細胞可以是較高等生物體，例如哺乳動物或昆蟲的細胞，特別是微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。合適的細菌的例子為革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌，或淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌。可例如通過原生質體轉化或通過使用感受態細胞以本身(perse)已知的方式實現細菌的轉化。酵母生物體可有利地選自酵母屬或裂殖酵母屬的菌種，例如釀酒酵母。宿主細胞也可以是絲狀真菌，例如屬於麴黴屬的菌種，特別是米麴黴或黑麴黴的菌抹，或鐮孢屬的菌抹，例如尖鐮孢、禾本科鐮孢(F^an'Mmgram/"eflrwm)(在完全階段稱為玉蜀黍赤黴(GA6ew〃azeae)，先前稱為iS^/agn'a與GV66g/-e〃flra化wm和GV66e"〃"f.sp.Cerea/Zs同義)或石克色嫌孑包(Fwsan'wmsw/p/zweMm)(在咒全卩介,爻一爾為GV&6gre〃a/wr/can5,與Fwsan'w附fn'c/zof/zec/o/cies"、^幹孑包^犬鐮孑包(FwsaWMm6ac^7Wo/cfey)、衝妾骨木鐮孑包(Fws(3n'M附5fifw6wc/"w附)、淨分糹工鐮孑包(Fw"〃'w附royeww)牙口4分糹工鐮孑包禾本牙牛哭體(Fwsan'Mmroei/mvar.GVam/"earww)同義)、禾穀嫌孑包(屍i^an'wmcerea/zi)(與Fwsan'wwcraMwe〃e"se同義)或銀片嫌孑包(Fwsan'Mmve"ewa/ww7)的菌才朱。在具體的實施方式中，宿主細胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶陰性(minus)菌抹。這可例如是稱為"alp"的鹼性蛋白酶基因缺失的蛋白酶缺陷菌株米曲酶JaL125。該菌抹描述於WO97/35956(NovoNordisk)。已知的方式再生細胞壁的方法來進行轉化。麴黴屬作為宿主微生物的用途在EP238023(NovoNordiskA/S)中描述，其內容在此？I入作為參考。通過培養轉化體生產脂解酶或磷脂酶可通過包括在有益於生產所述酶的條件下培養宿主細胞和從細胞和/或培養基中回收酶的方法產生用於本發明方法的酶。用於培養細胞的培養基可以是任何適於培養所述宿主細胞、並獲得本發明的脂解酶表達的常規培養基。合適的培養基可獲自供應商，或可根據公開的配方來製備(例如在美國典型培養物保藏中心的目錄中所描述的)。由宿主細胞分泌的脂解酶或磷脂酶可以方便地通過已知方法從培養基中回收，包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，並藉助鹽如硫酸銨沉澱培養基的蛋白質成分，然後使用層析方法如離子交換層析、親和層析等。實施例粗製油菜籽油的酯基轉移作用和脫膠使用脂解酶和磷脂酶從粗製油菜籽油中形成磷降低的脂肪酸曱基酯脂解酶根據WO00/60063的細毛嗜熱黴脂肪酶變體，劑量4000LU/8克油磷脂酶根據WO00/32758實施例5的細毛嗜熱黴磷脂酶變體(活性10,000LU/g)，劑量30ppm或100ppm(分別對應於300和1000LU/kg油)。底物100%粗製油菜籽油，8克。曱醇含量基於油1.5摩爾當量，1.72ml。基於油重量30%&0。取樣時間3小時和24小時。反應溫度50。C。在往復振蕩水浴(200rpm)上將底物-曱醇混合物加熱至50。C。加入去離子水(體積取決於所加的酶體積；水總量2.40ml其包括來自酶添加的水)，對應於油的30w/w%。將混合物加熱至50°C。然後將酶(脂肪酶和磷脂酶)加入混合物，在高剪切混合器(UltraTurraxT25,IKAJankeandKunkel，Germany)上混合30秒，然後在振蕩水浴中放置24小時(往復振蕩，50。C、200rpm)。分別在3和24小時反應時間後從反應混合物取出樣品，在14000rpm離心14分鐘。上層由不溶於水相的脂肪物質組成，通過iHNMR(使用CDC13作為溶劑)Varian400MHz光譜儀(VarianInc.CA,USA)對其進行分析。脂肪酸殘基變為脂肪酸曱基酯的轉化率通過來自脂肪酸甲基酯-COOC^3的曱基信號(3.70ppm)與來自脂肪酸殘基C壓CH2-的曱基信號(1.0-0.9ppm)的比率來確定。在無脂肪酶和磷脂酶的實驗中沒有發現曱基酯形成，在僅有磷脂酶的實驗中也沒有發現曱基酯形成。24小時反應時間後，脂肪相中的磷含量如Clausen,K.Eur.J.LipidSci.Technol.103(2001)，333-340所述確定。表1酶處理後的磷含量和曱基酯形成tableseeoriginaldocumentpage15很顯然，在一步法中組合脂解酶與磷脂酶導致甘油三酯高度地轉變為曱基酯，並導致含磷成分的低含量。權利要求1.生產磷降低的脂肪酸烷基酯的方法，其包括將醇、包含甘油三酯和/或脂肪酸的底物與一種或多種脂解酶和一種或多種磷脂酶和水混合。2.權利要求1的方法，其中脂肪酸烷基酯的磷含量降低至不超過50ppm，優選不超過40ppm，優選不超過30ppm,優選不超過25ppm,優選不超過20ppm，更優選不超過15ppm,更優選不超過10ppm，甚至更優選不超過5ppm，最^f尤選不超過lppm。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述底物進一步包含游離脂肪酸，優選按重量計0.01-95%範圍的游離脂肪酸。4.根據權利要求1-3的方法，其中所述甘油三酯源自一種或多種植物油原料、油菜籽油、大豆油、芥子油、葵花籽油、菜籽油、椰子油、大麻油、棕櫚油、妥爾油、動物脂肪包括牛脂、豬油、家禽和魚油，所述油和脂肪可以是粗製的、水脫膠的、廢棄的或精煉品質的。5.根據權利要求l-4的方法，其中醇和脂肪酸殘基的摩爾比最小為0.1、最大為10，優選在0.3-5的範圍，更優選0.4-2。6.根據權利要求1-5的方法，其中所述醇是曱醇或乙醇。7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反應混合物包含多至50%(w/w)的水。8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述溫度是30-70。C,優選大約50。C。9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述脂解酶與選自來自下組的月旨角罕酶具有60%同一'1~生CawAWaJwtorc"ca、i7>p/w2yma、近平滑念J朱菌、皺落念珠菌、洋蔥假單胞菌、白地黴、曼赫根毛黴、隱球菌屬菌種S-2、近平滑念珠菌和細毛嗜熱黴。10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述磷脂酶與選自下組的磷脂酶具有60%同一性來自鐮孢屬、麴黴屬和嗜熱黴屬的磷脂酶。11.權利要求10的方法，其中所述磷脂酶選自下組來自如下菌抹的磷脂酶大刀鐮孢、異孢鐮孢、腐皮鐮孢、尖鐮孢、泡盛麴黴、臭麴黴、曰本麴黴、黑麴黴、米麴黴和細毛嗜熱黴。12.前述權利要求中任一項的方法，其中基於油含量在0.01-1%w/w，優選0.04-0.1%w/w的範圍加入螯合劑。13.前述權利要求中任一項的方法，其中所述過程以分批模式進行。14.前述權利要求中任一項的方法，其中所述過程以連續模式進行。15.前述權利要求中任一項的方法，其中用高剪切混合器將反應混合物中的溶液相混合。16.前述權利要求中任一項的方法，其中所述過程以逆流模式進行。17.前述權利要求中任一項的方法，其中所述包括酶的水相被全部或部分再循環入反應混合物，所述混合物還包含新底物。全文摘要本發明涉及生產具有低雜質水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸甲基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述雜質例如磷脂。本發明的方法通過將兩個加工步驟組合成一個單一加工步驟而得以簡化，因此在經濟上更便宜。所述方法包括將水、醇、甘油三酯和/或游離脂肪酸與脂解酶和磷脂酶混合。隨後將含有甘油、殘餘的酶和大多數被水解的磷脂的水相與非水相分離，由此降低非水相中的磷脂含量。文檔編號C12P7/62GK101194019SQ200680020644公開日2008年6月4日申請日期2006年6月13日優先權日2005年6月13日發明者漢斯·C·霍爾姆,珀·M·尼爾森,莫滕·W·克裡斯坦森申請人:諾維信公司