一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法

2023-06-07 10:24:01 1

一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法，包括：將活化的桑黃菌種接種於添加有富鋅酵母和分心木提取物的液體種子培養基中，輔以在一定頻率和強度的低頻超聲波中快速培養，再將桑黃液體菌種接入添加有富鋅酵母和星油藤葉酶解物的液體發酵培養基中，輔以在一定頻率和強度的極低頻磁場中培養得富鋅桑黃液體發酵產物。本發明通過種子液和發酵兩階段的低頻超聲波和極低頻磁場中物理輔助協同發酵，以及分心木提取物、星油藤葉酶解物等外源添加物的協同作用，大幅度提高了最終桑黃髮酵產物中有機鋅、鋅多糖的含量和活性。
【專利說明】一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法。

【背景技術】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔子菌亞門，層孔菌綱，鏽革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細胞轉移和防止癌症手術後復發等的臨床應用中具有顯著效果，是 目前國際公認的生物治癌藥劑中有效率最高的一種藥用真菌。作為目前國際公認的抗癌效 果最好的大型藥用真菌，桑黃抑制腫瘤的研究主要集中在藥理活性成分桑黃多糖上。
[0003] 鋅是微量元素的一種，在人體內的含量以及每天所需攝入量都很少，但對機體的 性發育、性功能、生殖細胞的生成卻能起到舉足輕重的作用，故有"生命的火花"與"婚姻和 諧素"之稱。人體正常含鋅量為2-3克。絕大部分組織中都有極微量的鋅分布，其中肝臟、 肌肉和骨骼中含量較高。鋅是體內數十種酶的主要成分；鋅還與大腦發育和智力有關。人 體的睪丸、前列腺、精液當中，都含有高濃度的鋅。當人體內鋅的含量缺乏時，性功能會因此 而低下，合成睪丸素酶發生紊亂，男子將會引起陽痿和臉上生長痤瘡。鋅對激發精子活動有 著特殊的作用，缺鋅會造成精子活動力的下降。長期處於缺鋅狀態而未能及時補充，可出現 精子數量明顯減少、睪丸萎縮，最後導致不育。
[0004] 據報導，食用菌對鋅元素的富集轉化作用較強，是鋅元素的優良載體生物。目前已 有報導，多種食藥真菌對鋅具有富集作用且富鋅後其藥理活性增強。
[0005] 中國專利ZL200810157380. 4公開了一種富鋅蛹蟲草菌絲體的人工培養方法及其 培養基，其培養基配方重量比組分為：葡萄糖1. 〇% -3. 0%，蛋白腖0. 5% -1. 0%，酵母提取 物0. 1 % -I. 0 %，瓊脂粉I. 0 % -2. 0 %，水餘量，其pH值為5. 0-7. 5,其人工培養方法包括試 管斜面菌種培養（活化）一試管液體菌種培養一三角瓶液體種子培養一種子罐培養一發酵 罐培養一板框過濾一粉碎一真空乾燥一粉碎一粉末狀菌絲體步驟。其操作簡單，培養周期 短，菌絲體產率高，無汙染無廢棄物，具有補鋅功能，可以進行工廠化生產。
[0006] 中國專利ZL200610098121. X公開了一種富鋅亮菌多糖，由亮菌在富含鋅的液體 培養基中經靜態發酵培養製備的富鋅亮菌菌索中提取得到的多糖，為無定形灰色粉末，提 取率達14%，其多糖含量75% -80%，有機鋅含量105-135mg/g。實驗結果表明，本多糖無 毒，能促進受輻射損傷的造血系統和免疫系統功能的恢復，具有抗輻射作用，可應用於製備 抗輻射藥品或保健食品。
[0007] 上述技術一般僅單一採用液態發酵方式，簡單地模仿常規食藥用菌菌絲體發酵的 方式，以蛋白腖、酵母提取物為氮源，以蔗糖、葡萄糖或玉米粉為主要碳源，在培養基中添加 硫酸鋅等無機鋅為主的鋅源。由於食藥用菌液體培養時間有限，無機鋅等一般不容易被菌 絲體吸收，導致發酵液中的有機鋅、鋅多糖等有效組分含量不高。
[0008] 目前在生物【技術領域】的科研與生產上，生活細胞，無論是自養細胞還是異養細胞， 其人工培養的控制條件大都集中在培養基組成、溫度、通（空）氣、酸鹼度、氧化還原電位、 離子濃度等。利用這些傳統的控制因子研究各種生活細胞的培養技術以獲得目的次生代謝 產物一直是生物【技術領域】的研究熱點。
[0009] 然而，生活細胞生長與次生代謝的調控因子遠遠不止這些。大量的科學研究證 明：生物細胞的營養生長和次生代謝產物積累都受到特定波長或頻率的電磁波等的調節， 例如：一定頻率和功率的超聲波可以激活細胞並對生活細胞生長與代謝具有積極的促進作 用、特殊波長的光源會有效地調節生活細胞某些特殊的代謝途徑而導致一些生物活性物質 的積累、一定強度的磁場可以促進生活細胞的生長與代謝。
[0010] 對生活細胞具有顯著調控效應的這些物理因子可用於提高工業化生產人類需要 的生物活性物質或者藥物的效率。由於不同波長的電磁波都具備一定的能量和頻率，且只 能被生活細胞內某些特殊的波敏色素或者其它波敏物質（如某些輔酶或者非酶蛋白質受 體）吸收而使基因表達或相應的代謝網絡發生變化，由此引起某些特定的次生代謝產物表 達量增加。或者超聲波引起的機械振動和高速傳質而促進細胞代謝和次生代謝產物的分 泌。或者磁場引起生物大分子的氫鍵磁性和能量變化而導致生物大分子（酶）的活性增強。
[0011] 目前國內外關於以特定低頻率磁場和低頻率超聲波為主輔助提高桑黃髮酵富鋅 產物產量及活性的方法還沒有相應的報導。


【發明內容】

[0012] 本發明為了解決現有技術所存在的技術問題，提供了一種富鋅桑黃液體發酵產物 的製備方法，該方法通過外源添加物以及低頻率磁場和低頻率超聲波輔助提高桑黃髮酵富 鋅產物產量及活性，可明顯提高有機鋅和鋅多糖含量和活性，具有安全可靠的特點。
[0013] 本發明採用的技術方案是：
[0014] 一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法，包括步驟：
[0015] (1)富鋅桑黃液體種子液製備：將活化後的桑黃菌種接入液體種子培養基中進行 桑黃液體種子培養，在桑黃液體種子培養第1天-第4天，將培養基置於低頻超聲環境中， 超聲波頻率為ΙΟΚΗζ-ΙΟΟΚΗζ，超聲波強度控制在0. lW/cm3-0. 9W/cm3,22°C -28°c恆溫，保持 120r/min-150r/min振蕩培養1天-8天後，得到富鋅桑黃液體種子液；所述的液體種子培 養基中含有富鋅酵母和分心木提取物；
[0016] (2)富鋅桑黃的液體發酵培養：將步驟（1)中的富鋅桑黃液體種子液按佔液體 發酵培養基體積5% -20%的用量接入液體發酵培養基中進行桑黃液體發酵培養，在桑黃 液體發酵培養第2天-第4天，將液體發酵培養基置於極低頻交變磁場環境中，磁場強度 0. 4mT-5mT，交變磁場頻率 5Hz-50Hz，22°C -28°C恆溫，保持 140r/min-160r/min 振蕩培養 2 天-5天後，得到富鋅桑黃髮酵產物；所述的液體發酵培養基中含有富鋅酵母和星油藤葉酶 解物。
[0017] 本發明根據藥用真菌桑黃的發酵培養和富鋅特性，在種子液培養階段讓菌體細胞 暴露在一定頻率和強度的低頻超聲波中培養，在發酵階段讓菌體細胞暴露在一定頻率和強 度的極低頻磁場中利於有機鋅元素的轉化和桑黃鋅多糖的合成，通過種子液和發酵兩階段 的低頻超聲波和極低頻磁場中物理輔助協同發酵，以及分心木提取物、星油藤葉酶解物等 外源添加物的協同作用，大幅度提高了最終桑黃髮酵產物中有機鋅、鋅多糖的含量和活性。
[0018] 所述的桑黃菌種可採用任意一種桑黃菌種，可採用市售產品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種購於中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0019] 為了達到更好的發明效果，進行以下優選：
[0020] 步驟（1)中，所述的液體種子培養基中基礎物質採用液體種子培養基常用的基礎 物質，如葡萄糖、KH 2P04、MgS04等。所述的液體種子培養基優選含有富鋅酵母0. 04% -0. 4% 和分心木提取物0.05%-0.4%，％為質量百分比。進一步優選，所述的液體種子培養基質 量百分比組成為：葡萄糖1% -2%、富鋅酵母0. 04% -0. 4%、分心木提取物0. 05% -0. 4%、 KH2PO4Om、MgSO4O. 05% -0· 1 %和餘量的水。
[0021] 所述的分心木提取物可以選用市售產品，例如西安昌嶽植物化工有限公司生產的 分心木提取物等，也可以採用現有製備方法製備，優選採用以下製備方法製備的分心木提 取物，包括：稱取一定量的分心木，粉碎（優選過40目-100目），先加佔分心木重量10倍 量-16倍量的質量百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C _80°C浸提lh-2h，過濾後得 到上清液，上清液濃縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的分心木殘渣加入佔分心 木重量10倍量-20倍量的水在85°C _95°C下浸提lh-2. 5h，過濾後得到上清液，上清液濃縮 至1/4體積後加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉澱物，沉澱物真空冷 凍乾燥後得提取物II，合併上述提取物I和提取物II得分心木提取物。
[0022] 所述的桑黃液體種子培養的溫度為自然環境溫度，優選為20°C -30°C。一般IL液 體種子培養基中接入2cm2-5cm2大小的活化後的桑黃菌種菌塊。
[0023] 步驟（1)中，桑黃菌種的活化方法為本領域常規的菌種活化方法，包括：將斜面保 藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度22°C -30°C，培養時間4 天-10天，得到活化後的桑黃菌種。
[0024] 所述的PDA平板培養基採用本領域種子培養常用的培養基，可採用市售產品。進 一步優選，所述的PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g-20g，用水定容至 lOOOmL。
[0025] 步驟（2)中，所述的液體發酵培養基中基礎物質採用液體發酵培養基常用的基礎 物質，如葡萄糖、KH 2P04、MgS04等。所述的液體發酵培養基優選含有富鋅酵母0. 04% -0. 4% 和星油藤葉酶解物0.05%-0.4%，％為質量百分比。進一步優選，所述的液體發酵培 養基質量百分比組成為：葡萄糖1% -2. 5 %、富鋅酵母0.04% -0.4%、星油藤葉酶解物 0· 05% -0· 4%、ΚΗ2Ρ040· 1% -0· 2%、MgS040 . 05% -0· 1%和餘量的水。
[0026] 所述的桑黃液體發酵培養的溫度為自然環境溫度，優選為20°C -30°C。
[0027] 所述的星油藤葉酶解物的製備方法，包括：將星油藤葉加水磨成漿液，滅酶；調節 漿液PH4. 0-5. 5,加入由纖維素酶和果膠酶構成的第一複合酶，在40°C -50°C進行酶解反應 0. 5小時-1. 5小時，滅酶後調節漿液pH5. 0-7. 0,加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶構成的第 二複合酶，於50°C -60°C進行酶解反應1小時-1. 5小時，滅酶後離心，上清液經過濾、濃縮 和乾燥，得到星油藤葉酶解物。
[0028] 所述的第一複合酶與星油藤葉的質量比優選為1 :30_50。
[0029] 所述的第二複合酶與星油藤葉的質量比優選為1 :25_60。
[0030] 所述的纖維素酶與果膠酶的質量比優選為1:2至4:1。
[0031] 所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質量比優選為1:3至2:1。
[0032] 所述的中性蛋白酶的酶活力優選為20. 0萬U/g-30. 0萬U/g、木瓜蛋白酶的酶活力 優選為100. 0萬U/g-200. 0萬U/g、果膠酶的酶活力優選為3. 0萬U/g-5. 0萬U/g、纖維素 酶的酶活力優選為2· O萬U/g-3. O萬U/g。
[0033] 將星油藤葉加水磨成漿液的步驟中，星油藤葉與水的重量比優選為1:3-6。所述的 星油藤葉可選用採摘後經清洗、真空冷凍乾燥後的星油藤葉，也可直接選用市售的乾燥星 油藤葉。
[0034] 所述的滅酶的條件依據酶失活的條件，一般為：90°C _95°C下滅酶5分鐘-8分鐘。
[0035] 所述的星油藤葉酶解物的製備方法中，優選：上清液用截留分子量為lkDa-3kDa 的超濾膜超濾，截留液真空濃縮後進行冷凍乾燥，得到星油藤葉酶解物。
[0036] 本發明所用的培養基均需滅菌、冷卻後使用，滅菌的條件採用本領域的常規條件， 例如可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0037] 富鋅酵母集有機鋅生物活性和酵母本身豐富的營養為一體，含有豐富的蛋白 質和礦物質等營養因子。所述的富鋅酵母可以選用市售產品，例如浙江深友生物技術 有限公司生產的富鋅酵母等，也可以採用現有製備方法製備，優選採用以下製備方法 製備的富鋅酵母，包括：將活性的酵母斜面菌種接種到液體培養基中，20°C -28 °C發酵 培養10h_24h，發酵終止後離心過濾，將沉澱真空冷凍乾燥得富鋅酵母。其中，所述的 液體培養基由以下質量百分比的組分組成：葡萄糖1% -2. 5 %、麥芽汁3% -8%、尿素 0· 1% -0· 4%、ΚΗ2Ρ040· 1% -0· 2%、ZnS040 . 00 6% -0· 04%和餘量的水。即每 Ikg 液體培養 基中硫酸鋅（ZnSO4)的用量為60mg-400mg。所述的酵母可採用市售產品，優選為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC 20037購於中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0038] 本發明中，所述的富鋅酵母中鋅含量優選為400mg/kg-1000mg/kg，即每千克富鋅 酵母中鋅含量為400mg-1000mg。
[0039] 本發明，所述的富鋅桑黃髮酵產物經過後續的分離處理可以得到桑黃鋅多糖。所 述的分離處理為本領域常規的分離方法，例如過濾或離心；可包括：將所述的富鋅桑黃髮 酵產物用多層紗布過濾，從過濾所得菌絲體中提取桑黃鋅多糖。具體的提取步驟包括：將 菌絲體用水衝洗乾淨，在55°C -65°C乾燥至恆重，粉碎得到菌絲體乾粉，將菌絲體乾粉按料 液質量比1:10-15加入水，90°C -95°C浸提3h-3. 5h，提取兩次，合併提取液過濾收集濾液， 50°C -55°C下減壓濃縮，向濃縮液中加入佔濃縮液體積4倍量-5倍量的無水乙醇，隔夜醇 沉，離心，沉澱即為桑黃鋅多糖。
[0040] 分心木（Semen Juglandis.)，為胡桃科植物胡桃JuglansregiaL.果核內的乾燥 木質隔膜，別名胡桃衣，胡桃夾，胡桃隔，核桃芯。味苦澀，性平，無毒。
[0041] 星油藤（Plukenetia volubilis L.)，又名南美油藤、印加果、印加花生，為大戟 科多年生木質藤本植物，原生長在南美洲安第斯山脈的熱帶雨林中。星油藤種子含油量 為30 % -60 %，主要由多元不飽和脂肪酸組成，其含量可達90 %以上，明顯高於其他油料作 物。其多元不飽和脂肪酸以Omega(co)脂肪酸為主，要高於大豆、花生、油菜及亞麻等傳統 油料作物。其中，亞麻酸含量為45. 2% -52. 51%，要遠遠高於大豆油和花生油中亞麻酸的 含量。由於星油藤油組成成分優良、營養品質高，被認為是世界上最好的植物油之一。本發 明選用星油藤的葉，即星油藤葉。
[0042] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0043] (1)本發明根據藥用真菌桑黃的發酵培養和富鋅特性，在種子培養階段讓菌體細 胞暴露在一定頻率和強度的低頻超聲波中培養，在發酵階段讓菌體細胞暴露在一定頻率和 強度的極低頻磁場中利於有機鋅元素的轉化和桑黃鋅多糖的合成，通過種子液和發酵兩階 段的低頻超聲波和極低頻磁場中物理輔助協同發酵，以及分心木提取物、星油藤葉酶解物 等外源添加物的協同作用，大幅度提高了最終桑黃髮酵產物中有機鋅、鋅多糖的含量和活 性。
[0044] (2)培養基中的富鋅酵母在起到補充氮源的作用同時，還是鋅的來源。傳統的富鋅 食藥用菌菌絲體在形成過程中，鋅的來源是無機態的氧化鋅，發酵時要將培養基中的無機 鋅吸收後轉化為有機鋅，這個過程中鋅不易為菌絲體所吸收。而富鋅酵母攜帶的鋅元素是 有機鋅的形態，又更容易為菌絲體吸收，通過桑黃菌絲細胞內物質的代謝，將底物中的鋅結 合到大分子上轉化為有機鋅多糖和鋅蛋白，從而發揮鋅和桑黃固有的協同生理作用。

【具體實施方式】
[0045] 下面結合部分具體實施例對本
【發明內容】
進行進一步闡明，但本發明的內容並不僅 限於下面的實施例。
[0046] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購於中國農業微生物菌種保藏管理中 心。
[0047] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) ACCC 20037購於中國農業微生物菌種保 藏管理中心。
[0048] 實施例1
[0049] 一、材料準備
[0050] 中性蛋白酶（酶活力為20. 0萬U/g)、木瓜蛋白酶（酶活力為100. 0萬U/g)、果膠 酶（酶活力為5. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生物工程有限公 司提供。
[0051] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至IOOOmL,自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0052] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度25°C， 培養時間7天，得到活化後的桑黃菌種。
[0053] 外源添加物的製備：
[0054] a.星油藤葉酶解物的製備：將採摘的星油藤葉清洗、真空冷凍乾燥後，稱量IOOg 加500mL水，磨成漿液，95°C滅菌5min，使各種酶失活；調節漿液pH5.0,加入由Ig纖維素 酶和Ig果膠酶構成的複合酶，在45°C進行酶解反應I. 0小時，在95°C下滅酶6分鐘；然後 調節漿液PH6.0,加入由1.75g木瓜蛋白酶和1.75g中性蛋白酶構成的複合酶，於55°C進行 酶解反應I. 5h，在95°C下滅酶5分鐘，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分子量為 IkDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮後進行冷凍乾燥，獲得星油藤葉酶解物。
[0055] b.分心木提取物的製備：稱取一定量的分心木，粉碎過40目，先加佔分心木重量 10倍量的質量百分濃度60%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，過濾後得到上清液，上清液濃 縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的分心木殘渣加入佔分心木重量10倍量的蒸 餾水在85°C下浸提lh，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後加入濃縮物體積2倍 量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥後得提取物II，合併 上述提取物I和提取物II得分心木提取物。
[0056] c.富鋅酵母的製備：將活性的酵母斜面菌種接種到液體培養基中，25°C發酵培養 18h，發酵終止後離心過濾，將沉澱真空冷凍乾燥得富鋅酵母，富鋅酵母中鋅含量為IOOOmg/ kg。其中，液體培養基由以下質量百分比的組分組成：葡萄糖2. 5%、麥芽汁3 %、尿素 0.4%、KH2PO4O. 1%、ZnSO4O. 04%和餘量的水。即每Ikg液體培養基中ZnSO4的用量為 400mg。
[0057] 二、富鋅桑黃髮酵產物的製備
[0058] (1)富鋅桑黃液體種子液製備：取2cm2大小活化後的桑黃菌種的菌塊接入IL液體 種子培養基中於28°C進行桑黃液體種子培養，在桑黃液體種子培養第2天，將培養基置於 低頻超聲環境中，超聲波頻率為65KHz，超聲波強度控制在0. 4W/cm3, 28°C恆溫，保持120r/ min振蕩培養3天後，得到富鋅桑黃液體種子液；
[0059] 液體種子培養基質量百分比組成為：葡萄糖2%、富鋅酵母0. 24%、分心木提取物 0· 1%、KH2PO4O. l%、MgS040 . 05%和餘量的水。
[0060] (2)富鋅桑黃的液體發酵培養：將步驟（1)中的富鋅桑黃液體種子液按佔液體發 酵培養基體積10%的用量接入液體發酵培養基中於28°C進行桑黃液體發酵培養，在桑黃 液體發酵培養第3天，將液體發酵培養基置於極低頻交變磁場環境中，磁場強度3mT，交變 磁場頻率5Hz，28°C恆溫，保持140r/min振蕩培養5天後，得到富鋅桑黃髮酵產物；
[0061] 液體發酵培養基質量百分比組成為：葡萄糖2 %、富鋅酵母0. 4%、星油藤葉酶解 物 0· 2 %、KH2PO4O. 1 %、MgSO4O. 05 % 和餘量的水。
[0062] 三、測定
[0063] (1)菌絲生物量的測定
[0064] 富鋅桑黃髮酵產物經8層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水衝洗3次，然後置60°C烘箱中 烘乾至恆重,稱重。
[0065] (2)鋅多糖含量的測定
[0066] 稱取適量菌絲體乾粉，置於燒杯中，按料液比1:10(質量比）加入蒸餾水，90°C浸 提3h，提取兩次，減壓過濾收集濾液，50°C下減壓濃縮，濃縮液加入佔濃縮液體積4倍量的 無水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min、20min離心後，沉澱即為粗多糖。將沉澱用蒸餾水定容至 50mL，用苯酚-硫酸法測定發酵液中多糖含量，重複測定3次求平均值，即鋅多糖含量。
[0067] (3)鋅的測定方法：參照GB/T5009. 14-2003食品中鋅的測定方法。
[0068] (4)鋅多糖對DPPH自由基清除能力的測定
[0069] 取2mL 5mg/mL待測樣品於試管中，加入2mL 0· 2mmol/L的DPPH乙醇溶液（用質 量百分濃度95%乙醇水溶液配製），充分搖勻，室溫靜置35min，在517nm波長處測定吸光 值。以維生素 C(V。）為對照，每組做3個重複，求其平均值。計算公式如下：
[0070]

【權利要求】
1. 一種富鋅桑黃液體發酵產物的製備方法，其特徵在於，包括步驟： (1) 富鋅桑黃液體種子液製備：將活化後的桑黃菌種接入液體種子培養基中進行桑黃 液體種子培養，在桑黃液體種子培養第1天-第4天，將培養基置於低頻超聲環境中，超 聲波頻率為lOKHz-lOOKHz，超聲波強度控制在0. lW/cm3-0. 9W/cm3,22°C -28°C恆溫，保持 120r/min-150r/min振蕩培養1天-8天後，得到富鋅桑黃液體種子液；所述的液體種子培 養基中含有富鋅酵母和分心木提取物； (2) 富鋅桑黃的液體發酵培養：將步驟（1)中的富鋅桑黃液體種子液按佔液體發酵 培養基體積5% -20%的用量接入液體發酵培養基中進行桑黃液體發酵培養，在桑黃液 體發酵培養第2天-第4天，將液體發酵培養基置於極低頻交變磁場環境中，磁場強度 0. 4mT-5mT，交變磁場頻率 5Hz-50Hz，22°C -28°C恆溫，保持 140r/min-160r/min 振蕩培養 2 天-5天後，得到富鋅桑黃髮酵產物；所述的液體發酵培養基中含有富鋅酵母和星油藤葉酶 解物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，所述的液體種子培養基中含 有富鋅酵母〇. 04% -0. 4%和分心木提取物0. 05% -0. 4%，％為質量百分比。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，所述的液體種子培養基質量 百分比組成為：葡萄糖1% -2%、富鋅酵母0.04% -0.4%、分心木提取物0.05% -0.4%、 KH2P04〇m、MgS040 . 05% -0? 1% 和餘量的水。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的分心木提取物的製備方法 包括：稱取一定量的分心木，粉碎，先加佔分心木重量10倍量-16倍量的質量百分濃度為 60%-80%的乙醇水溶液在601：-801：浸提111-211，過濾後得到上清液，上清液濃縮後真空 冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的分心木殘渣加入佔分心木重量10倍量-20倍量的水在 85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後加入濃縮物體積 2倍量_5倍量的無水乙醇，離心收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥後得提取物II，合併上述 提取物I和提取物II得分心木提取物。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（2)中，所述的液體發酵培養基含有 富鋅酵母〇. 04% -0. 4%和星油藤葉酶解物0. 05% -0. 4%，％為質量百分比。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的液體發酵培養基質量百分比 組成為：葡萄糖1% -2.5%、富鋅酵母0.04% -0.4%、星油藤葉酶解物0.05% -0.4%、 KH2P04〇m、MgS040 . 05% -0? 1% 和餘量的水。
7. 根據權利要求1或5所述的方法，其特徵在於，所述的星油藤葉酶解物的製備方 法，包括：將星油藤葉加水磨成漿液，滅酶；調節漿液PH4. 0-5. 5,加入由纖維素酶和果膠 酶構成的第一複合酶，在40°C -50°C進行酶解反應0. 5小時-1. 5小時，滅酶後調節漿液 pH5. 0-7.0,加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶構成的第二複合酶，於50°C -60°C進行酶解反 應1小時-1. 5小時，滅酶後離心，上清液經過濾、濃縮和乾燥，得到星油藤葉酶解物。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的第一複合酶與星油藤葉的質量比 為1 :30-50 ;所述的第二複合酶與星油藤葉的質量比為1 :25-60。
9. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的纖維素酶與果膠酶的質量比為1:2 至4:1 ;所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質量比為1:3至2:1。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的富鋅酵母中鋅含量為400mg/ kg-1000mg/kg。
【文檔編號】C12R1/645GK104372061SQ201410562605
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 付立忠, 李海波, 鄒景泉 申請人:浙江省林業科學研究院