用於固定配體的載體的製作方法
2023-06-07 04:09:21
專利名稱：用於固定配體的載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製作用於固定配體的基片的方法，所述方法可用於製作具有固定配體的基片，如DNA晶片、糖晶片或蛋白質晶片。
背景技術：
隨著基因組分析技術的進步，已經(或正在)闡明各種生物體的基因組結構。同時，開發用於分析基因組或其編碼功能分子(例如蛋白質)的功能的技術得到推進。其中，DNA晶片(DNA微陣列)、糖晶片以及蛋白質晶片是值得注意的技術。DNA晶片是一種微陣列，其中許多不同基因或其片段(DNA片段)陣列並固定在固相基片如載玻片的表面上。它作為一種顯著促進對基因表達、突變、多態性等的分析的技術是非常有用的。糖晶片是一種微陣列，其中單糖或寡糖陣列並固定在固相基片如載玻片的表面上。它作為一種顯著促進對糖、糖靶及其相互作用等的分析的技術是非常有用的。蛋白質晶片是一種微陣列，其中的蛋白質、抗體或其片段陣列並被固定。它作為一種顯著促進對蛋白質、抗體及其相互作用等的分析的技術是非常有用的。
將DNA固定在基片上是製作DNA晶片的一項基本技術。已知的方法通常分為兩類。一類方法是，DNA在共價結合到基片的接頭的頂端進行化學合成。這些方法在如Science，251767-773(1991)以及Nucleic Acids Research，201679-1684(1992)中公開。可用這些方法固定的DNA只限於寡核苷酸，同時這些方法需要特別的設備來控制反應。因此，不能說它們是通用的方法。
另一類方法是，將預先合成的DNA或用聚合酶鏈式反應(PCR)製備的DNA(PCR擴增產物)共價或非共價連接到基片上。這些方法在如Science，270467-470(1995)以及Nucleic AcidsResearch，225456-5465(1994)中公開。
在一個典型的已知的非共價結合固定方法中，DNA溶解於鹽溶液例如SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中，以其原有形式或變性後點樣於載玻片(基片)上，所述載玻片上塗布有鹼式聚陽離子(例如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺)和含有氨基等的鹼性矽烷耦偶聯介質劑，然後對所述載玻片進行UV輻射以進行固定。這種方法被認為可以固定任何DNA。
然而，用這種方法難以固定寡核苷酸或短鏈DNA(0.3kb或更短)。而且，如果一條長鏈DNA通過非共價鍵固定到基片上，固定的DNA在洗滌或在與目標核酸雜交步驟中易於從基片上脫落。這種現象是降低目標核酸檢測靈敏度的一個因素。另外，這種方法有一個缺點，即留在基片表面的鹼性官能團(陽離子)和目標核酸之間的非特異性結合容易使背景信號變高。
另一方面，依照一種共價結合固定方法，包括寡核苷酸在內的任何DNA都能夠被固定。然而，由於通常使用的是以陽離子基團(例如氨基)作為官能團的基片，這種方法有一個缺點，即如上面提到的方法一樣背景信號容易變高，導致檢測靈敏度降低。已知還有一種方法是將殘留的氨基通過乙醯化或類似的方法封閉，然而其效果不足。
已知有一種方法，該法使用其表面含有作為官能團的陰離子基團(例如羧基)的基片來降低背景信號(WO 01/02538)。按照這種方法製作的用於固定核酸的基片，可以用於檢測目的核酸，且靈敏度較高，因為如上文所述其背景喜好可以減小，也因為基片表面經聚陰離子處理後許多DNA分子可以被共價固定。按照這種方法，通過用聚陰離子(如聚丙烯酸)對基片進行表面處理，在表面上產生聚陰離子的活化酯衍生物以及進行DNA點樣，DNA可共價固定到基片上。
依照上述方法，將DNA共價結合固定到基片上需要多個步驟。因此，使用這種方法製作一種用於固定核酸使得可以較高靈敏度檢測目的核酸的基片，需要花費很多精力和大量的試劑。因此，從實際製作這種基片並將之投放市場所需的成本來考慮，這種方法還是沒有優勢的。
在WO 01/02538中描述了一種製備DNA晶片的方法。按照這種方法，使用1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進行脫水縮合，使聚丙烯酸固定到氨丙基矽烷化的載玻片上。洗滌後，使用1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進行脫水縮合反應形成N-羥基琥珀醯亞胺酯。因此，進行了兩步固相縮合反應。此反應需要昂貴的試劑1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。另外，由於要頻繁地用有機溶劑洗滌，需要進行大量的操作。而且，全部都在固相中進行的縮合反應的效率比在液相中進行的要差。還有一個問題是，使用1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽會導致縮合反應效率變低，因為它在液體中呈微酸性。
對於糖固定在基片上，可有效地使用葡基胺，葡基胺同時也是製備單糖或寡糖衍生物的一種非常重要的中間體。特異性地引入到糖還原性末端某殘基碳1位上的氨基非常活潑，能夠和羧酸的活化酯或具有異硫氰酸酯基團的化合物或類似物質在溫和的條件下偶聯。通過正確地選擇與葡基胺偶聯的化合物，就有可能將單糖或者寡糖引入到合成聚合物(如聚丙烯醯胺)上，將單糖或寡糖固定到固相載體上，對單糖或寡糖進行螢光標記，或者給本來是親水性的單糖或寡糖賦以疏水性質(Neoglycococonjugate，pp.199-223，Y.C.Lee and Reiko C.Lee(編輯)，Academic Press，1994)。
葡基胺的一個特點就是製備方便。製備葡基胺不需要進行在通常的糖合成反應中經常使用的羥基封閉/解封閉反應。僅需要將單糖或寡糖溶解於飽和碳酸氫銨水溶液中，然後將所得溶液放置3至6天，就可以製備葡基胺(Journal of Carbohydrate Chemistry，8597-611(1989))。
蛋白質可以通過其N末端、C末端或內部胺基酸殘基上的功能基團或通過與蛋白質相連的糖鏈固定到基片上(Biophys.J.，702437-2441(1996))。另外蛋白質也可以通過與接頭形成融合蛋白質而被固定，所述接頭包含對基片表面上的官能團有高度反應活性的殘基(也叫親合標記物)(WO 00/04389)。
除上面所提到的物質外，生物分子(例如脂質)或其它化合物(如藥物)也可以被固定到基片上使用。此外，已知細胞(微生物、動物細胞、植物細胞)也可以固定到基片上，用於不同目的。
如上所述，有許多配體需要結合到基片上。例如為使固定有這樣的配體的材料充分發揮其性能，需要且不可缺少高效的用於固定配體的基片。
發明目的本發明的主要目的是提供一種用於固定配體的基片，這種基片可用於製作這樣一種晶片它能高靈敏度地檢測配體，其靈敏度與使用按上述方法製作的用於固定配體的基片所製作的晶片相當。而且從成本上看很實用，可實際生產並投放市場，另外還提供一種製作所述基片以及用所述基片製成的具有固定配體的材料。
發明概述本發明發明人深入研究了一種製作方法，所述方法從成本來看很實用，可用來實際製作這樣的基片並將之投放市場所述基片用以固定用來高靈敏度地檢測目的受體的配體。結果，本發明發明人發現了一種製作用於固定配體的基片的方法。按照這種方法，其表面預先進行氨基化處理的基片直接用聚丙烯酸酯反應混合物進行處理。這種方法所需的反應步驟和試劑用量比常規方法所需的要少得多。這種方法可用於製作能高靈敏度地檢測配體的晶片，所述靈敏度與由常規方法製作的用於固定配體的基片的靈敏度相當。這種方法從成本上看很實用，可實際生產基片並將之投放市場。因此，本發明得以完成。
本發明概括如下。本發明的第一方面涉及一種用於固定配體的基片，所述基片塗布有預先活化的活化聚陰離子。
根據所述第一方面，活化聚陰子優選為具有易被取代或消除的官能團的活化羧酸酯。聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯可優選用作活化羧酸酯。
本發明的第二方面涉及一種製作用於固定配體的基片的方法，所述方法包括在塗布有聚陰離子、用以固定配體的基片上將聚陰離子活化為活化聚陰離子。
根據所述第二方面，活化聚陰子優選為具有易被取代或消除的功能基團的活化羧酸酯。聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯可優選用作活化羧酸酯。
本發明的第三方面涉及一種具有固定配體的材料，其中核酸被固定在第一方面所述的用以固定配體的基片表面上的預定區域。
本發明的詳細說明本發明對配體沒有特別的限制，只要它是能被特異性受體識別並結合的分子即可。例如配體是核酸、糖鏈、脂質、肽或蛋白質分子。核酸可以是短鏈核酸、長鏈核酸、單鏈核酸、雙鏈核酸、DNA或RNA。DNA可以是雙鏈DNA、單鏈DNA或cDNA。RNA可以是mRNA。短鏈核酸定義為由2至100個核苷酸分子組成的核酸，而長鏈核酸定義為由超過100個核苷酸分子組成的核酸。
配體的例子包括細胞膜受體激動劑和拮抗劑、毒素或毒液、病毒抗原表位、激素(例如鎮靜劑、麻醉劑或類固醇)、激素受體、肽、酶、酶的底物、輔因子、藥物、凝聚素、糖類、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質、抗原、單克隆抗體、凝聚素、細胞、腫瘤細胞、細菌、病毒、化學物質及親和素。
本發明對受體沒有特別的限制，只要它能結合到相應的配體上即可。它可以是天然存在的分子或人工合成的分子。受體的例子包括核酸、糖鏈、蛋白質、肽、酶細胞表面蛋白(受體)、糖蛋白及抗體。
本發明的配體及可與配體結合的受體的接觸表面的性質是互補的。例如，受體可以是能與核酸、糖類、肽或蛋白質結合的核酸、糖類、肽或蛋白質。標記受體可用作受體。
本發明對聚陰離子沒有特別的限制，只要它是含有兩個或多個酸性官能團且可用於連接核酸的化合物即可。
下文詳細說明本發明。
(1)本發明用於固定配體的基片本發明對用於固定配體的基片沒有特別的限制，只要它能用作DNA晶片、蛋白質晶片、糖晶片、生物傳感器等的基片即可。例如，優選使用具有光滑表面且不發螢光的無孔材料(例如玻璃，如螢光載玻片)。
基片優選預先進行表面處理以保留具有陰離子官能團的化合物。可以使用用矽烷-偶聯劑或類似物質處理的基片，如果所述處理沒有給表面處理帶來任何不便的話。
含有如羧基、磷酸根基團或硫酸根基團的酸性官能團，能有效防止核酸非特異性結合的聚合物優選作為用於基片表面處理的聚陰離子。可優選使用的這樣的聚合物的例子包括但不限於聚丙烯酸、聚穀氨酸、聚天冬氨酸或多磷酸。
在聚合物的酸性官能團被活化後，本發明的用於固定核酸的基片可以進行表面處理。連接易被取代或消除的官能團的方法優選用以活化官能團。雖然對於離去基團沒有特別的限制，但優選使用在Cram Hammond，Organic Chemistry，4th edition，1981，McGraw-HillInternational Book Company中描述為好的離去基團的那個離去基團。例如，可優選使用滷基(例如I、Br或Cl基)或烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)的酯或者二醯亞胺基團(如琥珀醯亞胺)。另外，酚類物質(如鄰硝基苯酚或五氟苯酚)或羥基胺物質(如N-羥基苯並三唑或3，4-二氫-3-羥基-4-氧-1，2，3-苯並三唑)也可用於活化。
(2)本發明製作用於固定配體的基片的方法本發明製作用於固定配體的基片的方法的一個實施方案如下所示。製作用於固定配體的基片的常規方法包括如下12個步驟(1)載玻片的氨基化→(2)塗布聚丙烯酸→(3)在二甲基甲醯胺(DMF)中洗滌→(4)在甲醇中洗滌→(5)在0.3N NaOH中洗滌→(6)在蒸餾水(D.W.)中洗滌→(7)→在丙酮中洗滌→(8)乾燥(5小時)→(9)酯化反應→(10)在DMF中洗滌→(11)在二氯甲烷中洗滌→(12)乾燥。本發明製作用於固定配體的基片的方法的一個實施例包括以下6個步驟(1)載玻片的氨基化→(2)聚丙烯酸酯的合成→(3)塗布聚丙烯酸酯溶液→(4)在DMF中洗滌→(5)在二氯甲烷中洗滌→(6)乾燥。傳統的製作方法包括12個步驟。然而，本發明的製作方法包括6個步驟，可用來製作用於固定配體的基片，所述基片能以較高的靈敏度檢測配體。因此，能以較高靈敏度檢測目的配體的晶片可以用本方法來製作，所述方法的步驟數目只有常規方法的一半。
根據本發明製作用於固定配體的基片的方法，優選使用聚丙烯酸作為聚陰離子，用無孔基片(尤其是玻璃)作為基片。
本發明對製備待固定到用於固定配體的基片上的DNA的方法沒有特別的限制。例如，可優選使用應用DNA合成儀化學合成的核酸或者按PCR法、ICAN法(WO 00/56877)或類似方法酶法合成的核酸。例如，合成短鏈核酸時優選使用應用DNA合成儀的化學合成方法，而合成長鏈核酸(DNA)時優選使用酶法，當然這不是對本發明的限制。
本發明製作用於固定配體的基片的方法的一個實施方案如下所示。用於固定目的配體的基片可以使用以下6個步驟得到。
步驟1為進行載玻片的表面處理，可使用例如氨丙基三乙氧基矽烷偶聯劑或類似物質對基片表面進行氨丙基矽烷化處理。
步驟2將N-羥基琥珀醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(下文稱為EDC)和4-二甲基氨基吡啶加入到溶於二甲基甲醯胺中的聚丙烯酸中。溶解後，用三乙胺將pH值調到7至8之間。攪拌混合物使聚丙烯酸轉化為活化酯。
步驟3使用在步驟2中製備的反應混合物或該反應混合物用二甲基甲醯胺稀釋的稀釋液來處理氨丙基矽烷化的載玻片表面。
步驟4在步驟3中製備的載玻片用二甲基甲醯胺洗滌。
步驟5載玻片進一步用二氯甲烷洗滌。
步驟6乾燥洗滌後的載玻片。
按照本發明的製作方法，氨丙基矽烷化載玻片用聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的醯胺取代反應進行塗布。因此，昂貴試劑EDC的用量就減少了。此外，用於洗滌等的溶劑的量也減少了，因為製作步驟減少了一半。因此，從製作方法的總成本、試劑成本和環境負擔的減輕等方面來考慮，這種製作用於固定配體的基片的方法是非常有用的。
通過本發明製作方法步驟2的聚丙烯酸向活化酯的轉化而導致的聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的生成確證如下。
將步驟2所得反應混合物滴加到冰水中。過濾收集所得沉澱得到白色粉末。然後通過檢測白色粉末的紅外吸收光譜進行確證。具體來說，未反應的羧基在1,610-1,550cm-1和1,400cm-1處產生羧酸特異性吸收。另一方面，聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯作為產物在1,736cm-1、1,205cm-1和1,069cm-1處產生酯羰基特異性吸收，而不是上述羧酸特異性吸收。因此，聚丙烯酸向活化酯的轉化得到確證。
此外，目的聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的生成也可以這樣確證將沒發生反應的聚丙烯酸和N-羥基琥珀醯亞胺以及反應後獲得的作為反應產物的白色粉末在薄層色譜(TLC)上展開，然後在紫外線照射下檢測其在254nm處的紫外吸光度。具體來說，由於聚丙烯酸分子量高，即使它轉化為琥珀醯亞胺酯，它在薄層色譜上的遷移率(Rf值)也沒有改變。然而，由於琥珀醯亞胺的接入使紫外吸收增加，未反應的聚丙烯酸可與反應產物分辨開來。因此聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的生成可得到確證。
本發明製作方法所用的聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯白色粉末可以如下獲得用聚丙烯酸與N-羥基琥珀醯亞胺反應，將反應混合物滴加到冰水中，過濾所得沉澱，獲得白色粉末。隨後將聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯白色粉末溶解於二甲基甲醯胺中，所得溶液可用來處理氨丙基矽烷化的載玻片表面。然後就可以製得用於固定配體的基片，這種基片可用來製作能高靈敏度地檢測目的配體的晶片。因此，聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯可以以粉末形式長期穩定保存。
(3)配體的固定以下方法可用以將DNA、糖類或蛋白質固定到用本發明所述方法製作的用於固定配體的基片上。
若固定DNA，可以應用在WO 01/02538中描述的方法。具體來說，製備其5′末端被氨基、硫醇基、磷酸基、醛基等修飾的待固定的DNA衍生物，或製備被修飾的5′末端連有作為間隔基(如烷基胺)的交聯劑或接頭的衍生物。5′末端的修飾對短鏈核酸如寡核苷酸的固定尤其有用。此外，固定可以通過向DNA鏈內部引入一個合適的官能團來進行。在此情況下，DNA的合成可以在合適的經修飾的核苷酸的存在下進行。另外，DNA也可進行化學修飾。例如，Label It試劑(Mirus)可以用來修飾核酸。目的核酸可如下固定到基片上將經修飾的核酸溶解於適合固定的溶劑(如20mM 3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)緩衝液(pH7.5)或50mM碳酸鹽緩衝液(pH9.5))中，濃度為0.01-2.0mg/ml，優選0.1-1.0mg/ml；然後該溶液以其原來狀態或經變性後與本發明的基片接觸，其中基片上的羧酸已通過表面處理轉變為活化酯。具體來說，使用一種用以製作DNA晶片的儀器(DNA Arrayer)將一定量的DNA溶液點樣到表面具有活化酯的基片上。基片在增溼培養箱中溫育30-60分鐘後，用2％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌，然後用蒸餾水洗滌。此外，含有固定核酸的基片任選在室溫下的0.3N NaOH中浸泡5分鐘或在沸水中浸泡2分鐘以使核酸變性，接著在蒸餾水中洗滌，再在無水乙醇中洗滌，然後乾燥。通過這種處理，沒有與核酸反應的活化酯被水解成羧基(即帶負電)。由於酸性基團會阻止核酸探針與基片之間的非特異性靜電結合，通常聚賴氨酸載玻片所需的琥珀酸酐封閉過程就可以省略。此外，酸性基團能減低背景信號。
除DNA外，各種配體能被固定到本發明的用於固定配體的基片上。可以選擇對於配體來說最有效的方法。可以採用適合配體和活化固相基片的性質的方法進行固定。對配體固定時可用以溶解或懸浮配體的溶劑沒有特別的限制。例如優選水溶液、二甲亞碸、二甲基甲醯胺或其混合物。配體溶液或懸浮液可以包含洗滌劑。例如，加入甘油、聚乙二醇、糖或鹽可有效調整點樣點的形狀或防止其乾燥。
含有氨基或硫醇基的糖可以被固定到具有活化羧酸的固相基片上，所述羧酸的活化可以採用如N-羥基琥珀醯亞胺酯基團或滷素基團。例如，含有高度活潑的氨基的葡基胺優選固定到本發明的固相基片上。
另外，使用交聯劑和/或反應助催化劑，可以在糖目標和固相基片之間形成共價鍵。
許多交聯劑可以從市上購得。例如，具有不同的活性基團或分子長度的化合物如乙二醇-雙-(琥珀酸琥珀醯亞胺酯)或N-(ε-馬來醯氨基己醯氧基)琥珀醯亞胺酯可從Pierce購得。可以按照本發明根據固相基片與糖目標的組合從上述的交聯劑中正確地選擇交聯劑，。
例如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺、雙環己基碳二亞胺或其鹽可優選作為反應助催化劑，當然這不是對本發明的限制。
將配體固定到固相基片上時，對於三種或四種物質(即配體、固相基片、交聯劑和/或反應助催化劑)的接觸順序沒有特別的限制。例如，接觸順序可以如下。
(1)所述三種或四種物質同時相互接觸；(2)配體和固相基片相互接觸，然後交聯劑和/或反應助催化劑與其接觸，或(3)配體和固相基片中的一種先與交聯劑和/或反應助催化劑接觸，然後餘下的一種與其接觸。
如果配體是細胞，如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、酵母、原生動物、蠕蟲、培養的動物或植物細胞，所述細胞可以是活的或死的。上述方法可以用於將所述細胞固定到固相基片的表面上。例如，可以利用細胞表面上的氨基將細胞固定到本發明的用於固定配體的基片上。
細胞可以用常用的微生物學或組織化學固定方法來固定。細胞固定意思是使細胞失活，在概念上必須與固定到固相基片或固相固定相區別。微生物學或組織化學固定方法的例子包括乾燥固定、用70％至90％乙醇固定以及用戊二醛或甲醛固定。微生物學或組織化學固定可以在固定到固相基片或固相固定進行之前或之後進行。
通過蛋白質N末端、C末端或內部胺基酸殘基上的活化的具有酯反應活性的官能團，或通過連接到蛋白質上的糖鏈，可以將蛋白質固定到本發明的用於固定配體的基片上。另外待固定蛋白質也可以通過與接頭形成融合蛋白質而被固定，所述接頭包含對基片表面上的活化酯有高度反應活性的殘基(也叫親合標記物)。通過接頭連接是有利的，因為蛋白質在基片表面上的失活可被抑制。尤其是，如果要固定抗體或其片段，優選與接頭形成熔合蛋白來固定。
對接頭沒有特別的限制。任何含有2至100個殘基的異聚或同聚肽都可以使用。同聚肽的例子包括聚半胱氨酸、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚組氨酸。
接頭可以包含一個或多個非天然胺基酸。一種在其中採用了能識別琥珀密碼子的抑制型tRNA的方法可用來引入非天然胺基酸(Science，244182-188(1989)；Methods Enzym.，202301-336(1991)；Chem.Biol.，31033-1038(1996))。
如果生物素或抗原用作接頭，它是通過化學方法交聯到蛋白質上的。
本發明對用來檢測與配體結合的受體的信號發射物質沒有特別的限制。可以使用螢光物質或發光物質。例如，可優選使用化學發光物質如AMPPD或螢光物質如螢光素、Cascade Blue、Oregon Green、BODIPY、Rhodamine Green、Alexa Fluor、Texas Red、Cy3或Cy5。
如上所述，本發明用於固定配體的基片具有高靈敏度地檢測受體的能力，所述靈敏度與用常規方法(例如WO01/02538中介紹的方法)製作的基片的靈敏度相當。由於本發明製作用於固定配體的基片的方法所包含的步驟比常規方法的要少，製作方法的總成本以及要用的試劑的成本降低，因而可以將高質量、低成本的用於固定配體的基片投放市場。另外，由於可以減少試劑的用量，試劑對全球環境的壓力得以減輕。
實施例以下實施例進一步詳細說明本發明，但是不能理解為對本發明範圍的限制。
實施例1製備轉化為活化酯的聚丙烯酸(1)1.0g聚丙烯酸(分子量1,000,000；Wako Pure ChemicalIndustries)溶於200ml二甲基甲醯胺中。然後往其中加入4.8g N-羥基琥珀醯亞胺(Nacalai Tesque)、8.0g N-乙基-N』-二甲基氨丙基碳二亞胺鹽酸鹽(Peptide Institute)以及52mg 4-二甲基氨基吡啶(NacalaiTesque)，同時用冰冷卻。試劑溶解後，用三乙基胺將pH調到7至8。所得混合物在室溫下攪拌過夜。此溶液指定為聚丙烯酸酯溶液1。
(2)將實施例1-(1)所得的反應混合物滴加到三倍體積的冰冷的蒸餾水中。過濾收集所得的沉澱，用水洗滌後再用乙醇洗滌，然後減壓乾燥得到1.7g聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯白色粉末(收率為72.6％)。
(3)測定實施例1-(2)所得的反應產物聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的紅外吸收光譜。未反應的羧基在1,610-1,550cm-1和1,400cm-1處產生羧酸特異性吸收。白色粉末在1,735.8cm-1、1,205.4cm-1和1,068.5cm-1處產生酯羰基特異性吸收，而不是上述的羧酸特異性吸收。此外，聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯用薄層色譜(TLC)進行分析。聚丙烯酸、N-羥基琥珀醯亞胺以及溶於二甲基甲醯胺的白色粉末點樣於矽膠薄層板(MERCK TLC aluminiumsheets Silicagel 60F254，Merck)上。風乾後，用氯仿/甲醇/醋酸(9∶1∶1，v/v)展開。
由於聚丙烯酸分子量高，即使它被轉化為琥珀醯亞胺酯，它在薄層色譜上的遷移率(Rf值)也沒有改變。然而，由於接上琥珀醯亞胺會增加紫外吸收，未反應的聚丙烯酸可以與反應產物分別開來。展開後，將薄層板風乾並暴露於254nm紫外線。於是在N-羥基琥珀醯亞胺中心的周圍觀察到強烈的吸收。在原點(Rf＝0)觀察到白色粉末的強烈吸收。沒有觀察到聚丙烯酸的吸收。基於這些結果，聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯的生成得以確證。
實例2用轉化為活化酯的聚丙烯酸對載玻片進行表面處理(1)將一張顯微鏡載玻片(Matsunami Glass)依次浸入2M硝酸、2M氫氧化鈉溶液和蒸餾水中，並且分別超聲處理10分鐘。將3-氨丙基三乙氧基矽烷(Nacalai Tesque)加入到95％乙醇中至8％的終濃度。處理過的載玻片在此溶液中浸泡2分鐘，然後用烤箱在100℃處理10分鐘，使載玻片表面氨丙基矽烷化。將氨丙基矽烷化的載玻片浸入聚丙烯酸酯溶液1中或實施例1所得的聚丙烯酸琥珀醯胺酯白色粉末溶於99.5％二甲基甲醯胺的溶液中過夜(以下稱為聚丙烯酸酯溶液2)。載玻片依次在二甲基甲醯胺和二氯甲烷中超聲洗滌，然後減壓乾燥。
(2)使用實施例2-(1)製作的用於固定核酸的基片製作人類模式DNA晶片並如下評估。列於表1和表2中的20個人類基因用作測試核酸。用PCR製備核酸片段。PCR所用引物的核酸序列見SEQ ID NO1至40。各基因的PCR引物對見表1和2。5′引物在其5′端用氨基修飾。
圖15示出最初焦油112和壓力為1巴(絕對值)的實驗114、壓力為7.9巴(絕對值)的實驗116和壓力為28.6巴(絕對值)的實驗118中不同碳原子數的碳化合物所對應重量百分比的曲線，加熱速率為10℃/天。從最初焦油112和壓力為1巴(絕對值)的實驗114的曲線可以看出，熱解作用使平均碳數分布移向較低的碳數。例如，112的碳數分布曲線中平均碳數約為碳原子數19，而114的碳數分布曲線中平均碳數約為碳原子數17。壓力提高到7.9巴(絕對值)的實驗116則使平均碳數分布進一步移向更低的碳原子數。壓力提高到7.9巴(絕對值)的實驗116使碳數分布中平均碳數移到約碳原子數13。壓力提高到28.6巴(絕對值)的實驗118使平均碳數降低到約11。據信提高壓力能夠通過提高產物流體中的氫氣分壓而降低平均碳數。產物流體中氫氣分壓升高能使氫化反應、脫芳構化反應和/或大分子熱解形成較小分子的反應得以進行。增加壓力還能提高產出流體的品質。例如，流體的API比重從最初焦油樣品的約6°提高到壓力1巴(絕對值)時表2
進行PCR後，所述20個擴增片段按照常規方法純化，然後溶解於TaKaRa Solution T(Takara Bio)中，濃度為0.3μg/μL。由此得到的溶液用於點樣。此溶液用Affymetrix 417 Arrayer(Affymetrix)點樣到實施例2-(1)所得的活化聚丙烯酸酯塗布的載玻片上。所述載玻片在0.2％SDS中洗滌，然後在蒸餾水中洗滌兩次，再用0.3N氫氧化鈉溶液室溫下處理5分鐘。然後，載玻片在蒸餾水中洗滌5分鐘，在95℃加熱2分鐘，用冰冷的100％乙醇衝洗，最後離心乾燥。所得的含有固定核酸的基片在隨後的反應中用作DNA晶片。
(3)通過雜交進行確證如下。簡要地說，鮭精DNA用Label ITCy3 Label Kit(Mirus)按照試劑盒上的說明進行Cy3螢光標記，然後純化。螢光標記的鮭精DNA片段用雜交液稀釋至0.1μg/μL的終濃度。用蒸餾水、Label IT緩衝液D1和N1進行變性。然後，所述DNA溶解於雜交緩衝液中，最終濃度為0.01μg/μL。
將約9μL所述雜交液滴加到一張蓋玻片上。載玻片有固定DNA的一面朝下蓋住所述蓋玻片，蓋時要特別小心，以免氣泡進入。將蓋住的載玻片小心翻轉過來，注意不能讓蓋玻片滑動，然後置入增溼培養箱，在37℃溫育30分鐘。溫育後，室溫下用2×SSC移除蓋玻片。載玻片在含有0.1％SDS的0.2×SSC中衝洗5分鐘後用0.2×SSC洗滌，然後在約1,000rpm下低速離心去除水分，風乾。
風乾後，載玻片用Affymetrix 418TMArray Scanner(Affymetrix)在激發波長532nm、發射波長570nm下進行測定。結果在載玻片的所有點樣點上都觀測到螢光信號。
實施例3(1)依照實施例2描述的方法用聚丙烯酸酯溶液1製作的用於固定核酸的基片與依照WO 01/02538所描述的方法製作的用於固定核酸的基片在用它們製作的人類模式DNA晶片的檢測靈敏度的基礎上相互進行比較。具體來說，使用與實施例2所描述的相同測試核酸製備實施例2所描述的20個人類基因的點樣溶液。使用Affymetrix 417Arrayer將這些點樣溶液點樣到實施例2所製作的用於固定核酸的載玻片上，或點樣到按常規方法製作的用於固定核酸的載玻片上。所述載玻片在2％SDS中洗滌並在蒸餾水中洗滌兩次，再用0.3N氫氧化鈉溶液在室溫下處理5分鐘。然後，載玻片在蒸餾水中洗滌5分鐘，在95℃加熱2分鐘，用冰冷的100％乙醇衝洗，離心乾燥。這樣獲得的含有固定核酸的基片在隨後的反應中用作DNA晶片。
(2)如下製備用於檢測和雜交的標記cDNA。簡要地說，polyA(+)RNA是用TRIzol Reagent(Gibco BRL)和Oligotex-dT30Super(Takara Bio)按試劑盒上的使用規程從人HL-60細胞(Dainippon Pharmaceutical)和人A431細胞(Dainippon Pharmaceutical)製備得到的。用1μg HL-60細胞polyA(+)RNA和1μgA341細胞polyA(+)RNA分別作為模板，並且用RNA Fluorescence Labeling CoreKit(M-MLV Version)(Takara Bio)按照試劑盒的使用規程製備一條Cy3標記的cDNA和一條Cy5標記的cDNA，然後純化。按照IntelliGene(Takara Bio)所附的使用說明將實施例3-(1)製作的兩種DNA晶片與Cy3標記的cDNA和Cy5標記的cDNA的混合物進行雜交、洗滌和乾燥操作。使用Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix)得到Cy3(激發波長532nm，發射波長570nm)和Cy5(激發波長635nm，發射波長660nm)的螢光影象。採用影象定量分析軟體ImaGene 4.1(Biodiscovery)對各個點樣點的信號強度和背景信號強度進行定量。通過上述20個基因各點樣點的信號強度(雜交信號強度)減去背景信號強度計算得到平均值，以及各點樣點的信號強度與背景信號的比值的平均比值(信噪比)。結果，用按本發明方法製作的含有固定核酸的載玻片製作的DNA晶片觀測到的雜交信號強度和信噪比等於或大於用按常規方法製作的含有固定核酸的載玻片製作的DNA晶片觀測到的相應值。基於這些結果，可以確認，如同按常規方法製作的用於固定核酸的基片一樣，按本發明的製作方法製作的用於固定核酸的基片可優選用作用於固定核酸的基片，所述基片使得能高靈敏度地檢測核酸的DNA晶片的製作成為可能。
實施例4
(1)聚丙烯酸轉化為活化酯將1.0g聚丙烯酸(分子量1,000,000)溶解於200ml的二甲基甲醯胺中。然後向此溶液加入4.8g N-羥基琥珀醯亞胺、8.0g N-乙基-N′-二甲基氨丙基碳二亞胺鹽酸鹽以及52mg 4-二甲基氨基吡啶，同時用冰冷卻。試劑溶解後，用三乙胺將pH調到7至8。所得混合物在室溫下攪拌過夜。
(2)塗布劑的製備實施例4-(1)製備的反應混合液通過裝有濾紙並蓋有已用二甲基甲醯胺洗滌的Celite 545硅藻土的布氏漏鬥過濾。用二甲基甲醯胺將濾液定容至200ml，得到塗布劑。
(3)載玻片的表面處理在2M硝酸、2M氫氧化鈉以及蒸餾水中對一張顯微鏡載玻片進行超聲處理10分鐘。往95％乙醇中加入3-氨基丙基三乙氧基矽烷至4％的終濃度。將經超聲處理的載玻片在此溶液中浸泡30分鐘，然後在烘箱中100℃處理10分鐘以使載玻片表面氨丙基矽烷化。
經氨丙基矽烷化的載玻片在實施例4-(2)得到的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中超聲洗滌，然後減壓乾燥。
(4)固定率的測定用預先合成的末端有氨基的Cy3標記的引物以及末端有氨基的非標記的引物，用PCR方法製備Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段。Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段的溶液與TaKaRaSolution I(Takara Bio)混合。
所得的混合物用Affymetrix 417 Arrayer點樣到實施例4-(3)製作的載玻片上。用Affymetrix 428 Array Scanner在激發波長532nm、發射波長570nm下進行測定。結果在載玻片的所有點樣點上觀測到螢光信號。
測定後，載玻片依次在0.2％SDS、Milli-Q水、0.3N氫氧化鈉、Milli-Q水、100℃Milli-Q水以及冰冷的乙醇中洗滌，在約1,000rpm下低速離心去除水分，風乾。風乾後，用Affymetrix 428 Array Scanner在激發波長532nm以及發射波長570nm下進行測定。測定所得影象用微陣列定量軟體ImaGene 4.2進行定量，DNA固定率用聚類軟體GeneSight V3.0.7計算得到。
結果，在實例4-(3)的載玻片上的DNA固定率在13至26％之間，平均值約為20％。在實例3的載玻片上的DNA固定率為23至34％之間，平均值約為28％。即使在塗布劑中浸泡的時間從16小時縮短到1小時也觀測到相等的或更高的DNA固定率。
實施例5(1)聚丙烯酸轉化為活化酯將3.25g聚丙烯酸(分子量1,000,000)溶解於650ml二甲基甲醯胺中。然後向此溶液中加入14.6g N-羥基琥珀醯亞胺和22.75mlN-乙基-N′-二甲基氨丙基碳二亞胺，同時用冰冷卻。試劑溶解後，用三乙胺將pH調到7至8。所得混合物在室溫下攪拌過夜。
(2)塗布劑的製備實例5-(1)所得的反應混合物通過裝有濾紙並蓋有已用二甲基甲醯胺洗滌的Celite 545硅藻土的布氏漏鬥過濾。用二甲基甲醯胺將濾液定容至1.3L，得到塗布劑。
(3)載玻片表面處理在2M硝酸、2M氫氧化鈉以及蒸餾水中將一張顯微鏡載玻片超聲處理10分鐘。往95％乙醇中加入3-氨基丙基三乙氧基矽烷至4％的終濃度。將經超聲處理的載玻片在此溶液中浸泡30分鐘，然後在烘箱中100℃處理10分鐘以使載玻片表面氨丙基矽烷化。
經氨丙基矽烷化的載玻片在實施例5-(2)所得的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中超聲處理，然後減壓乾燥。
(4)固定率測定用預先合成的末端有氨基的Cy3標記的引物以及末端有氨基的非標記的引物，用PCR方法製備Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段。Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段的溶液用TaKaRaSolution I(Takara Bio)混合。
所得的混合物用Affymetrix 417 Arrayer點樣到實施例5-(3)製備的載玻片上。用Affymetrix 428 Array Scanner在激發波長532nm和發射波長570nm下進行測定。結果在載玻片的所有點樣點上觀測到螢光信號。
測定後，載玻片依次在0.2％SDS、Milli-Q水、0.3N氫氧化鈉、Milli-Q水、100℃Milli-Q水及冰冷的乙醇中洗滌，在約1,000rpm下低速離心去除水分，風乾。風乾後，採用Affymetrix 428 Array Scanner在激發波長532nm及發射波長570nm下進行檢測。檢測所得影象用微陣列定量軟體ImaGene 4.2進行定量，DNA固定率用聚類軟體GeneSight V3.0.7計算得到。
結果，在實例5-(3)的載玻片上的DNA固定率在37至50％之間。即使在N-乙基-N′-二甲基氨基丙烷碳二亞胺鹽酸鹽被N-乙基-N′-二甲基氨丙基碳二亞胺代替也觀測到相等的或更高的DNA固定率。
實例6
(1)聚丙烯酸轉化為活性酯聚丙烯酸酯如實例5-(1)描述的那樣製備。
(2)塗布劑的製備塗布劑如實例5-(2)描述的那樣製備。
(3)載玻片的表面處理在2M硝酸、2M氫氧化鈉以及蒸餾水中將一張顯微鏡載玻片超聲處理10分鐘。往95％乙醇中加入3-氨丙基三乙氧基矽烷至4％的終濃度。將經超聲處理的載玻片在此溶液中浸泡30分鐘，然後在烘箱中100℃處理10分鐘以使載玻片表面氨丙基矽烷化。
經氨丙基矽烷化的載玻片在實例6-(2)所得的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中洗滌，然後減壓乾燥。
(4)重複使用塗布劑-1新製作的經氨丙基矽烷化的載玻片在實例6-(3)所用的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中超聲處理，然後減壓乾燥。
(5)重複使用塗布劑-2新製作的經氨丙基矽烷化的載玻片在實例6-(4)所用的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中超聲處理，然後減壓乾燥。
(6)重複使用塗布劑-3新製作的經氨丙基矽烷化的載玻片在實例6-(5)所用的塗布劑中浸泡1小時。所述載玻片依次在二甲基甲醯胺和乙腈中超聲處理，然後減壓乾燥。
(7)測定固定率用預先合成的末端有氨基的Cy3標記的引物以及末端有氨基的非標記的引物，用PCR方法製備Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段。Cy3標記且末端氨基化的DNA片段和非標記且末端氨基化的DNA片段的溶液用TaKaRaSolution I(Takara Bio)混合。
所得的混合物用Affymetrix 417 Arrayer點樣到實施例6-(3)、(4)、(5)和(6)製作的載玻片上。用Affymetrix 428 Array Scanner在激發波長532nm和發射波長570nm下進行測定。結果在所有的載玻片的所有點樣點上觀測到螢光信號。
測定後，各載玻片依次在0.2％SDS、Milli-Q水、0.3N氫氧化鈉、Milli-Q水、100℃Milli-Q水及冰冷的乙醇中洗滌，在約1,000rpm下低速離心去除水分，風乾。風乾後，採用Affymetrix 428 ArrayScanner在激發波長532nm及發射波長570nm下進行檢測。檢測所得影象用微陣列定量軟體ImaGene 4.2進行定量，DNA固定率用聚類軟體GeneSight V3.0.7計算得到。
結果，在實施例6-(3)、實施例6-(4)、實施例6-(5)和實施例6-(6)的載玻片上的DNA固定率分別在41至45％之間、42至48％之間、39至42％之間和39至46％之間。在所有情況下平均值約為40％或更高。因此，可以確認，重複使用塗布劑後與最初固定DNA的能力相當的能力仍得以保持。
工業實用性本發明提供了一種用於固定配體的低成本基片，所述基片使得能夠高靈敏度地檢測目的受體。此外，提供了一種用所述基片製作的帶有固定配體的材料，所述材料可用來高靈敏度地檢測和分析目標受體。
序列表獨立文本SEQ ID NO1為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO2為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO3為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO4為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO5為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO6為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO7為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO8為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO9為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO10為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO11為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO12為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO13為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO14為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO15為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO16為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO17為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO18為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO19為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO20為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO21為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO22為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO23為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO24為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO25為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO26為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO27為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO28為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO29為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO30為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO31為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO32為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO33為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO34為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO35為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO36為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO37為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO38為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO39為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO40為擴增相應基因的DNA片段而設計的寡核苷酸引物序列表110TAKARA BIO INC.
120用於固定配體的基片130663404150JP 2001-2881491512001-09-2116040210121120212DNA213人工序列220
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223設計用於擴增相應基因的DNA片段的寡核苷酸引物40039gaaacatctg agcactatga20
2104021120212DNA213人工序列220
223設計用於擴增相應基因的DNA片段的寡核苷酸引物40040tgccattgtg cctcagcaca20
權利要求
1.一種用於固定配體的基片，所述基片塗布有預先活化的活化聚陰離子。
2.權利要求1的基片，其中活化聚陰離子為含有易被取代或消除的官能團的活化羧酸酯。
3.權利要求2的基片，其中活化羧酸酯為聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯。
4.一種製作用於固定配體的基片的方法，所述方法包括在用於固定配體的聚陰離子塗布基片上將聚陰離子活化為活化聚陰離子。
5.權利要求4的方法，其中活化聚陰離子為含有易被取代或消除的官能團的活化羧酸酯。
6.權利要求5的方法，其中活化羧酸酯為聚丙烯酸琥珀醯亞胺酯。
7.一種含有固定配體的材料，所述材料中核酸被固定於權利要求1所定義的用於固定配體的基片表面上的預定區域。
全文摘要
一種用預先活化的聚陰離子塗布的用於固定配體的載體。
文檔編號G01N33/543GK1639568SQ0282290
公開日2005年7月13日 申請日期2002年9月20日 優先權日2001年9月21日
發明者淺田起代藏, 妹背信行, 武田理, 六島正知, 加藤鬱之進 申請人:寶生物工程株式會社