用於增加生存年限和健康年限的組合物和方法

2023-06-07 06:21:41 4

專利名稱：用於增加生存年限和健康年限的組合物和方法
用於增加生存年限和健康年限的組合物和方法相關申請的交叉引用本申請要求於2009年6月12日提交的美國臨時申請第61/186，709號和於2009 年6月17日提交的美國臨時申請第61/187，905號的優先權，通過引用將上述申請的全部內容併入本文。
背景技術：
提供以下描述是為了有助於閱讀者的理解，並不是承認提供的信息或引用的文獻是本發明的現有技術。長壽一直是最熱門的科學領域之一，但在研究領域中仍然對其知之甚少。嚴格和科學地講，人們不知道如何衡量衰老。衰老並不僅是年齡的問題。某些人在晚年時仍活躍並且敏捷，而其他人在中年時就受到衰老疾病的折磨(心臟病、高血壓、中風、糖尿病、癌症、 阿爾茨海默病和痴呆等)。公認的是幾乎世界各地的人群都在快速老齡化。65歲及以上的人口比例正在從 2005年的7%增加至2050年的16%。老年人口數已經是1950年時的3倍，並且到2050年將是現在的3倍，即15億人會超過65歲。然而有關尋找對生存年限/健康年限具有顯性正性作用的單基因突變的衰老研究還未獲得成功。衰老是全身性的退行性變，並且可能不是由於單個基因或系統的改變。Leonard Hayflick首次觀察到細胞分裂的有限性現象，現在被稱為Hayflick極限。在細胞分裂時，DNA的複製不能一直進行到染色體的末端。端粒是位於染色體末端的重複性DNA區，用於保護染色體末端免於退化。沒有端粒，細胞在複製時會失去其染色體末端和其中含有的必要信息。端粒作為封閉染色體末端的可丟棄的緩衝區，在細胞分裂時被消耗，但能通過端粒酶補充。端粒酶能通過添加TTAGGG重複序列來補充染色體的3'末端 (Autexier C et al. 2006，Collins K et al. 2006)。因此通過暫時活化端粒酶或用基因療法來延長某些重要細胞中的端粒很久以來一直被認為是延長生命的方法。利用線蟲類中的秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans) 進行的研究表明延長端粒和增長的生存時間之間存在關聯性。端粒較長的蠕蟲平均存活M 天，比正常蠕蟲長約 20% (Artandi SE et al. 2000)。發明概述本發明涉及柔毛水楊梅(Geum japonic·)有機提取物(OEGJ)，及其提高細胞培養體系中細胞壽命的作用。本發明人意外地發現，經OEGJ處理的培養細胞以及經OEGJ治療的實驗動物組織細胞中呈現出顯著增加的端粒酶活性。OEGJ在動物模型中的研究進一步證實了 OEGJ能延長生存年限，並上調諸如Atkl、Bcl2、VEGF和NF κ B的存活增強基因和端粒酶的活性。這些被OEGJ誘導上調的基因表達可能是實驗動物存活和壽命提高的內在機制。在一些實施方案中，本發明涉及藥物組合物的應用和提高壽命和生活質量的方法。具體而言，本發明涉及用於在哺乳動物個體中增強活力和刺激端粒酶活性的藥物組合物和方法，因此所述藥物組合物和方法可用於抗衰老以及顯著提高健康生存年限和壽命。
一方面，本公開提供了提高有需要的個體的壽命和生活質量的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的0EGJ。在一個實施方案中，所述提取物的給藥能刺激端粒酶和一種或多種選自Aktl、Bcl2、EGF、VEGF和NF κ B的細胞存活因子的表達。在一個實施方案中， 與未給予所述提取物的個體相比，所述提取物的給藥提高生存年限或生活質量。在一個實施方案中，所述個體是人。在一個實施方案中，所述有機提取物是乙醇提取物。在一個實施方案中，所述有機提取物是甲醇提取物。在一個實施方案中，所述提取物通過口服給藥。在一個實施方案中， 所述提取物通過皮下注射、肌內注射或靜脈輸注進行給藥。在一個實施方案中，所給予的提取物的量為0. 01mg/kg/天至10000mg/kg/天。在一個實施方案中，所述有效量的提取物是包含所述提取物和合適的載體或賦形劑的藥物製劑的形式。另一方面，本公開提供用於提高個體的壽命和生活質量的藥物組合物，其包含有效量的OEGJ和藥學可接受的載體。另一方面，本公開提供預防或治療有需要的個體中的糖尿病的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的0EGJ。另一方面，本公開提供預防或治療有需要的個體中的眼部疾病或疾病狀態的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的0EGJ。另一方面，本公開提供治療有需要的個體中的炎症的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的0EGJ。另一方面，本公開提供增強具有創傷的個體的創傷癒合的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的0EGJ。在一個實施方案中，所述創傷是褥瘡。附圖簡要描述

圖1顯示OEGJ提高秀麗隱杆線蟲的存活能力或預期壽命。野生型N2秀麗隱杆線蟲生長在用大腸桿菌(Escherichia coli)菌株0P50劃線的NGM瓊脂板上，在通風培養箱中進行培養。用0EGJ(150yg/ml)處理受試組中位於Ll期的N2蠕蟲，用等量溶劑處理對照組的蠕蟲。為了測試OEGJ處理的蠕蟲的存活能力，將培養溫度增加至27°C。Ct-7:27°C下保持7天的未處理對照組的N2蠕蟲，部分蠕蟲死亡，部分蠕蟲仍然存活，但未觀察到幼體蠕蟲。0EGJ-7 相同狀態下保持7天的OEGJ治療的蠕蟲，幾乎沒有蠕蟲死亡，並且有趣的是， 觀察到很多幼體蠕蟲。Ct-14 :27°C下孵育14天後，未處理對照組的所有N2蠕蟲都死亡。 0EGJ-14 在27°C下孵育14天後，儘管OEGJ處理的樣品中大部分成體蠕蟲死亡，但觀察到很多幼體蠕蟲仍然存活。圖2 =OEGJ處理對N2秀麗隱杆線蟲的生存時間/健康時間的影響。Ct 未處理的對照N2蠕蟲。Tr :0EGJ處理的蠕蟲。結果表明，幾乎在所有檢查點，OEGJ處理組中觀察到的活的蠕蟲都多於未處理組。到第38天為止，未處理組的所有蠕蟲都死亡。然而，OEGJ處理組中約5%的蠕蟲仍然存活。OEGJ處理組中剩餘的蠕蟲在第42天死亡，比未處理的對照蠕蟲長約10%。圖3 =OEGJ處理對daf-2秀麗隱杆線蟲的生存時間/健康時間的影響。Ct 未處理的對照daf-2蠕蟲。Tr :0EGJ處理的蠕蟲。我們發現，幾乎在所有觀察點，OEGJ處理組中觀察到的活的蠕蟲都多於未處理組。在第56天，未處理的對照組中約5%的蠕蟲存活；然而， OEGJ處理組中仍然有約10%的蠕蟲存活。
圖4 =OEGJ處理對daf-16秀麗隱杆線蟲的生存時間/健康時間的影響。Ct 未處理的對照daf-16蠕蟲。Tr =OEGJ處理的daf-16蠕蟲。到第12天為止，未處理的對照組中約77%的蠕蟲死亡。相比之下，OEGJ處理組中約50%的蠕蟲在第12天時仍然存活。也就是說，未處理組中死亡的蠕蟲比OEGJ治療組多約27%，這表明OEGJ處理顯著增加健康時間。圖5 =OEGJ處理對daf-2秀麗隱杆線蟲的生存時間/健康時間的影響，該daf_2秀麗隱杆線蟲在20°C下同步化為Ll並在20°C下繼續培養。Ct 未處理的對照daf-2蠕蟲。 Tr =OEGJ處理的蠕蟲。OEGJ處理組中約58%的蠕蟲在第21天仍然存活。相比之下，到第 21天為止，未處理的對照組中約58%的蠕蟲已經死亡。在所有檢查點，OEGJ處理組中存活的蠕蟲比未處理的對照蠕蟲多約5-15%，提示OEGJ處理能增加蠕蟲的健康時間和存活時間。圖6 =OEGJ處理誘導心臟中mTERT表達的上調。Ctr 來自未處理的對照小鼠心臟的mTERT信號。0EGJ-1 4代表來自OEGJ處理的小鼠心臟的mTERT信號。在所有4個 OEGJ處理的心臟樣品中都觀察到mTERT的陽性信號，表現出的mTERT表達比未處理的對照樣品(Ctr)高約 24_8_13_27 倍。圖7 =OEGJ誘導SAMPlO小鼠腦中的新血管生成。a 在OEGJ治療小鼠的海馬區周圍觀察到顯著增多(15-25%)的血管(圓圈)；b 相比之下，在未治療的對照小鼠的海馬區周圍發現較少的血管(圓圈)；c:在OEGJ治療小鼠的額葉皮質區中觀察到增多(15-25%) 的血管(圓圈)；d 在未治療的對照動物的相同區域發現較少的血管(圓圈)。圖8 :0EGJ誘導SAMPlO小鼠腦中的神經元再生。a 在未治療的對照小鼠的海馬區中幾乎未觀察到陽性Ki67信號；b 在OEGJ治療的動物的海馬DG區的內緣中發現具有顆粒細胞核形狀的一些暗棕色Ki67陽性信號(圓圈)，提示有神經元再生；c 在未治療的對照小鼠的額葉皮質區幾乎未發現Ki67陽性信號；d 在OEGJ治療的小鼠的額葉皮質區鑑定出一些Ki67陽性的具有神經元形狀的細胞(紅色圓圈)。發明詳細描述在各個方面，本發明提供用於增加壽命和預防或治療各種醫學疾病狀態的化合物、提取物和方法。本文提供的化合物可以配製為可用於公開的方法的藥物組合物和藥物。 還提供了所述化合物和提取物在製備藥物製劑和藥物中的用途。應當理解，為了提供對本發明的實質性理解，下文以不同詳細程度描述了本發明的某些方面、模式、實施方案、變化和特徵。以下術語在全文中按下文所述使用，除非上下文明確指明另外情況。本文中，試劑或藥物對個體的「給藥」包括將化合物引入或遞送至個體以行使化合物預期功能的任何途徑。可以通過任何合適的途徑進行給藥，包括口服、鼻內、胃腸外(靜脈內、肌內、腹膜內或皮下)、直腸或局部給藥。給藥包括自給藥和由他人給藥。還應當理解，所描述的治療或預防醫學疾病狀態的各種模式意圖表示「實質性的」，其不僅包括完全的治療或預防，還包括未達到完全的治療或預防，但實現了一些生物學或醫學相關的結果。本文所用的術語組合物的「有效量」或「藥學有效量」或「治療有效量」是足以實現所需治療和/或預防效果的量，例如，實現了所治療疾病相關的症狀的預防或減少的量。給予個體的本發明組合物的量將取決於疾病的類型和嚴重程度以及個體的特徵，例如一般健康狀況、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。其還取決於疾病的程度、嚴重性和類型。本領域技術人員根據這些因素以及其它因素能確定合適的劑量。本發明的組合物也可以與一種或多種其它治療化合物聯合給藥。在沒有特別指明的情況下，本發明所用的縮寫「0EGJ」表示下文所述的植物柔毛水楊梅的有機溶劑提取物。本文所用的術語「壽命」是指動物的生存年限。因此，壽命是指動物生存年限的年數。在一些實施方案中，當術語「增加的壽命」涉及給予了本發明組合物的個體時，表示給予了所述組合物的未患病動物的生存年限相對於未給予所述組合物的另一未患病動物有所增加。在一些實施方案中，與未給予所述組合物的未患病動物相比，動物的壽命增加至少 6個月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少10年。在一些實施方案中，與未給予所述組合物的未患病動物相比，動物壽命增加至少1年，但不多於10年、不多於5年或不多於4年。本文所用的術語「治療(treating) 」或「治療(treatment) 」或「緩解」是指治療性處理和預防性(prophylactic)或預防性(preventative)措施，其目的是預防或延緩(減輕)所針對的病理疾病狀態或病症。如果個體接受了本發明方法的治療劑後，該個體表現出可觀察到的和/或可測定的具體疾病或疾病狀態的一種或多種指徵和症狀的減少或缺失，則認為該個體被成功「治療」 了病症。本文所用的病症或疾病狀態的「預防(prevention)」或「預防(preventing) 」是指在統計學樣品中，相對於未處理的對照樣品，化合物能減少處理的樣品中病症或疾病狀態的發生，或者相對於未處理的對照樣品，化合物能延緩病症或疾病狀態的一種或多種症狀的發作或降低其嚴重程度。本文所用的術語「個體」是指哺乳動物，例如人，但也可以是動物，例如，家畜(例如，狗、貓等)，農畜(例如，牛、羊、豬、馬等)和實驗室動物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠
寸J ο本發明的組合物本發明提供利用來自多種植物的提取物和化合物以及所述化合物的衍生物增加個體壽命的方法，所述植物包括柔毛水楊梅和仙鶴草(Xian he cao)(也稱為龍牙草 (Agrimonia pilosa Ledeb. ))0在一些實施方案中，所述化合物是柔毛水楊梅或仙鶴草的全植物、提取物，例如有機提取物。在具體實施方案中，所述化合物是柔毛水楊梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。在一些實施方案中，所述化合物是柔毛水楊梅提取物的部分。本發明提供利用來自多種植物的試劑和/或提取物和化合物以及該化合物的衍生物來增加個體壽命的方法，所述植物包括柔毛水楊梅。在一些實施方案中，所述試劑是柔毛水楊梅的提取物，例如柔毛水楊梅的有機提取物。在具體實施方案中，所述試劑是柔毛水楊梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。柔毛水楊梅有機提取物的製備提供了製備柔毛水楊梅有機提取物的方法。該方法包括以下步驟(a)用醇提取柔毛水楊梅植物，所述醇選自C1-C4醇。該步驟可以室溫下重複3-6次，通常5次。在進行步驟(a)之前，可以將植物材料製成粉末或切成小塊。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇。通常，添加的醇的重量是待提取的柔毛水楊梅重量的1-10倍。所述方法還可以包括以下步驟(b)將獲自步驟(a)的提取物乾燥為乾燥粉末；和 (c)用C6烷、KOAc和選自C1-C4醇的醇相繼提取獲自步驟(b)的粉末。C6烷包括具有6 個碳原子的環狀和非環狀烷，包括，例如，環己烷、正己烷和新己烷等。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇。所用的有機溶劑的重量通常是待進一步提取的粉末重量的1-10倍。上文所述的方法還可以包括過濾提取物來去除其中的任何不溶性粉末。可以在高於室溫的溫度下(例如50°C )的減壓條件下完成乾燥步驟。為了純化0EGJ，所述方法可以還包括以下步驟將粉末施加到色譜柱；並用含有漸增濃度的選自C1-C4醇的醇的水性溶液洗脫柱。例如，可以使用kphadex或反相柱。所用的醇可以是選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇的任何一種。通過NMR分析，我們發現OEGJ通常主要含有單寧類和三萜類，所述單寧類包括 gemin A、B、C、D、E和F，所述三萜類包括2-羥基齊墩果酸、2-羥基熊果酸、2，19-二羥基-熊果酸、2- α ,19-α- 二羥基-3-氧代-12-烏索烯-28-酸、熊果酸、印imolic acid、山楂酸、 野鴨椿酸、委陵菜酸，委陵菜酸的28- β -D-葡糖苷。在一個實施方案中，本發明的提取物、活性部位和化合物是利用水和/或有機溶劑從植物原材料提取得到的，包括以下過程1.將水和/或有機溶劑添加到植物材料，將整體進行諸如浸泡/浸濾、超聲或微波的處理而進行提取；2.在提取過程之前或之後，利用石油醚、己烷或氯仿類型的溶劑進行脫脂；3.任選地，利用乙酸乙酯或乙醚類型的有機溶劑對回收的提取物進行進一步提取；4.任選地，將獲得的粗提取物濃縮，並如果需要將其凍幹。一方面，考慮到允許獲得的富集，粗提取物可以接受色譜純化過程。在一個實施方案中，使用離心分配色譜(CPC)。該技術具體描述於Α。P。FOUCAULT, Edo, Centrifugal Partition Chromatography ( ^^Il^KfeiH ) Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc0,1995,68 或W。D0 CONWAY,EcL,Countercurrent Chromatography apparatus theory 和 applications (逆流色譜裝置理論和應用)，VCH Publishers Inc0,1990. CPC 是基於通過混合兩種或更多種溶劑或溶液而製備的兩種不混溶液相之間的溶質分配。所述兩種相中的一種通過離心力保持靜止。溶劑、它們的比例和流速的選擇與CPC柱中靜止相的穩定性和實際壓力密切相關。因此，本領域技術人員能根據所需純化的提取物的性質選擇最合適的溶劑。因此， 粗提取物和富集的部分能含有任何從OEGJ鑑定出的化合物，並且所述化合物作為主要成分。這些不同的提取物，即粗提取物或富集的提取物，也在本發明的範圍內。實施其它分離過程允許分離這些富集了一種或多種化合物的提取物。使用合適溶劑的按照適合於所選擇的分離的比例的混合物，可以對從粗提取物富集的部分或對粗提取物自身進行這些分離。用於增加生存年限或健康年限的方法和組合物本發明是基於下述發現0EGJ不僅能通過保護細胞免受缺血和應激的影響來增強重要細胞(例如神經元和心肌細胞)的存活能力，還能上調細胞存活因子和端粒酶的表達，所述細胞存活因子包括Aktl、BC12、EGF、VEGF和NFκB等。此外，本發明人發現，OEGJ 能促進重要缺血器官(例如心臟和腦部)中的新血管形成，並且能誘導受損心臟的心肌細胞和腦中的神經元再生。這些實驗結果顯示0EGJ能有效地在一定程度上預防衰老，甚至逆轉衰老，並提高生存年限或生活質量。通常，本發明涉及改善年齡相關的生理學病症和延長哺乳動物的生存年限以及改善老齡哺乳動物的生活質量的方法。一方面，本發明提供增加有需要的個體壽命和/或增強有需要的個體活力的方法，其包括給予所述個體有效量的本文所述的化合物、組合物、活性部位或提取物。在一些實施方案中，柔毛水楊梅的甲醇/乙醇提取物、其活性部位和分離的化合物能顯著增加被處理的細胞/組織中的端粒酶活性並顯著增加哺乳動物個體的生存年限。本文所述的試劑能顯著增加新生哺乳動物個體的活力和存活能力。接受處理的哺乳動物個體更具活力並且表現明顯更為健康。與未處理的對照個體相比，接受處理的哺乳動物個體的承受危及生命的應激的能力也顯著增加。一方面，增加壽命和/或增強生活質量的方法包括給予有需要的哺乳動物來自多種植物的試劑、和活性部位和/或提取物和化合物以及所述化合物的衍生物，所述植物包括柔毛水楊梅和仙鶴草。另一方面，用於增加壽命和/或改善生活質量的試劑是含有一種或多種賦形劑、 載體或填充劑的藥物組合物的一部分。在一個實施方案中，所述藥物組合物以單位劑量形式包裝。所述單位劑量形式能有效誘導增加個體的壽命和/或增強個體的活力和存活能力。在本發明的各個實施方案中，進行合適的體外或體內測定來確定本發明試劑(提取物、活性部位部分和化合物)的效果，以及所述試劑的給藥是否適用於增加哺乳動物個體的壽命和/或提高哺乳動物個體的生活質量。在一些實施方案中，使用體外模型來評價試劑對個體的影響。合適的模型包括但不限於應激抗性測定，其中將秀麗隱杆線蟲暴露於 27°C的致死溫度和受試試劑。研究了試劑在調節有機體中抵抗應激的效果，並與合適的對照進行比較。在一些實施方案中，使用長壽的體內模型來評價試劑對個體的效果。合適的模型包括生存年限測定，其中準備年齡同步化的秀麗隱杆線蟲蠕蟲，並使其生活在添加了受試試劑的瓊脂上。另一模型是短生存年限小鼠，其中單一 klotho基因突變導致多種年齡相關病症。研究了試劑在調節有機體個體中的年齡相關病症的效果，並與合適的對照進行比較。在一個實施方案中，本發明提供通過將細胞與本發明的植物提取物、活性部位和/ 或化合物接觸而增加細胞對應激的抗性或預防細胞凋亡的方法。本文所述的方法可以用於增加細胞、特別是原代細胞(即，獲自諸如人的生物體的細胞)在細胞培養物中存活的時間。還可以用本發明的植物、提取物、活性部位和/或化合物處理胚胎幹細胞(EQ和多能細胞以及從它們分化而來的細胞，從而使培養物中的細胞或其後代存活更長的時間。例如在離體修飾之後，這些細胞還可以用於移植入個體。糖尿病另一方面，本發明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可以用於治療或預防代謝性病症，例如胰島素抵抗、前糖尿病狀態，I型和II型糖尿病和/或其併發症。
糖尿病是指人具有高血糖水平的代謝性病症，其原因是機體不能產生足夠的胰島素或利用胰島素的能力下降。胰島素在胰腺中產生，它是在細胞水平將葡萄糖轉化為能量的激素。葡萄糖對我們的健康至關重要，因為它是肌肉和其它組織中的細胞的主要能量形式。然而，血液中異常高水平的葡萄糖，也稱為高血糖症的疾病狀態，會導致急性和慢性血管疾病併發症，例如失明、腎衰、冠心病、中風和截肢(Pankaj，2007)。I型和II型糖尿病是兩種最常見的糖尿病形式。I型糖尿病最常見於兒童期或青春期，其主要是由於胰腺中朗格漢斯氏島中的產胰島素β細胞的喪失，隨之導致胰島素缺乏。T細胞介導的針對β細胞的自身免疫應答是I型糖尿病的主要內在機制。II型糖尿病佔所有糖尿病病例的90%，其主要是由於胰島素抵抗和β細胞功能紊亂(Lin & Sim， 2010)。與I型糖尿病相反，II型糖尿病患者的胰島素水平，特別是在早期時，非常高，因為機體試圖對胰島素抵抗進行補償。然而，隨著疾病的發展，由於胰島素抵抗和增加的肝葡萄糖產生，即使高於正常的胰島素水平也不能將血漿葡萄糖保持在正常水平。隨著疾病的進程，很可能由於β細胞功能的進行性惡化和加速的β細胞凋亡導致胰島素下降，從而進一步加重疾病狀態(Wajchenberg BL, 2007) 我們最近的研究表明，OEGJ能顯著促進肌肉、心臟和腦部中新的血管的生長。OEGJ 誘導的血管生成和肌肉再生都會增強體內葡萄糖的利用和消耗，導致糖尿病患者血糖水平降低。此外，如果在心臟、腦部和肌肉中發現的OEGJ誘導的細胞再生也存在於胰腺，則OEGJ 治療能補償β細胞的喪失。因此，本文所述的植物、提取物，活性部位和/或化合物的給藥可以為糖尿病患者提供有效治療。在示例性的實施方案中，本發明的植物、提取物、活性部位和/或化合物的給藥可以作為治療或預防糖尿病的聯合治療的一部分。例如，一種或多種本發明的植物、提取物、 活性部位和/或化合物可以與一種或多種抗糖尿病藥聯合給藥。示例性的抗糖尿病藥包括，例如醛糖還原酶抑制劑、糖原磷酸化酶抑制劑、山梨醇脫氫酶抑制劑、蛋白酪氨酸磷酸酶IB酶抑制、二肽基蛋白酶抑制劑、胰島素(包括口服生物可利用胰島素製劑)、胰島素模擬物、二甲雙胍、阿卡波糖、過氧化物酶體增殖活化受體-Y (PPAR-y)的配體(例如曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮或GW-li^9)、磺醯脲類、格列吡嗪、格列本脲或氯磺丙脲，其中第一和第二化合物的量產生治療效果。其它抗糖尿病藥包括葡萄糖苷酶抑制劑、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、胰島素、PPAR-α/γ雙激動劑、美格替耐和αΡ2抑制劑。在示例性的實施方案中，抗糖尿病藥可以是二肽基肽酶IV (DP-IV或DPP-IV)抑制劑，例如諾華公司的 LAF237 (NVP DPP728 ； 1_[ [ [2_[ (5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]_2_氰基-(S)-吡咯-啶)或默克公司的ΜΚ-04301(參見例如，Hughes et al. ,Biochemistry 38: 1 1597-603(1999))。炎性疾病、創傷癒合和褥瘡在其它方面，本發明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可用於治療或預防炎症相關疾病或病症。可以在炎症發生之前、發生時或發生之後給予本發明的植物、提取物、 活性部位和/或化合物。當預防性使用時，優選在任何炎症反應或症狀之前提供所述化合物。所述化合物的給藥可以預防或減輕炎症反應或症狀。炎症是複雜的生物學過程，機體通過炎症對感染、損傷或刺激作出反應 (Medzhitov,2008)。炎症是保護機體免受諸如細菌、病毒和寄生蟲的各種致病外來物的影響的防禦機制。儘管急性炎症是治癒創傷和感染的先決條件，但是由於免疫系統不能清除外來物而造成的長期炎症(也稱為慢性炎症)會導致許多疾病，包括風溼性關節炎、 動脈粥樣硬化、哮喘和炎性腸病(Ku et al. ,2009 ；Hamid & Tulic, 2009 ；Kaser et al.， 2010)。最近，慢性炎症和中樞神經系統疾病、癌症和心臟病發作之間的聯繫已被提出(Kang & McGavern，2009 ；Grivennikov et al.，2010)。慢性炎性疾病困擾世界數以百萬計的人並且難以治療，目前還沒有治癒性藥物。很多用於治療慢性炎性疾病的藥物具有嚴重的副作用，包括胃出血、糖尿病和高血壓。在某些實施方案中，一種或多種本發明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可以單獨給藥或與用於治療或預防炎症的其它化合物聯合給藥。示例性的抗炎藥包括，例如類固醇(例如皮質醇、可的松、氟氫可的松、強的松、6 α -甲基強的松、去炎松、倍他米松或地塞米松)、非留體類抗炎藥(NSAIDS，例如阿司匹林、對乙醯氨基酚、託美丁、布洛芬、甲滅酸、吡羅昔康、萘丁美酮、羅非昔布、塞來昔布、依託度酸或尼美舒利)。在另一個實施方案中，其它治療劑是抗生素(例如萬古黴素、青黴素、羥氨苄青黴素、氨苄青黴素、頭孢噻肟、 頭孢曲松、頭孢克肟、利福平、甲硝唑、強力黴素或鏈黴素)。在另一個實施方案中，其它治療劑是PDE4抑制劑(例如羅氟司特或咯利普蘭)。在另一個實施方案中，其它治療劑是抗組胺劑(例如賽克利嗪、羥嗪、異丙嗪或苯海拉明)。在另一個實施方案中，其它治療劑是抗瘧藥(例如青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯、磷酸氯喹、鹽酸甲氟喹、鹽酸強力黴素、鹽酸氯胍、阿託伐醌或滷泛群)。在一個實施方案中，其它治療劑是drotrecogin alfa.創傷癒合是意外損傷或手術介入後的複雜並且動態的過程，其中機體自我修復並恢復細胞結構和組織層。正常創傷癒合分為三個階段炎症期、增生期和重建期 (Stadelmann et al.，1998)。增生期中的血管生成對於創傷癒合至關重要。在血管生成的過程中，血管內皮細胞形成新的血管。褥瘡也稱為壓瘡或壓力性潰瘍，大部分情況下是由於未減輕的壓力而造成的病變 (Bluestein D & Javaheri A，2008)。雖然褥瘡可以影響身體的任何部位，但褥瘡最常見的身體部分是骨或軟骨區，例如膝、踝和肘，特別是臀部、胯部和腳跟的皮膚。發展為褥瘡的高風險人群是癱瘓的人或無人幫助的情況下不能改變體位的人。如果不能早期發現，褥瘡可致命，並且是發達國家中主要醫源性死因之一。當持續的壓力切斷易受傷害的身體部位的循環時，就發展為褥瘡。受累的組織最終由於供血不足而死亡。因此，能改善血供的試劑可用於治療褥瘡。眼部病症本發明的一方面是通過給予患者治療劑量的本發明的植物、提取物、活性部位或化合物或其藥學可接受的鹽、前藥或代謝衍生物來抑制、減少或治療包括白內障和老視在內的眼部病症的方法。在一些實施方案中，OEGJ能有效治療某些眼部病症，特別是年齡相關的和退行性眼部病症，例如白內障和老視。白內障是眼睛晶狀體中不透明的或混濁的區域。根據所述區域的大小和位置，白內障對正常視力的影響從輕微不透明至完全失明。年齡相關的白內障是最常見的白內障類型，並且影響60%的65-74歲人群和91%的75-85歲人群。根據世界衛生組織，年齡相關的白內障是世界範圍內約50%的失明原因，並且是超過55歲人群中喪失視力的首要原因(Asbell et al.，2005)。晶狀體蛋白的變性和聚集被認為是白內障的內在原因。另一方面，老視也是年齡相關的眼部疾病狀態，其中眼部的晶狀體逐漸喪失彈性，從而隨著衰老而難以對近距離物體聚焦(Charman，2008)。本發明的另一方面是通過給予有需要的個體治療劑量的本發明植物、提取物、活性部位或化合物來治療(包括抑制和預防性治療)包括白內障、老視等在內的年齡相關的眼部疾病。在一個實施方案中，聯合藥物方案可以包括用於治療或預防眼部病症或與這些疾病狀態相關的繼發疾病狀態的藥物或化合物。因此，聯合藥物方案可以包括一種或多種本發明的植物、提取物、活性部位或化合物和一種或多種用於治療眼部病症的治療利。例如， 一種或多種本發明的植物、提取物、活性部位或化合物可以與有效量的一種或多種試劑聯
I=I O藥物組合物的製劑和劑量在本發明的各個實施方案中，進行的體外或體內分析來確定本發明試劑(提取物、活性部位和化合物)的效果以及所述試劑的給藥是否適用於治療個體所患疾病或醫學疾病狀態。這些分析的實例在上文中結合具體疾病或醫學治療進行了描述。通常，足以實現治療或預防效果的本發明組合物的有效量為約0. OOOOOlmg/千克體重/天至約10，OOOmg/千克體重/天。合適的情況下，劑量為約0. OOOlmg/千克體重/天至約2000mg/千克體重/天。示例性的治療方案為每天一次或每周一次或每月一次給藥。 通常多次給予所述試劑。單次劑量之間的間隔可以是每天、每周、每月或每年。或者，可以以緩釋製劑的形式給予所述試劑，在這種情況下，需要給藥的頻率減少。劑量和頻率根據試劑在個體中的半衰期而不同。給藥的劑量和頻率可以根據是預防性處理還是治療性處理而不同。在預防性應用中，在長期以相對低頻率的間隔給予相對低的劑量。某些個體持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的間隔給予相對高的劑量，直至疾病的進展降低或停止，並優選地直至個體表現出疾病症狀的部分或完全改善。在此之後，可以給予患者預防方案。毒性合適的情況下，本文所述的試劑的有效量(例如，劑量)能提供治療益處，而不會產生對個體的明顯毒性。可以通過標準藥學程序在細胞培養物或實驗動物中確定本文所述的試劑的毒性，例如，通過測定LD5tl (半數致死量)或LDltltl (絕對致死量)。毒性效應和治療效果的劑量比是治療指數。獲自這些細胞培養物分析和動物研究的數據可以參考用於制定人類中使用無毒性的劑量範圍。本文所述的試劑的劑量優選處於包括有效劑量且僅具有很小的毒性或無毒性的血循環濃度的範圍內。根據所用劑型和給藥途徑，劑量可以在該範圍內變化。確切的製劑、給藥途徑和劑量可以由醫師根據個體的疾病狀態來選擇。參見，例如，Fingl et al,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch. 1 (治療的藥理學基礎，第一章)(1975)。根據本發明的方法，可以將所述試劑合併到適於給藥的藥物組合物中。在一些實施方案中，所述藥物組合物可以包含適於對個體進行給藥的形式的純化的或基本純化的柔毛水楊梅提取物和藥學可接受的載體。在其它實施方案中，所述藥物組合物所包含的藥學可接受的載體在一定程度上由所給予的具體組合物以及用於給予組合物的具體方法決定。因此，適於給予組合物的藥物組合物製劑有很多種(參見，例如，Remington' sSciences (雷明頓製藥科學)，Mack Publishing Co。，Easton，PA 18th ed。，1990)。通常將藥物組合物配製為無菌的、基本上等滲的並且完全符合美國食品與藥品管理局的所有良好生產規範(GMP)規程。當形容組合物、載體、稀釋劑和試劑時，術語「藥學可接受的」、「生理學容許的」以及其語法變體可交換使用，並且表示該材料能夠給予個體，並且不會產生需要禁止組合物給藥的程度的不希望的生理學影響。例如，「藥學可接受的賦形劑」表示該賦形劑可用於製備通常是安全的，無毒性的且滿足需要的藥物組合物，並且還包括獸醫用途以及人類製藥用途能接受的賦形劑。這些賦形劑可以是固體、液體、半固體，或者對於噴霧劑組合物來說， 可以是氣體。「藥學可接受的鹽和酯」是指藥學可接受的並具有所需藥學性質的鹽和酯。這類鹽包括試劑中存在的酸性質子能夠與無機或有機鹼反應的情況下形成的鹽。合適的無機鹽包括與鹼金屬形成的鹽，所述鹼金屬例如鈉和鉀、鎂、鈣和鋁。合適的有機鹽包括與有機鹼形成的鹽，所述有機鹼例如胺類鹼，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。這類鹽還包括與無機酸(例如，鹽酸和氫溴酸)和有機酸(例如乙酸、檸檬酸， 馬來酸和烷基磺酸和芳基磺酸，例如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學可接受的酯包括與試劑中存在的羧基、磺醯氧基和膦醯氧基形成的酯，例如，Cp6烷基酯。當存在兩種酸性基團時，藥學可接受的鹽或酯可以是單酸單鹽或酯或二鹽或酯；同樣，當存在多於兩種酸性基團時，部分的或所有的這些基團可以被鹽化或酯化。本發明中命名的試劑可以以非鹽化或非酯化的形式或鹽化和/或酯化的形式存在，並且這些試劑的命名意圖包括原始(非鹽化的和非酯化的)化合物及其藥學可接受的鹽和酯。此外，本發明所述的某些試劑可以以多種立體異構體的形式存在，涉及該試劑時意圖包括所有單種立體異構體和這些立體異構體的所有混合物(無論是外消旋的還是其它)。本領域技術人員可容易地確定本發明的具體藥物和組合物的合適的給藥時機、順序和劑量。這些載體或稀釋劑的合適的實例包括但不限於，水、鹽溶液、林格氏液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還可以使用脂質體和諸如不揮發性油的非水性載體。這些介質和化合物在藥學活性物質中的使用是本領域公知的。除了與所述試劑不相容的任何常規介質或化合物之外，其它介質或化合物可用於組合物中。還可以將補充性活性化合物合併到組合物中。本發明的藥物組合物的配製符合其預期的給藥途徑。本發明的組合物可以通過以下途徑給藥胃腸外、局部、靜脈內、口服、皮下、動脈內、真皮內、經皮、直腸、顱內、腹膜內、 鼻內、肌內途徑或作為吸入劑。所述試劑可以任選地與在治療各種疾病中至少有一定效果的其它試劑聯合給藥。胃腸外、真皮內或皮下施用的溶液或懸液可以包括以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌化合物，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張力的化合物， 例如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或鹼調節PH，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外製劑可以裝入安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料製成的多劑量瓶中。適於注射使用的藥物組合物包括無菌水性溶液(在可溶於水的情況下)或用於臨時製備無菌注射液或分散液的分散劑和無菌粉末。對於靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL (BASF,Parsippany,N. J.)或磷酸鹽緩衝液(PBQ。無論在什麼情況下，組合物必須是無菌的，並且其流動性應當易於注射。其在生產和貯存條件下必須穩定，並且必須能抵抗諸如細菌和真菌的微生物的汙染活動。載體可以是含有例如水、乙醇、 多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質。 可以例如通過使用諸如卵磷脂的包被、保持需要的顆粒尺寸(在分散液的情況下)和施用表面活性劑來保持合適的流動性。可以利用各種抗菌和抗真菌化合物實現微生物活動的預防，所述抗菌和抗真菌化合物例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸，硫柳汞等。在很多情況下，優選在組合物中包含等滲化合物，例如糖，諸如甘露醇、山梨醇的多元醇，氯化鈉。可以通過在組合物中包含延緩吸收的化合物實現注射組合物的持續吸收，所述化合物例如單硬脂酸鋁和明膠。可以通過將所需量的試劑合併入含有一種上文所列成分或上文所列成分的組合的合適的溶劑中然後視情況進行過濾滅菌來製備無菌注射液。通常，通過將結合劑合併到含有基本分散介質和上文所列的所需其它成分的無菌介質中來製備分散劑。對於用於製備無菌注射液的無菌粉末，製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，從而從之前過濾滅菌的溶液得到活性成分和任何其它所需成分的粉末。可以以積存注射(depot injection)或植入製劑的形式給予本發明的試劑，植入製劑的製備形式能允許活性成分的持續釋放或脈衝釋放。口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體。可以將口服組合物封裝在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療給藥，結合劑可以與賦形劑合併，並用於片劑、錠劑或膠囊的形式。還可以使用用於漱口水的流體載體來製備口服組合物，其中流體載體中化合物是經口施用、漱口和吐出或吞下。藥學相容的結合化合物和/或輔助材料可以作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任何下述成分或具有相似性質的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解化合物，例如藻酸、 Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Merotes ；助流劑，例如膠態二氧化矽；甜味劑化合物，例如蔗糖或糖精；或調味劑化合物，例如薄荷油、水楊酸甲酯或桔子香精。在一個實施方案中，所述試劑與能保護所述試劑免於從體內快速清除的載體一起進行製備，例如控釋製劑，包括植入物和微膠囊化的遞送體系。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。此類製劑的製備方法對於本領域技術人員是顯而易見的。還可以從Alza Corporation和Nova !Pharmaceuticals，Inc購買所述材料。脂質體懸液(包括靶向於感染細胞的具有針對病毒抗原的單克隆抗體的脂質體)也可用作藥學可接受的載體。可以根據本領域已知的方法進行製備，例如，美國專利第4，522，811號中的描述。
實施例通過以下實施例進一步闡述本技術，但這些實施例不應解釋為以任何方式進行限制。實施例1.用於增強存活能力和端粒酶活性的由天然化合物組成的組合物的鑑定使用由生物活性導向技術來篩選植物成分，從而鑑定增強端粒酶活性的化合物的組合物。在篩選植物提取物時，鑑定出柔毛水楊梅的有機提取物(OEGJ)能顯著增強細胞的存活能力和端粒酶活性。簡而言之，將從安徽省採集的IOkg乾燥的柔毛水楊梅切成小塊，在室溫下用90%甲醇/乙醇(10倍體積)滲濾6天。將提取物進行電噴霧，得到棕色粉末。將提取物(150 μ g/ml)施加到間充質幹細胞培養物後，發現OEGJ能提高細胞對抗諸如缺氧等應激的存活能力。RT-PCR分析表明，某些與細胞存活的相關基因上調，例如 Aktl、Bcl2、VEGF, EGF和NF κ B等。因此，我們在以下研究中進一步測試OEGJ的作用。實施例2.增強培養的心肌細胞的存活能力大量的細胞信號傳導通路控制細胞功能，包括細胞分裂、分化、衰老和死亡等。某些疾病的發展也取決於這些細胞功能，特別是取決於細胞衰老和細胞死亡，而且這種影響隨著年齡而增加。例如，由凋亡造成的心肌細胞損失導致心衰，抗凋亡(存活)信號的下調或促凋亡信號的過表達與這一疾病發展密切相關。首先，我們測試了 OEGJ是否能增強培養的心肌細胞的存活能力或防止細胞死亡。 通過在缺氧環境室中培養心肌細胞造成缺氧。所述室的氧濃度保持為IOmmHg,持續對小時。結果表明，與未處理的對照心肌細胞相比，從缺氧開始至缺氧結束的OEGJ處理顯著增加了諸如Aktl、Bcl2、EGF, VEGF, NFkB的某些存活因子的表達，並顯著防止細胞由於缺氧死亡。在未處理的對照心肌細胞中，隨著缺氧時間延長，凋亡細胞數增加。相比之下，OEGJ 處理增加細胞存活能力並減少凋亡細胞數(P < 0. 01)。實施例3. OEGJ增加秀麗隱杆線蟲的存活為了測試OEGJ是否能增強秀麗隱杆線蟲的存活能力或預期壽命，使用了野生型 N2秀麗隱杆線蟲。通過漂白(bleaching)將秀麗隱杆線蟲同步化，並分兩組種到瓊脂板上。平板為60mm的表面包被皿(約IOml固體形式的培養基)。蠕蟲生活在強制通風的培養箱中的用大腸桿菌菌株0P50劃線的NGM瓊脂板上，培養箱溫度保持為士0.5°C。用 OEGJ (150 μ g/ml，每一個皿加上600 μ 1藥物溶液，每個皿都遮擋風乾)處理約500個蠕蟲/皿，用等量溶劑處理對照組蠕蟲。在野生型秀麗隱杆線蟲株中，秀麗隱杆線蟲Ν2株在 200C _25°C下能誘導dauer幼蟲形成。高於25°C 對於秀麗隱杆線蟲是致死溫度。為了測試OEGJ處理的蠕蟲的存活能力，將培養溫度提高至27°C。圖像採集於第7天和第14 天(採集圖像時，蠕蟲暴露於20°C )。我們發現，未處理的對照組的N2蠕蟲在27°C下孵育7天後，部分蠕蟲死亡，同時部分仍然存活，但是未觀察到幼體蠕蟲(圖1 :Ct-7)。相比之下，OEGJ處理的蠕蟲在相同狀態下孵育7天後，幾乎沒有蠕蟲死亡，並且更有趣的是觀察到很多幼體蠕蟲(圖1 :0EGJ-7)。 此外，27°C下孵育14天後，未處理的對照組中所有N2蠕蟲死亡(圖1 :Ct-14)。形成鮮明對比的是，儘管OEGJ處理組中很多成體蠕蟲死亡，但觀察到相當多的幼體蠕蟲仍然存活(圖 1 :0EGJ-14)。這些結果表明過高和致死的溫度環境不僅使N2蠕蟲絕育，還能在2周內殺死所有蠕蟲。相比之下，OEGJ處理不僅增強蠕蟲在致死溫度環境下的存活能力，還能保持它們產生後代的能力。OEGJ增加秀麗隱杆線蟲的平均健康時間為了測試OEGJ是否能刺激蠕蟲中與細胞存活相關基因的上調並增強蠕蟲的存活能力，通過漂白(bleaching)處理將野生型N2、daf-2和daf_16突變體秀麗隱杆線蟲分別同步化並分為兩組種到瓊脂板上。daf-2基因編碼秀麗隱杆線蟲中的胰島素樣受體。daf-2 的突變已被證實能使蠕蟲生存時間加倍(Jennie B. et al.，1995 ;J. Apfeld & C. Kenyon， 1998)。該基因已知能調節生殖發育、衰老、氧化應激抗性、耐熱性、缺氧抗性以及細菌病原體抗性(M. S Garni & CA. Wolkow，2006)。daf_2是蠕蟲中唯一的胰島素/IGF-1樣受體。胰島素/IGF-I樣信號轉導從蠕蟲到人都保守。daf-2的作用是通過磷酸化作用級聯來負調節叉頭狀轉錄因子daf-16。研究表明，daf-16是daf_2依賴性生存時間延長和dauer形成所必需的。當非磷酸化時，daf-16是有活性的並存在於細胞核中。daf-16在決定秀麗隱杆線蟲及其進化近親的衰老速度和平均生存時間中起重要作用(S.T.Henderson & T.E.Johnson， 2001)。在很多其它動物中也發現daf-16，包括人。daf-16是驅動衰老、免疫和應激響應中涉及的生物學過程的基因組中的一員。在15°C下同步化的Ll期N2、daf-2和daf-16蠕蟲(約500個蠕蟲/皿)生長在20°C強制通風的培養箱中用大腸桿菌株0P50劃線的NG瓊脂板上，培養箱的溫度保持為士0. 5°C。用OEGJ (150 μ g/ml，每一個皿加上600 μ 1藥物溶液，每個皿都遮擋風乾)處理受試組的蠕蟲，用等量溶劑處理對照組的蠕蟲。另一例外實驗是在20°C下同步化Ll期的 daf-2並使其在20°C下生長。如圖2所示，幾乎在所有檢查點，OEGJ處理組中觀察到的活的蠕蟲都多於未處理組。到第38天為止，所有未處理組的蠕蟲死亡。然而，OEGJ處理組中約5%的蠕蟲仍然存活(圖2)。OEGJ處理組中剩餘的蠕蟲第42天才全部死亡，平均生存時間比未處理的對照蠕蟲長約10%。為了測試OEGJ處理對daf-2突變體秀麗隱杆線蟲(其生存時間已經是野生型蠕蟲的2倍)的生存時間的影響，我們用OEGJ測試daf-2蠕蟲。結果表明，幾乎在所有觀察點，OEGJ處理組中發現的活的蠕蟲都多於未處理組(圖3)。未處理的對照中約5%的蠕蟲在第56天存活，而OEGJ處理組中約10%的蠕蟲仍然存活(圖3)。為了進一步測試OEGJ處理對具有顯著較短生存時間的蠕蟲的影響，使用了 daf-16突變體秀麗隱杆線蟲。我們發現，到第12天為止，未處理的對照組中約77%的蠕蟲死亡(圖4)。相比之下，OEGJ處理組中約50%的蠕蟲在第12天仍然存活。(圖4)。未處理組中死亡的蠕蟲比OEGJ治療多約27%，這表明OEGJ處理能顯著增加健康時間。為了更進一步測試OEGJ處理對不同狀態下的daf-2秀麗隱杆線蟲的生存時間的效果，daf-2蠕蟲的同步化和生長都在20°C下進行。我們發現，OEGJ處理組中約58%的蠕蟲在第21天仍然存活(圖5)。相比之下，到第21天，未處理的對照組中約58%的蠕蟲已經死亡(圖5)。在所有檢查點，OEGJ處理組中仍然存活的蠕蟲比未處理組多約5-15%，提示OEGJ處理增加了健康時間和生存時間。實施例4. OEGJ處理誘導小鼠長壽和增加的端粒酶活性昆明(KM)小鼠在正常飼養下的生存時間通常是582. 5士 177. 73天。將KM小鼠(η =16)隨機分為兩組。給予受試組小鼠(η = 9，6月齡)2個月的0EGK200mg/kg/天，添加於食物中)。在相同時間給予6月齡對照組小鼠(n = 7)蔗糖O00mg/kg/天，添加於食物中)。然後，在12小時光照/黑暗周期的環境受控條件下飼養小鼠。所有動物自由攝取標準鼠顆粒料和水。TERT (端粒酶逆轉錄酶)是端粒酶的催化亞基。使用基於TaqMan 螢光方法的 RT-PCR對全範圍的mTERT (小鼠TERT)mRNA拷貝數進行定量。在PCR的延伸期中，探針與靶序列雜交，然後由於Taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性而被切割。報告子螢光信號的增加與特定PCR產物的量成比例，這提供了高度精確並且可重複的定量。達到螢光閾值的PCR循環數是循環閾值(Ct)。每個樣品的Ct值與輸入cDNA的初始量的對數成比例。通過將未知樣品的Ct值繪製在標準曲線上，可以計算樣品中靶序列的量。為了將mTERT mRNA 表達相對於樣品與樣品在輸入RNA、RNA質量和逆轉錄酶效率中的差異進行標準化，擴增管家基因GAPDH。根據每條標準曲線，分別測定GAPDH和mTERT的拷貝數。mTERT和GAPDH的拷貝數之比代表每個樣品的標準化的mTERT，並且可以與其它樣品的標準化的mTERT進行比較(Artandi SE et al. 2000)。OEGJ給藥2個月後，將來自OEGJ處理組的4隻小鼠和來自未處理對照組的2隻小鼠處死。利用Trizol anvitrogen)，分別從心臟製備總RNA。GCl細胞系用作實驗的陽性對照。利用Superscript II anvitrogen)，按照廠商說明書，使用隨機引物進行逆轉錄。在 BioRad MJ Mini實時PCR上，對兩個稀釋液以雙平行樣品進行實時PCR。對於每個mRNA樣品，用GAPDH mRNA含量校正Tert表達。程序為在50°C下初始孵育2分鐘，然後是95°C持續10分鐘和40個循環，每個循環為95°C持續15秒、68°C持續2分15秒、95°C持續15秒、 63°C持續20秒、95°C持續15秒。在每個循環，測定產物的熔解點。PCR利用對Tert基因特異的一組引物。結果表明在所有樣品中觀察到18s和GAPDH內參的陽性信號。在所有4個OEGJ 處理的心臟樣品和GCl細胞中觀察到mTERT的陽性信號。未處理對照心臟樣品中僅有非常低的或幾乎沒有mTERT表達。所有4個處理的樣品表現出的mTERT表達比未處理對照樣品高約24 8_13 27倍(圖6)。此結果為OEGJ處理能控制誘導TERT表達的假說提供了可能性。為了測試細胞存活基因和TERT的增強表達能否轉化為延長的生存時間，我們利用上述OEGJ處理的小鼠繼續進行實驗。我們發現，處理的小鼠的活動更具活力並且明顯表現出更健康。與未處理的對照動物相比，處理的小鼠的承受危及生命的應激能力也顯著增強。因此，剩餘的5隻OEGJ處理的小鼠的平均生存時間為763士 108天。相比之下，剩餘的 5隻未處理的小鼠的平均生存時間為610士 158天。綜上所述，OEGJ處理的小鼠享有的生存時間比未處理的對照長17-25% (圖6)。實施例5. OEGJ引起衰老加速小鼠中年齡相關病症的改善衰老加速小鼠(SAM)系由日本京都大學衰老生物學部建立，其作為衰老加速和年齡相關病症的新的鼠模型。在本研究中，使用短壽小鼠(SAMPlO)。SAMPlO小鼠表現出加速的衰老。SAMPlO中最典型的年齡相關改變是腦萎縮，特別是大腦的額部，額部腦皮質、頂部腦皮質、顳部腦皮質和枕部腦皮質。在衰老的SAMPlO中，這些區域中的大神經元通常收縮和/或消失(Shimada et al，1992)。所有這些典型病理學表型與老年人中通常觀察到的年齡相關病症相似。SAMPlO小鼠存活時間的中位數為333天(Takeda et al, 1991)。當SAMPlO小鼠4月齡時，用0EGK400mg/kg/天，配製於H2O懸液)通過灌胃給藥每天治療受試組小鼠(n = 16)，持續4周。給予未治療對照組小鼠(n = 16)等量的水。停止治療後1個月，即小鼠約為6月齡時，使用Morris水迷宮(1. 8M)來評價兩個組的所有小鼠的空間學習和記憶能力。每天訓練動物5次，訓練4天。通常，將找到平臺的耗時用於評價小鼠對於平臺位置的學習能力和記憶的強度。記錄找到隱藏平臺之前的耗時(也稱為逃避潛伏期)。結果表明，OEGJ治療的SAMPlO小鼠表現出的逃避潛伏期顯著短於未治療的小鼠(P < 0. 001)。在4周的OEGJ治療後，利用東芝超聲掃描儀的12-MHz線性探針研究實驗小鼠的腦血流(CBF)。為了排除OEGJ的血管擴張效應的可能性，4周OEGJ治療之後2周再次測定 CBF0 3次重複測量的平均值作為CBF。我們發現，OEGJ治療的小鼠的CBF比未治療的對照小鼠平均高15%。有趣的是，當在水迷宮測試之後處死小鼠時，OEGJ治療小鼠的腦部淨重量平均比未治療的小鼠重約15%。此外，未治療的小鼠的血壓為約135mmHg，比正常小鼠的血壓高約13%。相比之下，OEGJ治療的SAMPlO小鼠的血壓比未治療的對應者的血壓低約 10%。這些結果提示，OEGJ治療誘導了小鼠腦中新的側支血管形成，從而減少小動脈或微血管的外周阻力，從而能夠顯著增加腦部血流。為了證實OEGJ治療的動物中增加的CBF的物理基礎，從CBF測量之後處死的實驗小鼠中取出腦部，福馬林固定，石蠟包埋，組織切片(5μπι)，Η&Ε染色。通過對額葉皮質內和海馬區周圍的血管進行計數來確定組織學切片的血管密度。將額葉或海馬內的6個隨機且非重疊高倍鏡視野(HPF) (40倍)用於對每個切片的所有血管進行計數。取每個HPF中的血管數的平均值，並將其表示為每個HPF的血管數。由2個研究人員以盲法的方式進行血管計數。血管計數的結果表明在未治療的對照小鼠中，額葉皮質區的血管數為約 68. 6 士 16. 3/HPF,海馬區周圍的血管數為46. 8 士 13. 2/HPF (圖7)。相比之下，在OEGJ治療的小鼠中，額葉皮質區的血管數為約83. 8士 12. 9/HPF，海馬區周圍的血管數為61. 7士 11. 2/ HPF (圖 7)。為了研究OEGJ治療誘導的腦部微循環的改善是否能引起神經元再生從而取代受損的或死亡的神經元，從獲自實驗小鼠腦部的每一塊切下的薄切片(5μπι)，並用抗Ki67的特異性抗體進行免疫組化染色。通過對切片的顯微鏡檢查，我們發現OEGJ治療不僅增強腦皮質區和海馬區中新血管的生長，還能在這些區域誘導神經元再生(圖8)。相比之下，在未治療的對照腦中，既未鑑定到腦部顯著的新側支血管的生長，也未發現神經元的再生(圖 8)。新再生的神經元樣細胞能被對Ki67特異的抗體陽性染色(圖8)，這表明它們是新再生的神經元細胞。綜上所述，這些觀察結果提示，OEGJ不僅能明顯刺激SAM小鼠腦部中新的側支血管的生長，從而改善CBF，還能誘導負責學習和認知能力的額葉皮質和海馬區中的神經元再生，這可能是水迷宮探索試驗中明顯改善的行為表現的物理基礎。綜上所述，以上結果提示，OEGJ能通過刺激細胞生存和功能性腦部微循環的重建以及取代受損的或死亡的重要細胞(例如用新再生的神經元或心肌細胞取代受損的或死亡的神經元或心肌細胞)來降低衰老過程的進展，或甚至逆轉衰老。因此，本發明的組合物可以用於提高壽命和生活質量。實施例6.糖尿病基於上述證據，在人道治療的基礎上，在糖尿病患者中測試了 OEGJ用於治療糖尿病的可能性。在治療之前1年，1名59男性在進行痔瘡手術之前被首次診斷有糖尿病。當時，他的血糖水平為0mmol/Lo他接受了 1周的胰島素治療，並開始服用糖尿病藥物(達美康80mg，每早空腹2片)。服藥的6個月中，他的平均血糖水平為9.97mmol/L。他開始口服OEGJ (1. Sg/天)並聯合達美康，在2個月的OEGJ治療期中，他的平均血糖水平降低至 7.90mmol/L。即使在中斷OEGJ治療之後，他的平均血糖水平在相似水平(8. 06mmol/L)保持了2個月。實施例7.炎性疾病、創傷癒合和褥瘡
根據上述治療效果，OEGJ應當可用於治療慢性炎性疾病、創傷和褥瘡。因此，在人道治療的基礎上，我們測試了使用OEGJ治療慢性炎性疾病、創傷和褥瘡的可能性。約2年前，來自上海的1名女性患者發生多次腦部發作(中風)。在約8個月前她發生另一次腦部發作之後，她完全喪失語言和所有體力活動能力。她喪失了對任何事件的任何前攝反應，並且表現為完全的植物人患者，伴有肌肉僵硬。數月後，在檢查時她的臀部發生深度褥瘡(直徑16-18cm，深度10-12cm)。使情況更糟的是患者還感染了多藥耐藥性金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)。人們擔心如此嚴重的褥瘡和感染會奪去她的生命。對壞死和腐爛組織進行手術清創之後，給予她OEGJ (口服給藥，2g/天)。OEGJ給藥 1周後，她的褥瘡開始快速癒合。開放的創傷變得更小並逐漸變淺。2個月的OEGJ治療使她的深度褥瘡完全癒合。當患者停止服用藥物時，褥瘡的癒合速度下降。在患者恢復OEGJ 治療之後，褥瘡的癒合速度提高。實施例8.眼部病症基於上述證據，在人道治療的基礎上，在患者中測試了 OEGJ可用於治療年齡相關的眼部病症和退行性眼部病症的可能性。1名80歲的女性在4年前開始表現出白內障的症狀。她的視力逐漸惡化，即使佩戴眼鏡也不能看清電視上的畫面。她接受了 0EGK2g/天)口服給藥1個月。3個月後，她訴說甚至可以不佩戴眼鏡就能輕鬆地看電視。她還能很好地閱讀雜誌和書籍。1名78歲的男性被診斷為重度白內障超過1年，他視力模糊並最終失明。白內障手術後，他的視力恢復一些。然而，2周後，他再次完全喪失了視力。白內障手術後3個月， 他接受了 0EGJ(1.5g/d天)口服治療2個月。OEGJ治療後，他能清楚地辨認個人並且在行走時能夠尋路。他甚至能辨認菜地中的小物體(3cm長，直徑0.3cm)。1名48歲的女性由於老視而佩戴老花鏡超過8年。8個月前，她必須佩戴度數更高的老花鏡才能看清電腦上的內容。1個月的OEGJ 口服給藥(0.5g/天)之後，她甚至能夠不佩戴眼鏡閱讀電腦上的文章。1名48歲的男性在約4年前由於老視而開始主訴視力問題。不佩戴老花鏡的情況下，他不能看清身份證上的詳細內容。0EGK2g/天)口服給藥2個月後，他甚至可以不佩戴老花鏡而容易地讀出身份證。根據上述OEGJ的多種治療效果和OEGJ在治療眼部病症患者中的有前景的效果， 我們提出OEGJ可以通過顯著促進由於衰老造成的供血不足的物理重建，從而明顯改善眼中組織和細胞的生存微環境來發揮其作用。對於白內障，通過增加眼中的血流，OEGJ可以有助於預防和/或延緩蛋白聚集在晶狀體上，並且還能有助於溶解晶狀體上先前存在的蛋白聚集體。對於老視，OEGJ誘導的微環境的改善可以有利於保持晶狀體的彈性和增強負責彎曲和拉直晶狀體的睫狀肌的強度。按照該發現，OEGJ還可以用於治療其它眼部病症，例如糖尿病性視網膜病、色素性視網膜炎和眼缺血症候群。儘管已經展示並描述了某些實施方案，但是應當理解，在不脫離權利要求書所限定的較寬範圍中的技術的情況下，本領域技術人員可以在其中做出改變和改動。本公開不應局限於本申請所述的具體實施方案。在不脫離其實質和範圍的情況下，可以進行很多改動和變化，這對於本領域技術人員是顯而易見的。本公開範圍內除本文所列之外的功能上等同的方法和裝置對於閱讀了上述描述的本領域技術人員是顯而易見的。這些改動和變化意圖包括在附加權利要求書的範圍內。本公開僅受附加權利要求書的內容以及這些權利要求賦予權力的等同物的全部範圍的限制。應當理解，本公開不局限於具體方法、試劑、化合物、組合物或生物體系，上述是必然能夠變化的。還應當理解，本文所用的術語僅用於描述具體實施方案，而並非意圖進行限制。此外，當以馬庫什組的方式描述本公開的特徵或方面時，本領域技術人員應當認識到，還從任何個體成員或馬庫什組成員的亞組的方式描述了本公開。本領域技術人員應當理解，為了任何和所有目的，特別是在提供書面描述方面的目的，本文公開的所有範圍還包括任何和所有可能的子範圍以及子範圍的組合。任何列出的範圍能容易地被認為充分描述和賦予了同一範圍被分解為至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的情況。作為非限制性實例，本文討論的每個範圍能容易地分解為下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本領域技術人員還應當理解，諸如 「多至」、「至少」、「大於」、「少於」等的所有語言包括所記載的數值，並且是指能如上文所討論隨後分解成子範圍的範圍。最後，本領域技術人員應當理解，一個範圍包括每個個體成員。 因此，例如，具有1-3個單元的組是指具有1、2或3個單元的組。同樣，具有1-5個單元的組是指具有1、2、3、4或5個單元的組，以此類推。儘管本文中公開了各個方面和實施方案，其他方面和實施方案對於本領域技術人員是顯而易見的。本文公開的各個方面和實施方案僅是說明目的，而不是意圖進行限制，附加權利要求書表明真正的範圍和實質。參考文獻Armanios MY, Chen JJ, Cogan JD, Alder JK, lngersoll RG, Markin C, Lawson WE, Xie Μ, Vulto I, Phillips JA 3rd, Lansdorp PM, Greider Cff, Loyd JE. 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權利要求
1.提高有需要的個體的壽命、存活能力和生活質量的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)有機提取物(OEGJ)。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述提取物刺激端粒酶和一種或多種選自Aktl、 Bcl2、EGF, VEGF和NF κ B的細胞存活因子的表達。
3.如權利要求1所述的方法，其中與未給予所述提取物的個體相比，所述提取物增加生存年限或生活質量。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述有機提取物是乙醇提取物。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述有機提取物是甲醇提取物。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述個體是人。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述提取物通過口服給藥。
8.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述提取物通過皮下注射、肌內注射或靜脈輸注進行給藥。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所給予的提取物的量為0.01mg/kg/天至 2000mg/kg/天。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述有效量的提取物是包含所述提取物和藥學可接受的載體的製劑。
11.用於提高個體壽命、存活能力和生活質量的藥物組合物，包含有效量的柔毛水楊梅 (Geum japonicum)有機提取物和藥學可接受的載體。
12.如權利要求11所述的組合物，其中所述有機提取物是乙醇提取物。
13.如權利要求11所述的組合物，其中所述有機提取物是甲醇提取物。
14.預防或治療有需要的個體中的糖尿病的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)有機提取物。
15.預防或治療有需要的個體中的眼部疾病或疾病狀態的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)有機提取物。
16.治療有需要的個體中的炎症的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)有機提取物。
17.增強具有創傷的個體的創傷癒合的方法，所述方法包括給予所述個體有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)有機提取物。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述創傷是褥瘡。
全文摘要
本文公開了植物柔毛水楊梅(Geum japonicum)的化合物、提取物和活性部位以及增加壽命和存活能力或預防或治療各種醫學疾病狀態的方法，所述醫學疾病狀態包括糖尿病、炎症、創傷癒合、褥瘡和眼部病症。本文提供的化合物可配製為可用於所公開的方法的藥物組合物和藥物。還提供了所述化合物和提取物在製備藥物製劑和藥物中的用途。
文檔編號A61P3/10GK102497873SQ201080026127
公開日2012年6月13日 申請日期2010年6月11日 優先權日2009年6月12日
發明者李明, 程蕾 申請人:基因雷克斯製藥有限公司