一種耐輻射泛菌及其在環境工程中的應用的製作方法

2023-06-04 19:29:01

專利名稱：一種耐輻射泛菌及其在環境工程中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬 於微生物菌種資源應用環境工程的技術領域。具體說，涉及一種泛菌屬 新種及其應用環境工程的應用的技術領域。
背景技術：
目前，在汙水處理的技術和方法中，絮凝沉降法是應用廣泛、成本較低的方法之 一，而這一過程中的關鍵是選用和投加性能優良的絮凝劑。絮凝劑主要有三類。一是低分子無機鹽類，如鋁鹽和鐵鹽等，用量較大，易造成二 次汙染，影響人體健康；二是合成高分子絮凝劑，絮凝速度快，效率高，但存在生物降解難， 殘留單體有毒等問題；三是天然有機高分子絮凝劑具有選擇性強、無毒、價格便宜、易於降 解、無二次汙染和再生等優點，是目前絮凝劑研究的熱點，但較弱的絮凝活性卻限制了其進 一步推廣應用。天然有機高分子絮凝劑由微生物產生，主要包括糖蛋白、粘多糖、纖維素和核糖 等成分，每一株菌所產生的絮凝劑成分與特性均有所差異。目前，已報導的可產生絮凝 劑的微生物有細菌[如紅球菌(Rhodococcus)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、假單胞菌 (Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)等]、放線菌[如諾 卡氏菌(Nocardia)、鏈黴菌(Streptomyces)]、真菌[如漢遜酵母(Hansenula)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)、梗黴(Aureobasidium)、青黴、麴黴等]三大類。微生物產生的絮凝劑一般對水相中的顆粒狀懸浮物具有絮凝沉降效果，如活性 汙泥中分離的細菌M-127產生的絮凝劑提取物可改善汙水在脫水效果(趙繼紅，楊勁峰 等.微生物絮凝劑改善汙泥脫水性能的研究.環境科學與技術，2009，11 :88-90.)。微生物 產生的絮凝劑具有吸附染色劑與重金屬離子的特性，如微生物絮凝劑命名為mbfl對可溶 性色素次甲基蘭具有較好的脫色效果(吳涓，費文硯.微生物絮凝劑的絮凝特性及其脫色 能力的研究.生物學雜誌，2008，2 :30-32，10.)、膠質芽孢桿菌產生的微生物絮凝劑(MBF) 對高濃度重金屬離子模擬廢水中的不同金屬離子具有不同的絮凝作用(姚敏傑，連賓，微 生物絮凝劑對高濃度重金屬離子廢水絮凝作用研究.環境科學與技術，2009，11 1-4.)。泛菌屬(Pantoea)隸屬於細菌類微生物，具有多種的生物學特性與功能，是具有 重大工業開發前景的一類微生物。在醫藥、化妝品研發等領域已發現其可產生抗紫外輻射 物質[王洪媛等.抗UV-B輻射菌紫外吸收代謝產物分析及其抗紫外輻射活性研究.中國 海洋藥物雜誌，2006，25 (4) 1-5]、可產生免疫調節劑[冷靜等.成團泛菌低分子脂多糖的 分離純化和鑑定.廣西醫科大學學報，2003，20 (6) 840-842]；在環境工程領域發現可降解 孔雀石綠的菌株[任倩等.孔雀石綠降解菌M3的分離鑑定及降解特性研究.生態與農村 環境學報，2007，23 (3) :65-69]，以及可產生絮凝劑的菌株M-127 [楊勁峰等.成團泛菌產微 生物絮凝劑絮凝條件的優化.精細石油化工進展，2009，10 (2) :39-42]。隨著研究的深入新 的菌種及特性正逐步被研究及應用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新的微生物資源泛菌屬新菌，並從環境工程技術領域 說明其潛在的工業開發前景。本發明具體提供了一株從新疆沙漠環境中分離篩選的泛菌W36-1，此菌具有較強 的耐紫外輻射特性，經微生物分類學檢測鑑定，確定為泛菌屬新種。目前，該菌株已於申請 日前保藏於布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵 編100101，保藏日期是2010年3月26日，保藏號是CGMCC No. 3701。經微生物多相分類 鑑定確定其為泛菌屬新種，其生物學名稱暫定為泛菌(Pantoea sp. W36-1)，確定該菌建議 的分類命名為Pantoea sp.。泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701菌株生長於固體PDA培養基上，稱取 200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，加20g葡萄糖， 121°C滅菌20分鐘左右，菌落表面呈圓形、光滑溼潤、凸起、淡粉色、黏稠不易挑取，透明；革 蘭氏陰性(G-)、好氧、細胞杆狀、不形成芽孢；可在15-45°C中溫範圍內生長。對W36-1菌株的16S rRNA基因進行測序及比對分析，其與泛菌屬(Pantoea)同源 相似性最高，與Pantoea gaviniae A18/07T最高同源性為97.1%。根據《常見細菌鑑定手冊》、《伯傑氏細菌鑑定手冊》等微生物分類鑑定準則及 多相分類鑑定的結果，確定W36-1菌株為細菌類泛菌屬一新種，命名為泛菌(Pantoea sp. W36-1)，確定該菌建議的分類命名為Pantoea sp.。本發明提供的菌株W36-1菌體生長與繁殖對營養物質無特殊要求，在常見的細菌 培養基及PDA、察氏等培養基上均可以生長。可採用斜面傳代法、冷凍乾燥法、甘油管等常規 微生物保藏技術與方法進行保藏及存活性檢測。將W36-1菌株接種於含不同濃度的Pb2+、CU2+、C02+、Hg2+、Zn2+的PDA固體培養基平板 上，30°C恆溫培養觀察，W36-1菌株對Co2+的耐受性較低，而對其它所測定的金屬離子耐受 性較高；對除Co2+以外的四種重金屬離子均有一定吸附作用，其中對Pb2+離子的吸附效果 最好，吸附率達89. 2%;Hg2+其次，為21. 76%，Cu2+為12. 45%;W36-1胞外產物在200_250nm 有一明顯吸收峰，多糖溶液能消除其54. 89%的自由基。進一步，本發明提供了泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701製備絮凝劑的制 備方法，將菌株泛菌(Pantoea sp. ff36-1) CGMCC No. 3701進行發酵培養48h後，取100ml發 酵液在6000r/min條件下離心lOmin，上清液加入1. 5倍體積的無水乙醇，混勻後4°C下靜 置過夜，析出的沉澱物在6000r/min條件下離心30min，所得的沉澱物用70%的乙醇洗滌 2 3次，真空乾燥或恆溫通風乾燥得絮凝劑粗品。泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701發酵培養物具有較好的絮凝活性，發酵 培養物絮凝活性為81. 7% -83. 15%，其產率為6g/L。所產絮凝劑對鹼性品紅、紅色素(自 制微生物天然紅色素)、溴甲基酚綠、鉻黑藍、亞甲基蘭等染色劑均具有較好的脫色效果，尤 其是對天然紅色素、溴甲基酚綠、鉻黑藍的脫色率均高於90%。說明W36-1菌株所產生的絮 凝劑可在某些染色劑廢水處理方面應用。通過實施本發明具體的發明內容，可以達到以下有益效果本發明定向篩選到泛菌(Pantoea sp. ff36-1) CGMCC No. 3701及其產生的絮凝劑和
4絮凝劑在去除廢水中的懸浮物、染色劑和重金屬方面的應用。經檢測表明發酵培養物絮凝 活性最高可達81. 7% -83. 15%，其產率為6g/L ；對天然紅色素、溴甲基酚綠、鉻黑藍的脫色 率均高於90% ；除Co2+以外的Pb2+、Hg2+、CU2+、Zn2+四種重金屬離子均有一定的吸附作用，其 中對Pb2+離子的吸附效果最好，吸附率達89. 2%。


圖 1 所示為泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701 抗紫外特性。圖2所示為泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701培養物對不同重金屬的吸附 能力。圖3所示為泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701培養物對不同色素的脫色效^ o圖4所示為泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701生長與發酵培養物絮凝活性。圖5所示為泛菌(Pantoea sp. ff36-1) CGMCC No. 3701提取物紫外-可見分光光度 掃描圖。
具體實施例方式以下是本發明提供的菌株在環境工程技術領域的應用實驗，旨在說明其應用前景 的一面，而本發明所提供的菌株的應用領域、應用方法並不限定於此。發明如無特別說明，在以下實施例中採用如下基礎培養基。LB 培養基蛋白腖 10g，酵母浸粉 5g，NaCl 5g，水 1000ml, pH7. 0。PDA培養基稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水1000ml煮沸半個小時，紗 布過濾，加20g葡萄糖，121°C滅菌20分鐘左右。察氏培養基:NaN033g, K2HP04 lg, MgS04 7H20 0. 5g, KC1 0. 5g, FeS04 7H20 O.Olg，蔗糖30g，H20 1000ml，加熱溶解，分裝後121°C滅菌20min。實施例1 泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701 的培養、鑑定通過從新疆沙漠環境中分離篩選的泛菌W36-1，該菌株生長於固體PDA培養基，通 過稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，加20g葡萄 糖，121°C滅菌20分鐘。W36-1菌株為革蘭氏陰性(G-)、好氧、細胞杆狀、不形成芽孢；可很 好的成長在LB、PDA和察氏培養基上，菌株生長在固體PDA培養基，菌落表面呈圓形、光滑溼 潤、凸起、淡粉色、黏稠不易挑取，透明；革蘭氏陰性(G-)、好氧、細胞杆狀、不形成芽孢；可 在15-45°C中生長。具有較強的耐紫外輻射特性。經微生物多相分類鑑定確定其為泛菌屬 新種，其生物學名稱暫定為Pantoea sp.W36_l。目前該菌株已保藏於布達佩斯條約微生物 國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2010年3 月26日，保藏號為CGMCC No. 3701。本發明提供的菌株W36-1菌體生長與繁殖對營養物質無特殊要求，在常見的細菌 培養基及PDA、察氏等培養基上均可以生長。可採用斜面傳代法、冷凍乾燥法、甘油管等常規 微生物保藏技術與方法進行保藏及存活性檢測。
氧化酶反應陰性；以BI0L0G MICR0STSTI0N SYSTEM GN2檢測卡對其代謝特徵進行 測定分析，結果如表1所示。對W36-1菌株的16S rRNA基因進行測序及比對分析，其與泛菌屬(Pantoea)同源 相似性最高，與Pantoea gaviniae A18/07T最高同源性為97.1%。根據《常見細菌鑑定手冊》、《伯傑氏細菌鑑定手冊》等微生物分類鑑定準則及多相 分類鑑定的結果，確定W36-1菌株為細菌類泛菌屬一新種。表1 Biolog Microstation System GN2 檢測卡測試結果 實施例2 泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701的抗紫外輻射特性將W36-1菌株以液體LB為基礎培養基，30°C、180r/min恆溫振蕩培氧16h，至菌種 對數期中後。4000rpm收集培養物中的菌體，以生理鹽水(0. 75% NaCL)溶液洗滌菌體兩次 後再以生理鹽水進行懸浮並稀釋為0D,為0. 2的菌懸液；取10mL菌懸液置於9cm培養皿 中，放置於15W紫外燈下25cm處，振蕩輻照處理，每隔一段時間進行取樣1次，以平板塗布 法檢測菌株的存活量，並以大腸桿菌為對照，結果參見附圖1所示。測定結果顯示，W36-1在上述條件下紫外輻射15min後仍有存活，而對應的大腸杆 菌在輻射lmin後未見存活，由此可見將W36-1菌株具有較強的抗紫外輻射特性。
實施例3 泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701對重金屬離子耐受性將W36-1菌株分別接種於含不同濃度的Pb2+、CU2+、C02+、Hg2+、Zn2+的PDA固體培養 基平板上，30°C恆溫培養，檢測其生長狀況。其測定結果如表2所示。表2W36-1菌株對不同重金屬的耐受性實驗(濃度單位mg/L) 注+為生長，-為不生長，士為生長較弱由表2結果可知，在實驗條件下W36-1菌株對Pb2+的耐受性在1200mg/L以上、Cu2+ 在 400mg/L、Hg2+ 在 500mg/L、Zn2+ 在 1000mg/L, Co2+ 的耐受性小於 50mg/L。說明 W36-1 菌 株對Co2+的耐受性較低，而對其它所測定的金屬離子耐受性較高。實施例4 泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701對重金屬離子的吸附在菌株耐受性範圍內，配製不同濃度Pb2+、Cu2\ Co2\ Hg2+、Zn2+的PDA液體發酵培 養基，其濃度分別為 1000mg/L、300mg/L、800mg/L、50mg/L 和 700mg/L，接入 W36-1 菌株於 30°C、180r/min恆溫振蕩培養48小時，6000r/min離心5min，取上清液測定其不同重金屬的 含量，計算該菌對各重金屬的吸附能力。其吸附率計算公式為r= (B^Bi)7^X100%，該 式中，B。為不加菌液的培養基中重金屬的濃度，Bi為加菌液培養後的重金屬的濃度。結果 參見附圖2所示。不同重金屬離子的測定方法參照《EDTA及其同類化合物的分析應用》(蒲希比， R.著，趙亢臣譯，地質出版社，1982)的方法進行。Pb2+、CU2+、C02+、Zn2+採用二甲酚橙顯色法， Hg2+採用甲基百裡香酚藍顯色法。由附圖2結果可知W36-1菌株對除Co2+以外的四種重金屬離子均有一定的吸附 作用，其中對Pb2+離子的吸附效果最好，吸附率達89. 2% ;1^2+其次，為21.76%，Cu2+為 12. 45%。實施例5 泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701製備絮凝劑對染色劑的吸附
作用將W36-1菌株接種到PDA液體發酵培養基中，於30°C、180r/min恆溫振蕩培養48 小時，直接以發酵培養物進行染色劑的吸附性能測定。具體的測定方法在10mL、0. 05g/l
7的鹼性品紅、紅色素(自製微生物天然紅色素)、溴甲基酚綠、鉻黑藍、亞甲基蘭溶液(以PH 為7的緩衝溶液配製)中各加入10mL發酵培養物、2mL 1% CaCl2溶液，振蕩混勻後靜置 lOmin以上；分別在\ 54Qnm、A 53Qnm、A 62(lnm、A 635nm、A 620nm處測定其吸光值，並以不加發酵培養 物的色素溶液為空白對照，計算脫色率r =7^X100%，該式中，&為不加菌液的吸
光度值，為加菌液的吸光度值。結果參見附圖3所示。參見附圖3所示測定結果顯示，W36-1所產絮凝劑對上述幾種色素均具有較好的 脫色效果，尤其是對天然紅色素、溴甲基酚綠、鉻黑藍的脫色率均高於90%。說明W36-1菌 株所產生的絮凝劑可在某些染色劑廢水處理方面應用。實施例6 泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701發酵培養物絮凝活性將W36-1菌株接種到PDA液體發酵培養基中，於30°C、180r/min恆溫振蕩培養，每 6h取樣，以未接種菌種的培養基作參比調零，測定培養液在0D_的生長曲線，同時測定培 養液在對高嶺土懸濁液的絮凝活性。絮凝活性檢測方法取發酵培養物2mL，加入lg/L的高嶺土溶液50mL中，靜置處 理5分鐘以上，以入55(tam光波進行檢測其吸光度，其吸光值記作A ；以空白髮酵培養基為空 白對照，其吸光值記作B ；絮凝去除率(F)為[(B-A)+BX100% ]。測定結果參見附圖4所
7J\ o由附圖4所示的生長曲線表明，W36-1於12h進入對數生長期，24h後進入穩定期 上升緩慢，42h後其0D550略有降低；絮凝曲線表明，W36-1的絮凝率在24h前隨著菌的生長 而逐漸上升，但24-42h略有下降，但在48h快速上升，絮凝率達到最高值80. 28 %，隨後快速 下降。實施例7 泛菌(Pantoea sp. W36_1)CGMCC No. 3701製備絮凝劑的提取及提取物 的絮凝活性按實施例6所示的方法，對菌株W36-1進行發酵培養48h後，取100ml發酵液在 6000r/min條件下離心lOmin，上清液加入1. 5倍體積的無水乙醇，混勻後4°C下靜置過夜， 析出的沉澱物在6000r/min條件下離心30min，所得的沉澱物用70%的乙醇洗滌2 3次， 真空乾燥或恆溫通風乾燥得絮凝劑粗品。稱重並計算絮凝劑產率；將所製備的絮凝劑重新 溶於100ml水中，配製成水溶液，按實施例6中所述方法進行絮凝活性的檢測，同時檢測發 酵培養物絮凝活性，比較兩者之間的差異。經測定，以本實施例中所述的方法進行絮凝劑的生產和提取，發酵培養物絮凝活 性為81. 7%，其產率為6g/L，重新製備的水溶液絮凝活性提高到83. 15%。實驗測定結果說明，以本實施例所述的方法製備絮凝劑，可提取發酵培養所產生 的有效成分；提取過程可能去除部分雜質有助於提高絮凝活性；發酵培養物與提取物具有 相同的絮凝活性，可直接應用於水相處理。實施例8 不同培養基對絮凝劑及其活性的影響以察氏培養基為發酵培養基，按實施例6、7中所述的方法進行發酵培養、絮凝劑 的製備與活性的比較分析。本實驗測定結果顯示，以察氏培養基進行發酵培養，其發酵培養物絮凝活性可達 82. 78%，但其按實施例7中所述方法製備絮凝劑產率僅有0. 3g/L，且重新製備的水溶液絮 凝活性僅有35. 7%。此實施結果與實施6、7所檢測結果比較說明兩種培養基發酵培養所產生的絮凝劑在主成份上具有較大的差異性；可以通過培養基營養源的控制生產不同性質的 絮凝劑。實施例9 泛菌(Pantoea sp. W36-1) CGMCC No. 3701胞外產物的光吸收與抗氧化 特性按實施例6、7中所述的方法進行菌株的發酵培養與代謝產物的提取。將所提取的 產物以水溶解，在紫外分光光度下內進行全波段(或是紫外波段下進行光掃描分析)，其測 定結果參見附圖5所示；以Fenton法進行抗羥自由基氧化特性的測定。加入1ml的0. 15mo l/LFeS04溶 液，0. 3ml的2mmol/L水楊酸，lml 100mg/L多糖水溶液，最後加入0. 7ml 6mmol/L H202啟 動，25°C反應 lh，測定 0D510nm，按公式自由基清除率(% ) = [1-(Ai-A0i)/AO] X 100%, if 算，其中AO為對照不加樣品，Ai為樣品的吸光值，A0i為不加水楊酸樣品的吸光值。由附圖5可以看出，本發明胞外產物在200-250nm有一明顯吸收峰。Fenton法測 定結果顯示此多糖溶液能消除54. 89%的自由基。通過上述實施例，可以充分說明本發明提供的定向篩選的泛菌(Pantoeasp. W36-1)CGMCC No. 3701，可用常規的碳氮源進行發酵培養，經檢測表明發酵培養物絮凝活性 最高可達81. 7% -83. 15%，其產率為6g/L ；對天然紅色素、溴甲基酚綠、鉻黑藍的脫色率均 高於90% ；除Co2+以外的Pb2+、Hg2+、CU2+、Zn2+四種重金屬離子均有一定的吸附作用，其中對 Pb2+離子的吸附效果最好，吸附率達89. 2%。絮凝劑可廣泛應用在去除廢水中的懸浮物和 在去除廢水中的染色劑領域，同時製備的絮凝劑在去除廢水中的重金屬方面具有廣泛的應 用。
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權利要求
一種泛菌(Pantoea sp.W36-1)CGMCC No.3701。
2.如權利要求1所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701，其特徵在於，所述的 菌株對Co2+的耐受性較低，而對其它的金屬離子耐受性較高。
3.如權利要求1所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701，其特徵在於，所述的 菌株對Pb2+吸附率為89. 2% ；Hg2+吸附率為21. 76%, Cu2+吸附率為12. 45%。
4.如權利要求1所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701，其特徵在於，所述的 菌株胞外產物在200-250nm吸收峰，多糖溶液具有消除自由基。
5.如權利要求1所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1)CGMCC No. 3701產生絮凝劑的制 備方法，其特徵在於，所述的絮凝劑為絮凝劑粗品，將菌株泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701進行發酵培養48h後，取100ml發酵液在6000r/min條件下離心lOmin，上清液加 入1. 5倍體積的無水乙醇，混勻後4°C下靜置過夜，析出的沉澱物在6000r/min條件下離心 30min,所得的沉澱物用70 %的乙醇洗滌2 3次，真空乾燥或恆溫通風乾燥得絮凝劑粗品。
6.如權利要求1或2所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701產生的絮凝劑。
7.如權利要求6所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701產生的絮凝劑在去除 廢水懸浮物中的應用。
8.如權利要求6所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701產生的絮凝劑在去除 廢水染色劑中的應用。
9.如權利要求6所述的泛菌(Pantoeasp. W36-1) CGMCC No. 3701產生的絮凝劑在去除 廢水重金屬方面中的應用。
全文摘要
本發明公開一種泛菌(Pantoea sp.W36-1)CGMCC No.3701及其產生的絮凝劑和絮凝劑在去除廢水中的懸浮物、染色劑和重金屬方面的應用。該菌胞外產物在200-250nm有一明顯吸收峰，多糖溶液能消除其54.89％的自由基。將菌株進行發酵培養48h後，取100ml發酵液在6000r/min條件下離心10min，上清液加入1.5倍體積的無水乙醇，混勻後4℃下靜置過夜，析出的沉澱物經離心，將沉澱物用70％的乙醇洗滌2～3次，乾燥製備獲得，其發酵培養物絮凝活性為81.7％-83.15％，其產率為6g/L，可廣泛應用在去除廢水中的懸浮物、染色劑和重金屬等方面具有廣泛的應用。
文檔編號C02F1/52GK101864379SQ20101016670
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者張志東, 茆軍, 謝玉清, 顧美英 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所