一種Exendin－4多肽的製備方法
2023-06-19 22:12:01
專利名稱：一種Exendin－4多肽的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及用基因工程技術製備多肽或蛋白質的方法。
美國專利(專利號5,424,286)已公開了Exendin-4胺基酸序列及其治療糖尿病功能，其中公開的Exendin-4多肽全長為hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlknggpssgappps。
由於Exendin-4多肽在治療II型糖尿病上有許多優越性如可經多種給藥途徑起效，包括口服、舌下、經肺吸入等；主要降低餐後血糖升高，有效作用時間長於GLP-1等，因此，Exendin-4多肽有較大的市場需求。
但是，Exendin-4多肽在動物體內含量極微，提取工藝複雜，難以大量生產以滿足醫用。目前市場上多採用多肽合成的方法，如Amylin公司。至今尚未見關於應用基因工程技術製備該類多肽的規模生產方法的公開報導。
本發明公開了一種用基因工程技術製備Exendin-4多肽的方法，其與傳統的多肽合成方法相比，極大程度地降低了生產成本，並滿足規模生產的要求。
本發明提供一種Exendin-4多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包括
①設計併合成引物；②用PCR法拼接Exendin-4基因；③運用適當的表達載體構建重組質粒；④將重組質粒轉入宿主細胞，獲得融合表達或非融合表達Exendin-4多肽的工程菌；⑤發酵培養融合表達或非融合表達Exendin-4多肽的工程菌；⑥純化分離得到Exendin-4多肽。
在所述步驟①中，包括設計併合成引物，且引入酶切位點。
在所述步驟①中，所述引物可用於拼接Exendin-4基因，並引入構建重組質粒所需的酶切位點。所述引物可以是，但不局限於是本發明的實施例中例舉的引物，包括引物1(序列編號2)，引物2(序列編號3)，引物3(序列編號4)，引物4(序列編號5)，或引物5(序列編號7)；所述引入的酶切位點為BglII，KpnI，EcoRI，HindIII，XhoI，或酵母α信號肽切割位點(即KEX2酶識別位點)。
在所述步驟③中，所述表達載體可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，包括，但不局限於，pET32a(+)質粒，pBV220質粒，pPIC9質粒，或YESTM載體。
在所述步驟④中，所述宿主細胞可以是原核宿主細胞，包括大腸桿菌，枯草桿菌；也可以是真核宿主細胞，包括酵母細胞，昆蟲細胞，或哺乳動物細胞。
本發明中，「一種Exendin-4多肽」是指具有序列編號1所示的胺基酸序列的多肽。
本發明中，「Exendin-4基因」是指含有編碼序列編號1所示胺基酸序列的多肽的各種核苷酸序列的組合。在本發明的實施例中提供了序列編號6，序列編號8兩種核苷酸序列組合。
本發明中，獲得含有Exendin-4基因的重組質粒時，可選用本領域已知的各種表達載體，包括商業化的載體，可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，包括，但不局限於，pET32a(+)質粒，pBV220質粒，pPIC9質粒，或YESTM載體。
本發明中，「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等，常用的真核宿主細胞包括酵母細胞(例如甲醇酵母、多形漢遜酵母(Hansenula polymorphis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
本發明中的表達載體在轉入宿主細胞後可融合表達Exendin-4或非融合表達Exendin-4。
本發明中，發酵培養融合表達或非融合表達Exendin-4多肽的工程菌包括以下步驟經篩選的工程菌株活化後接入培養液(例如LB培養液、BMGY、YPD培養液)中製備種子液，培養過夜後接種至發酵罐中，發酵用培養基為基礎培養基(例如M9+LB培養基)，發酵條件控制為pH5-9，溫度28℃-37℃，溶氧控制在20％以上。培養一段時間後開始補料或加入甘油，當菌體OD值達到高密度，加入誘導劑(例如IPTG、甲醇)誘導表達，誘導2-84小時。
本發明中，從發酵產物中純化分離得到Exendin-4多肽包括以下要點收集發酵產物，具有Exendin-4蛋白活性的多肽已表達或融合表達，表達產物存在於培養液或菌體中；如表達產物在菌體中，則需破菌，如為融合表達需經腸激酶酶解；經多步純化獲得產物(包括過金屬螯合柱層析、離子柱層析、反向層析、透析、超濾或凝膠過濾等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC檢驗純度大於95％的Exendin-4。
運用本發明的方法獲得的Exendin-4多肽，具有較低的毒性(參見Amylin公司I期臨床試驗結果)。
運用本發明提供的方法獲得的Exendin-4多肽，含有或與已知Exendin-4多肽具有相同或類似的胺基酸序列及活性結構。
已有動物試驗或人體試驗確證，本發明的Exendin-4多肽具有治療II型糖尿病及減肥的功能(參見Amylin公司II期臨床實驗結果；Gang Xu等，糖尿病學DIABETES，第2270-2276頁，1999年10月版；Margarzata Szayna等，內分泌學ENDOCRINOLOGY，第1936-1941頁，No.6，Vol.141，2000年版)。
與傳統的多肽合成方法相比，本發明的製備方法突破了以往僅以胺基酸合成方法獲得Exendin-4多肽的禁錮，使得大批量，低成本的規模生產成為可能。是生物技術運用於大規模生產的又一成功範例。附圖的簡要說明下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1 pET32a(+)載體物理圖譜，其中，T7啟動子764-780；組氨酸標籤2140-157；T7轉錄起始點763T7終止子26-72；Trx編碼序列366-692；lacI編碼序列1171-2250；組氨酸標籤1327-344；pBR322複製子3684；多克隆位點157-217；Amp抗性基因4445-5302。圖2 重組質粒1的構建示意圖。圖3 Exendin4的融合表達。圖4 重組質粒2(pPIC9-Ex4)構建示意圖。圖5 pPIC9物理圖譜，其中，5』AOX1啟動子片段(5』AOX1 promoter fragment)1-948；α信號肽(α-factor secretion signal)949-1218；多克隆位點(Multiple Cloning Region)1192-1241；3』AOX1轉錄終點片段(3』AOX1 transcription termination(TT)fragment)1253-1586；組氨酸基因(HIS4 ORF)4514-1980；3』AOX1片段(3』AOX1 fragment)4870-5626；ColE1複製起點(ColE1 origin)6708-6034；Amp抗性基因(Ampicillin resistance gene)7713-6853。圖6 E.coli表達的Exendin-4純化電泳圖，其中，1.Chelating Sepharose FF柱層析純化融合蛋白；2.EK酶酶切後；3.CM Sepharose FF柱層析純化後；4.Source 30 RPC柱層析純化後；
5.Sephadex G-25柱層析純化後；6.分子量Marker。圖7 Pichia pastoris表達的Exendin-4純化電泳圖，其中，1.發酵液上清；2.CM Sepharose FF柱層析穿透樣；3.CM Sepharose FF柱層析洗脫樣；4.Source 30 RPC柱層析洗脫樣；5.Sephadex G-25柱層析純化後；6.分子量Marker。
1.設計併合成引物設計引物1，2，3，4(序列編號2，3，4，5)，引物1引入腸激酶識別位點響應DNA序列，同時引入BglII和KpnI酶切位點，引物4引入EcoRI與HindIII酶切位點。合成引物1，2，3，4(分別為序列編號2，3，4，5)，(合成的方法參見J.薩姆布魯克等編寫的《分子克隆實驗指南》，第538-575頁)。
2.用PCR方法拼接Exendin-4基因用PCR方法拼接Exendin-4基因(序列編號6)1)按以下次序，將各成分在0.5ml滅菌離心管內混合
滅菌水 30ul10X擴增緩衝液(上海生工)10ul4種dNTP混合物，每種濃度為1.25mmol/L16ul引物1(25pmol) 1ul引物2(25pmol) 1ul引物3(25pmol) 1ul引物4(25pmol) 1ulTaq酶(上海生工)0.5ul加水至終體積100ul加100ul礦物油2)放入PCR儀，設置條件反應，首輪循環94℃5分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘，後續循環94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘，末輪循環94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃10分鐘。設置30個循環，PCR擴增基因。
Exendin-4基因拼接完成後用KpnI和HindIII酶切(15ulPCR產物，3ul 10X緩衝液[華美公司]，1ulKpnI(華美公司)，1ulHindIII(華美公司)，10ul無菌水，37℃，反應1小時)。電泳回收得到KpnI和HindIII酶切後的Exendin-4基因片段。
3.構建重組質粒(參見圖2)參見圖1，將Exendin-4基因克隆與硫氧還蛋白(Trx)基因後，Exendin-4基因與硫氧還蛋白(Trx)基因之間具有腸激酶(eternokinase)識別位點及六個連續組氨酸序列。
1)用KpnI和HindIII酶切開表達質粒pET32a(+)(15ul質粒pET32a(+)[Novagen公司]，3ul 10X緩衝液[華美公司]，1ulKpnI(華美公司)，1ulHindIII(華美公司)，10ul無菌水，37℃，反應1小時)。
2)電泳回收經KpnI和HindIII酶切的pET32a(+)質粒。
3)將用KpnI和HindIII酶切開的表達質粒pET32a(+)與KpnI和HindIII酶切後的Exendin-4基因片段連接。(5ul無菌水，1ul10X緩衝液[華美公司]，1ul步驟2)獲得的產物，3ul步驟2獲得的產物，0.3ul連接酶[華美公司]，16℃，反應過夜)。
4)轉化入大腸桿菌DH5α(購自Invitrogen公司)，塗布在帶氨苄青黴素的LB平板上。
5)長出的菌落即為含有重組質粒1的轉化子，挑選單菌落，在LB培養基中培養並抽提質粒。
6)經DNA序列分析與設計序列相同。
4.重組質粒在宿主細胞(大腸桿菌)中融合表達1)將重組質粒1轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司)，用氨苄青黴素抗性篩選，得陽性克隆，為Exendin-4的表達工程菌(pET32a(+)-Exendin-4/BL21(DE3))。
2)將經篩選的Exendin-4工程菌劃線在含100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，37℃培養16小時。挑選生長良好的單菌落，接種於LB培養液(含Amp100μg/ml)，37℃培養過夜。將過夜菌以1∶20接種於LB培養液(含Amp100μg/ml)，37℃振蕩培養。當OD600達0.6～0.8時，加IPTG至終濃度0.5mM，誘導6小時。菌液經5000rpm，5min離心。去培養基上清，沉澱菌體加入上樣緩衝液，100℃水浴3min，離心後上SDS-PAGE電泳(濃縮膠5％，分離膠15％)，染色、脫色、掃描分析。因Trx-Exendin-4融合基因長591bp，融合蛋白含197個胺基酸，理論分子量約為21.67KD。SDS-PAGE結果表明在14KD和24KD之間有明顯表達條帶(圖3)，與預期相符，融合蛋白佔菌體總蛋白20％左右。篩選高表達的菌株為工程菌株。
5.發酵培養表達或融合表達Exendin-4多肽的工程菌自上述保存的工程菌株斜面上取一環菌種接入LB培養液中，30℃200rpm搖瓶培養12-16小時後按10％接種量接入M9+LB培養液中，30℃250rpm搖瓶培養6小時。將種子液按1∶20接入量加入裝有M9+LB培養基的發酵罐中，30℃，400rpm培養，通氣量0.2vvm，控制pH值7.0，溶解氧(DO)30％以上，培養至4-6小時，DO值開始上升時開始補加葡萄糖，至OD600約為20時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導3.5小時停止發酵。
6.純化分離得到Exendin-4多肽離心(6,000rpm)上述獲得的發酵產物以收集菌體。按1∶10的比例將菌體垂懸於20mMPB，500mMNaCl的緩衝液中，壓力勻漿破菌，壓力達10,000psi。離心上清液過預平衡的Chelating Sepharose FF，淋洗至基線後用20mMPB，500mMNaCl，150mM咪唑緩衝液洗脫，收集洗脫液，經ChelatingSepharose FF純化後，Trx-Exendin-4融合蛋白佔總蛋白的80％左右。透析或超濾換液後調整蛋白濃度為2mg/ml。加重組腸激酶(Invitrogen公司)0.3U/ml，25-30℃反應過夜，反應液調pH至3.0後上CM-Sepharose FF，淋洗至基線後用20mMPB，300mMNaCl洗脫，收集洗脫液，加入0.1％TFA後，上Source 30RPC柱，淋洗後用0.1％TFA，50％乙腈梯度洗脫，收集洗脫峰，Sephadex G-25除去乙腈後取樣分析。SDS-PAGE或RP-HPLC檢測純度大於95％(參見圖6)。實施例2Exendin-4多肽的製備方法本實施例用Invitrogen公司畢赤氏酵母表達載體，如pPIC9質粒，以酵母為宿主細胞表達Exendin-4基因。
1.設計併合成引物設計引物5，引物5中引入XhoI酶切位點和酵母α信號肽切割位點(KEX2酶識別位點)，合成引物5(序列編號7)，(合成方法參見《分子克隆實驗指南》，第538-575頁)。
2.用PCR方法拼接Exendin-4基因用PCR方法拼接Exendin-4基因(序列編號8)1)按以下次序，將各成分在0.5ml滅菌離心管內混合滅菌水 10ul10X擴增緩衝液(上海生)10ul4種dNTP混合物，每種濃度為1.25mmol/L 16ul引物5(25pmol)1ul引物4(25pmol)1ul重組質粒12ugTaq酶(上海生工) 0.5ul
加水至終體積100ul加100ul礦物油2)放入PCR儀，設置反應條件，首輪循環94℃5分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘，後續循環94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘，末輪循環94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃10分鐘。反應30個循環，PCR擴增基因。
電泳回收基因片段，用Xho I和EcoRI酶切處理(15ulPCR產物，3ul 10X緩衝液[華美公司]，1ulXhoI(華美公司)，1ulEcoR I(華美公司)，10ul無菌水，37℃，反應1小時)。回收。
3.構建重組質粒1)參見圖5，用XhoI和EcoRI酶切pPIC9質粒(Invitrogen公司)。(15ulpPIC9質粒，3ul 10X緩衝液[華美公司]，1ulXho I(華美公司)，1ulEcoR I(華美公司)，10ul無菌水，37℃，反應1小時)。
2)電泳回收3)回收片段與經XhoI和EcoRI酶切後的基因片段連接(5ul無菌水，1ul10X緩衝液[華美公司]，1ul步驟2)獲得的產物，3ul步驟2獲得的產物，0.3ul連接酶[華美公司]，16℃，反應過夜)。
4)轉化大腸桿菌DH5α(購自Invitrogen公司)，塗布在帶氨苄青黴素的LB平板上。
5)篩選轉化子得重組質粒2(參見圖4)6)經測序證明序列正確。
4.重組質粒在宿主細胞(酵母)中融合表達大量抽提重組質粒2，用SalI線性化，然後用無水乙醇沉澱，70％乙醇洗滌後晾乾，溶於適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然後電轉化製備好的GS115宿主菌，塗布在MD篩選培養基上，30℃培養3天，得到酵母轉化子。
從MD平板上選20個單克隆分別接種3ml到MGY培養基中，30℃培養48小時後加入27ml MM培養基進行誘導，表達72小時，取樣進行SDS-PAGE檢測，篩選高表達的菌株為工程菌株。
5.發酵培養表達或融合表達Exendin-4多肽的工程菌將上述獲得的工程菌株接種於BMGY培養基中30℃培養24小時後，作為種子液接種於發酵罐中，發酵培養基為基礎培養基加入為量元素的溶液，發酵溫度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低於30％，菌體生長24小時後開始補加甘油，同時將pH調到3.0。菌體OD達到200時開始加入甲醇誘導表達。起始甲醇添加量控制為1-2ml/L.小時，隨後逐漸增大至15-20ml/L.小時，通過調節攪拌溫度和通氣量保持溶氧值大於30％，必要時通入純氧。連續誘導培養72小時後收穫培養液，離心收集上清。
6.純化分離得到Exendin-4多肽將上述獲得的發酵產物離心收集上清，將上清超濾濃縮，上用20mMPB預平衡的CM-Sepharose FF柱，淋洗至基線後用150mMNaCl，20mMPB洗脫，收集洗脫峰，加入0.1％TFA後上Source 30RPC柱，淋洗至基線後用0.1％TFA，30％異丙醇洗脫，收集洗脫峰，過Sephadex G-25除去異丙醇後取樣分析，SDS-PAGE或RP-HPLC檢測純度大於95％(參見圖7)。
序列表1.序列總數為8個2.各序列具體信息(1)序列1信息(A)序列特徵39胺基酸組成的多肽(B)序列描述序列1HisGlyGluGlyThr PheThrSerAspLeu SerLysGlnMetGlu GluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrp LeuLysAsnGlyGly ProSerSerGlyAla ProProProSer(2)序列2信息(A)序列特徵57bp的線性單鏈核酸(B)序列描述序列2GCCCAGATCT GGGTACCGAT GACGATGACA AGCATGGCGAAGGTACATTT ACCAGTG(3)序列3信息(A)序列特徵48bp的線性單鏈核酸(B)序列描述序列3ACATTTACCA GTGACTTGTC AAAACAGATG GAAGAGGAGGCAGTGCGC(4)序列4信息(A)序列特徵48bp的線性單鏈核酸(B)序列描述序列4CGGGCCACCG TTCTTAAGCC ACTCAATAAA TAAGCGCACTGCCTCCTC(5)序列5信息(A)序列特徵56bp的線性單鏈核酸(B)序列描述序列5CGCAAGCTTG AATTCATTAC GATGGCGGAG GTGCCCCGCTACTCGGGCCA CCGTTC(6)序列6信息(A)序列特徵168bp的線性雙鏈核酸(B)序列描述序列6GCCCAGATCT GGGTACCGAT GACGATGACA AGCATGGCGA AGGTACATTT 50CGGGTCTAGA CCCATGGCTA CTGCTACTGT TCGTACCGCT TCCATGTAAAACCAGTGACT TGTCAAAACA GATGGAAGAG GAGGCAGTGC GCTTATTTAT 100TGGTCACTGA ACAGTTTTGT CTACCTTCTC CTCCGTCACG CGAATAAATATGAGTGGCTT AAGAACGGTG GCCCGAGTAG CGGGGCACCT CCGCCATCGT 150ACTCACCGAA TTCTTGCCAC CGGGCTCATC GCCCCGTGGA GGCGGTAGCAAATGAATTCA AGCTTGCG 168TTACTTAAGT TCGAACGC(7)序列7信息(A)序列特徵32bp的線性單鏈核酸(B)序列描述序列7GTATCTCTCG AGAAAAGACA TGGCGAAGGT AC(8)序列8信息(A)序列特徵154bp的線性雙鏈核酸(B)序列描述序列8GTATCTCTCG AGAAAAGACA TGGCGAAGGT ACATTTACCA GTGACTTGTC 50CATAGAGAGC TCTTTTCTGT ACCGCTTCCA TGTAAATGGT CACTGAACAGAAAACAGATG GAAGAGGAGG CAGTGCGCTT ATTTATTGAG TGGCTTAAGA 100TTTTGTCTAC CTTCTCCTCC GTCACGCGAA TAAATAACTC ACCGAATTCTACGGTGGCCC GAGTAGCGGG GCACCTCCGC CATCGTAATG AATTCAAGCT 150TGCCACCGGG CTCATCGCCC CGTGGAGGCG GTAGCATTAC TTAAGTTCGATGCG 154ACGC
權利要求
1.一種Exendin-4多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包括①設計併合成引物；②用PCR法拼接Exendin-4基因；③運用表達載體構建含有Exendin-4基因的重組質粒；④將重組質粒轉入宿主細胞，獲得融合表達或非融合表達Exendin-4多肽的工程菌；⑤發酵培養融合表達或非融合表達Exendin-4多肽的工程菌；⑥純化分離得到Exendin-4多肽。
2.如權利要求1所述的製備方法，其進一步特徵在於，所述步驟①中，包括設計併合成引物，且引入酶切位點。
3.如權利要求2所述的製備方法，其進一步特徵在於，所述引物可以是用於拼接Exendin-4基因，可以是引物1(序列編號2)，引物2(序列編號3)，引物3(序列編號4)，引物4(序列編號5)，或引物5(序列編號7)；所述引入的酶切位點可以是構建重組質粒所需的酶切位點，可以是BglII，KpnI，EcoRI，HindIII，XhoI，或酵母α信號肽切割位點(KEX2酶識別位點)。
4.如權利要求1所述的製備方法，其進一步特徵在於，所述步驟③中，所述表達載體可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，包括pET32a(+)質粒，pBV220質粒，pPIC9質粒，或YESTM載體。
5.如權利要求1所述的製備方法，其進一步特徵在於，所述步驟④中，所述宿主細胞可以是原核宿主細胞，包括大腸桿菌，或枯草桿菌；也可以是真核宿主細胞，包括酵母細胞，昆蟲細胞，或哺乳動物細胞。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種Exendin－4多肽的製備方法，所述方法通過設計併合成引物，並用PCR法拼接Exendin－4基因，構建重組質粒，將其轉入宿主細胞，獲得融合表達或非融合表達Exendin－4多肽的工程菌，並發酵培養該工程菌，最後純化分離得到Exendin－4多肽。本發明的製備方法與傳統方法相比，具有降低生產成本，滿足大規模生產的優點。
文檔編號C12N15/09GK1455001SQ0211156
公開日2003年11月12日 申請日期2002年4月29日 優先權日2002年4月29日
發明者周永春, 楊武劍, 張高峽, 韓友斌 申請人:上海復星生物醫藥研究院有限公司