一種新的命名為barb的杆狀細菌及其應用的製作方法

2023-06-19 11:30:51

專利名稱：一種新的命名為barb的杆狀細菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型微生物及其用途和應用，尤其涉及一種從人的腫瘤細胞系K562細胞中分離培養得到的新菌種，該菌種具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特徵，並且與已知的假單孢菌種均有不同，暫將這一新菌種命名為BARB，即Bcr-Abl相關桿菌(BARB，Bcr-Abl associated rodbacteria)，BARB可誘導人的正常細胞和腫瘤細胞系產生Bcr-Abl融合基因。
背景技術：
1960年，Nowell和Hungerford在慢性髓系白血病(chronicmyelogenous leukemia)細胞內發現費城染色體(PhiladelphiaChromosome)1。1973年，Rowley發現費城染色體是由人的9號染色體和22號染色體之間易位形成的2。這兩個染色體的重組導致了一個新的融合基因，在9號染色體上的Abl基因的部分基因與22號染色體上的Bcr部分基因組成了Bcr-Abl融合基因3-6。該融合基因在細胞的信號傳導通路中起非常重要的作用7。在動物實驗中已證明該融合基因可導致慢性髓系白血病樣的疾病8-10。95％以上的慢性髓系白血病患者都帶有Bcr-Abl融合基因11-13，針對Bcr-Abl融合基因的藥物如Imatinib(Gleevec，STI571)可迅速緩解慢性髓系白血病14。目前普遍認為，Bcr-Abl融合基因與慢性髓系白血病的病因緊密相關。然而，Bcr-Abl的融合是怎樣產生的，目前只有非常零星的研究。如有人認為輻射可造成Bcr-Abl融合15；也有人認為染色體上的Alu序列和一些duplicon與Bcr-Abl融合有關16-17，但這些都是一些假設，並沒有嚴格的實驗證明。
本發明從人的腫瘤細胞系K562細胞中，分離培養得到BARB，即Bcr-Abl相關桿菌(BARB，Bcr-Abl associated rod bacteria，Bcr-Abl相關桿菌)，該菌屬具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特徵，研究提示BARB可導致人類細胞內9號染色體和22號染色體的染色體易位(chromosomal translocation)，這種染色體易位的結果產生了Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，這個融合基因及其編碼蛋白質就是慢性髓系白血病的Bcr-Abl融合基因及其編碼蛋白。
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(一)明內容一種具有假單孢菌屬特徵的新的細菌，命名為BARB(Bcr-Ablassociated rod bacteria，Bcr-Abl相關桿菌)，其在武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日，提議的分類命名為假單孢菌屬，Pseudomonas sp.BARB。
菌種來源所述的杆狀細菌BARB，生活在人的腫瘤細胞系K562細胞中(圖2e)，分離出BARB的方法是將人的腫瘤細胞系K562細胞(由浙江大學腫瘤研究所提供)培養在RPMI-1640完全培養液中，培養溫度為37℃，不更換培養液，培養30～60天，獲得生長的細菌BARB。可再將獲得細菌BARB用普通的LB培養液擴增，再將所述細菌BARB接種於羊血平板上使其長成集落。
BARB的生長特性BARB為非明酵菌，生長緩慢，初代培養35℃48小時以後長出細小、點狀、圓形、凸起、灰白色的菌落，不溶血，72-96小時以後菌落長到直徑2-3mm，表面乾燥並聯成一片，呈皺摺狀，整個菌落能推動，在液體培養基內，該細菌在液體表面生長，形成一層擴散的、灰白色的菌膜。能在麥康凱平板(Monc ConkeyAgar)生長，但在SS平板上不能生長。
BARB的形態為革蘭氏陰性、短小的桿菌。長時間放置後再行塗片，細菌形態變得不規則，短小的和細長的桿菌均存在。在腦心浸液液體培養基中，細菌革蘭染色呈鏈狀。直徑為0.5-1.0um，長為3um。鞭毛染色為單鞭毛，鞭毛位於菌體的一端。在電子顯微鏡下細菌的形態如短杆狀，如圖2c、圖2d所示。
BARB的生化特性細菌氧化酶陽性，觸酶試驗陽性。
採用API生化鑑定板條、ATB、Vitek-AMS及Vitek-II生化鑑定系統(法國biomerium公司)及經典的手工方法加以鑑定。用Vitek-AMS及Vitek-II均不能鑑定BARB，因為該菌生長緩慢，而這兩型儀器適合鑑定生長快速的細菌，用ATB和API生化板條鑑定BARB，結果顯示BARB與Pseudomonas diminuta相似，但符合率不到90％。將全自動微生物生化分析儀和經典微生物生化鑑定數據總結如表1。
表1.用經典微生物生化檢驗與全自動微生物生化分析儀(API20NE，RapID，andVITEK-Ams60)分析BARB表1中-表示陰性；+表示陽性；±表示在多次實驗中有陽性或陰性的結果。
綜上所敘，BARB的特徵與假單孢菌屬中的diminuta菌種非常相似，但與diminuta有三點不同，首先，BARB在液體表面生長，形成一層擴散的、灰白色的菌膜，而diminuta沒有這一特徵；其次，BARB可分解果糖，雖然比較緩慢，單diminuta不能分解果糖；最後，在BARB中檢測到尿素酶的活性，而diminuta無尿素酶的活性。因此，BARB可能為假單孢菌屬的一種新的細菌。
BARB的16S rRNA特性用細菌的16S rRNA的序列可比較精確地鑑定細菌的屬和種。將BARB的16S rRNA的PCR產物的序列與基因庫NCBI中的16S rRNA序列比對，發現與假單孢菌屬中一些菌如Pseudomonasdiminuta有91％的同源性，但不完全相同，BARB可能屬於假單孢菌屬(Pseudomonas)並與diminuta不同的一種新的杆狀細菌。BARB的16SrRNA的部分核苷酸序列如下(BARB的16S rRNA片斷1)
CGACCCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTGGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGAGTACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCT；BARB的16S rRNA的又一部分核苷酸序列如下(BARB的16S rRNA片斷2)TTCGCTGACCCTACCGTGGTCGGCTGCCTCCATTGCTGGTTAGCGCACCGCCTTCGGGTAAAGCCAACTCCCATGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGACTTTTAGGGATTAGCTCCGCTTCGCAGCATCGCAACCCTCTGTAGTCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCACCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTACCACCGGCGGTCCCATTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCCTGTCCCCGAAGGGAAAACTGGATCTCTCCAGCGATCAGGGCATGTCAAAAGGTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCCTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGTCACCGACATGCATGCATGCCGACAACTAGCACTC。
BARB對抗菌素的敏感性BARB的特徵還在於，對萬古黴素(vancomycin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、複方新諾明較敏感，而對amikacin，amoxicillin，ampicillin，aztreonam，cefaime，ticarcillin，cefoxitin，cefpodoxime，ceftaziding，chroramphenicol，gentamicin，imipenem，nitrofurantoin，norfloxacin，peperacillin，and cefoperazone等抗菌素不敏感。
BARB的功能用BARB感染人的正常細胞如臍帶血單核細胞、外周血單核細胞、和成纖維細胞和人的腫瘤細胞系如HL60和U937，一定時間後，上述細胞內就發生Bcr與Abl的融合，產生Bcr-Abl(p210Bcr-Abl)融合基因及其基因產物p210Bcr-Abl蛋白質。
所述的杆狀細菌BARB的用途，BARB的功能是能誘導人的正常細胞和人的細胞系產生Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，因此，BARB誘導人細胞內發生Bcr和Abl兩個基因融合，可作為人的細胞內染色體易位的研究模型。該模型可用於人染色體易位(chromosomal translocation)中涉及Bcr和Abl等基因融合的分子生物學、生物化學、細胞學、腫瘤學、病因學等等的研究，也可用此模型研製和開發藥物、試劑盒和試劑。特別是可用此模型製備試劑盒和試劑以篩選藥物，如本發明試驗可知BARB對萬古黴素、左氧氟沙星、複方新諾明較敏感，而對amikacin，amoxicillin，ampicillin，aztreonam，cefapime，ticarcillin，cefoxitin，cefpodoxime，ceftaziding，chroramphenicol，gentamicin，imipenem，nitrofurantoin，norfloxacin，peperacillin，and cefoperazone等抗菌素不敏感。
實施例2～實施例6實驗結果充分表明BARB能誘導人的細胞內染色體易位而造成Bcr-Abl融合。在現有技術中，沒有任何一個報導有關細菌可誘導人類細胞內Bcr-Abl融合；在此之前，沒有任何報導有關在人的K562細胞中提取和分離到細菌；BARB與人類細胞有非常良好的共生關係，這也是過去沒有任何報導的。這進一步表明BARB是人類從自然中分離的新菌種。
BARB誘導人細胞內發生Bcr和Abl兩個基因融合，這兩個基因的融合是正常細胞向白血病細胞轉化的關鍵步驟，因此，更具體的BARB可用於建立白血病的模型。用該模型研製和開發用於白血病或與白血病相關的藥物、試劑盒(包括臨床檢驗試劑盒)、試劑。
還可用杆狀細菌BARB與其它微生物或化合物組合製成相關的藥物、試劑、或試劑盒(包括臨床檢驗試劑盒)；總之可製成含有所述杆狀細菌BARB的生物製品。
本發明的有益效果體現在(1)本發明不僅從人的腫瘤細胞系K562細胞中，分離培養得到新菌種BARB，而且揭示了BARB可導致人類細胞內9號染色體和22號染色體的染色體易位(chromosomal translocation)，這種染色體易位的結果產生了Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，這個融合基因及其編碼蛋白質就是慢性髓系白血病的Bcr-Abl融合基因及其編碼蛋白，為人類進一步認識腫瘤及相關疾病提供研究基礎和模型，該模型可用於研製藥物、試劑盒、試劑。(2)可利用BARB誘導製造研究模型。(3)BARB可用於建立白血病的模型。


圖1BARB的菌落外觀照片。
圖2BARB的光學和電子顯微鏡的形態鑑定a.K562細胞的Giemsa染色，箭頭所指為杆狀細菌樣顆粒；b.K562細胞內分離提取到的細菌經過擴增後用革蘭氏染液染色，呈革蘭氏陰性；c.BARB的掃描電子顯微鏡照片；d.BARB的透射電子顯微鏡照片；e.BARB在K562細胞中的透射電鏡照片。
圖3用BARB處理人的成纖維細胞後，用PCR法檢測細胞內Bcr和Abl基因的融合。
圖4用BARB處理HL60、U937和人的臍帶血的單核細胞後，用PCR法檢測細胞內Bcr和Abl基因的融合。
圖5為PCR(a)和Western Blot(b)檢測BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細胞內Bcr-Abl融合基因和融合蛋白質-p210Bcr-Abl。
圖6為BARB處理正常人外周血後檢測細胞內的Bcr-Abl融合基因及其基因產物。
圖7為用100μm/ml萬古黴素(Vancomycin)處理BARB後，將BARB與人的臍帶血單核細胞共溫肓，然後用PCR技術檢測細胞內Bcr與Abl基因融合。可見經過100μm/ml萬古黴素處理後，BARB失去介導細胞內Bcr-Abl融合的功能。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術參數理解為對本發明的限制。
實施例1BARB的分離將K562細胞(由浙江大學腫瘤研究所提供)培養在RPMI-1640完全培養液中，不更換培養液，37℃培養30-60天，細菌生長。獲得的細菌可用普通的LB培養液擴增。將BARB接種於羊血平板上使其長成集落。
BARB的鑑定(1)BARB的菌落外觀如圖1所示，長出的菌落呈粗糙型。
(2)用革蘭氏染色將經過擴增後細菌BARB用革蘭氏染液染色，呈革蘭氏陰性(圖2b)。
(3)圖2c和圖2d為BARB在掃描和透射電子顯微鏡下照片。圖2e為BARB在K562細胞中的透射電鏡照片(4)用各種全自動微生物生化分析儀和常規生化檢驗對BARB做了詳細的分析，結果見表1，結果表明BARB具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特徵，但與所知的假單孢屬中的菌種均有不同，這說明BARB為一種新的菌種。
(5)BARB的16S rRNA的部分序列，見方案部分描述的BARB的16SrRNA的部分核苷酸序列BARB的16S rRNA片斷1，BARB的16S rRNA片斷2，與假單孢菌屬中的一些細菌有高度同源性，但不完全相同，也說明BARB為一種新的菌種。
實施例2BARB的功能鑑定(一)用BARB感染人的細胞取人的臍帶血和外周血，用Ficoll-Hypaque分離其中的單個核細胞。將細胞與BARB混合共同培養在IMDM完全培養液中，35℃培養3-7天後，用RT-PCR，Western Blot和FISH法檢測，人的臍帶血和外周血的單個核細胞內就發生Bcr與Abl的融合(見圖5，圖6)。
圖5為PCR(a)和Western Blot(b)檢測BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細胞內Bcr-Abl融合基因-p210Bcr-Abl。M，分子標記；1-10，10個健康婦女的臍帶血單核細胞；11-12，2個健康人的外周血單核細胞；-，未經BARB處理的細胞；+，BARB處理的細胞有一條292bp的PCR條帶(a)和p210Bcr-Abl蛋白條帶(b)。
圖6為BARB處理正常人外周血後檢測細胞內的Bcr-Abl融合基因及其基因產物。a，為Bcr-Abl的PCR檢測；b，為Bcr-Abl融合蛋白的Western blot檢測；c，為FISH技術檢測正常的Bcr和Abl信號；d，為FISH技術檢測Bcr-Abl融合基因。M，為分子量標記；13 14，為2個正常人外周血單核細胞；-，為未經BARB處理的細胞；+，為BARB處理的細胞。
檢測結果說明BARB可誘導人的細胞系產生Bcr-Abl融合基因。
實施例3BARB的功能鑑定(二)用BARB感染人的腫瘤細胞系HL60和U937和人的臍帶血單核細胞將細胞與BARB混合共同培養在RPMI1640完全培養液中，一定時間後，用RT-PCR法檢測，細胞內就發生Bcr與Abl的融合(見圖4)。圖4中可見，用BARB處理過的細胞有一條分子量為292bp的PCR擴增產物，而其對照沒有這一條帶。M，分子標記；UCBMC，人的臍帶血的單核細胞；-，未經BARB處理的細胞；+，用BARB處理過的細胞，292bp的PCR產物經過測序分析，確定為Bcr-Abl融合基因產物。這說明BARB可誘導人的細胞系產生Bcr-Abl融合基因。
實施例4將人的正常成纖維細胞與BARB共同培養一定時間後，可檢測到細胞內Bcr-Abl的融合基因產物，見圖3。
圖3為PCR(a)和Western Blot(b)檢測BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細胞內Bcr-Abl融合基因-p210Bcr-Abl。圖3中M表示分子標記；-表示未經BARB處理的細胞；+表示BARB處理的細胞有一條292bp的PCR產物，經過測序分析，確定為Bcr-Abl融合基因產物。
實施例5用100μm/ml萬古黴素(Vancomycin)處理BARB後，將BARB與人的臍帶血單核細胞共溫肓，然後用PCR技術檢測細胞內Bcr與Abl基因融合。可見100μm/ml萬古黴素處理後不能引起BARB介導的細胞內Bcr-Abl融合。當BARB用100μg/ml的萬古黴素處理後就失去誘導細胞內Bcr與Abl的融合的功能(見圖7)。
實施例6巢式PCR檢測BARB感染的細胞中的Bcr-Abl的融合實施例2，3，4，5中BARB感染過的細胞，1×106細胞融解於0.5mlTrizol，提取RNA。用於cDNA合成的引物為(5』-GGC AAG AGT TAC ACG TTCCTG ATC-3』)；用於巢式PCR的引物為(第一輪sense 5』-GGC AAG AGTTAC ACG TTC CTG ATC-3』，antisense 5』-GTG ATT ATA GCC TAA GACCCG GAG-3』)和(第二輪sense 5』-GGA GCT GCA GAT GCT GAC CAA C-3』，antisense 5』-GGC CAC AAA ATC ATA CAG TGC-3』).PCR的反應條件為先將模板在94℃變性，然後進行35輪PCR反應(94℃30Sec秒，58℃30秒和72℃45秒)。然後用瓊脂糖凝膠電泳分析292bp的Bcr-Abl融合基因的PCR產物。
實施例7免疫印跡法(Western Blot)法檢測BARB感染的細胞中的Bcr-Abl的融合蛋白。
取實施例2中BARB感染過的細胞，1×107細胞用細胞裂解液裂解，測定其中的蛋白質含量。210μg蛋白做SDS-PAGE電泳，然後用Santa Cruz公司的試劑做Western Blot.所用的試劑為c-Abl(鼠抗人Bcr-Abl的單克隆抗體)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG的第二抗體，化學發光試劑，以上試劑均來自美國Santa Cruz公司。
實施例8螢光原位雜交技術(FISH，fluorescent in-situhybridization)檢測細胞內Bcr-Abl融合基因取實施例2中BARB感染過的細胞，Bcr-Abl的基因探針購自美國Vysis公司，檢測細胞內的Bcr-Abl融合基因的技術流程按照美國Vysis公司的方法。Bcr，Abl，和Bcr-Abl的信號在裝有QFISH的DAPI-FITC-Texas Red三色螢光顯微鏡LEICA550QCW下俘獲。
實施例916S rRNA的PCR檢測與測序取實施例1中BARB，提取DNA，用PCR法檢測其中的16S rRNA.引物序列如下，(正向引物5』-AGA GTT TGA TCC TGG CTA G-3』反向引物5』-ACG GNT ACC TTG TTA CGA CTT-3』)。PCR的反應條件為先將模板在94℃變性，然後進行35輪PCR反應(94℃30Sec秒，52℃30秒和72℃45秒)，然後用瓊脂糖凝膠電泳分析1500bp左右的16S rRNA的PCR產物，並對此PCR產物進行測序。
序列表.seq120Title一種新的命名為BARB的杆狀細菌及其應用130AppFileReference140CurrentAppNumber141CurrentFilingDate210Sequence1211Length668212TypeDNA213OrganismNameBARB的16S rRNA1400PreSequenceStringcgaccctggcggcaggcctaatacatgcaagtcgagcggcccttcggggcagcggcggacgggtgagtaacgcgtgggaatgtgccctttggtacggaacaacacagggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaaagatttatcgccattggagcagcccgcgttggattaggtagttggtgaggtaaaggctcaccaagccgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagccatgccgcgtgaatgatgaaggtcttaggattgtaaaattctttcaccggggaagataatgacggtacccggagaagaagtcccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaattactgggcgtaaagggcgcgtaggcggatgtttaagtcgggggtgaaagcccggggctcaacctcggaattgccttcgatactggacatcttgagtacgggagaggtgagtggaactccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaagaacaccagtggcgaaggcgactcactggcccgttactgacgct210Sequence2211Length663212TypeDNA213OrganismNameBARB的16S rRNA2400PreSequenceStringttcgctgaccctaccgtggtcggctgcctccattgctggttagcgcaccgccttcgggtaaagccaactcccatggtgcgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccgaactgagacgacttttagggattagctccgcttcgcagcatcgcaaccctctgtagtcgccattgtagcacgtgtgtagcccaccccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggcttaccaccggcggtcccattagagtgcccaacttaatgatggcaactaatggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtccctgtccccgaagggaaaactggatctctccagcgatcagggcatgtcaaaaggtggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcccttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcgtcaccgacatgcatgcatgccgacaactagcactc210Sequence3211Length24212TypeDNA213OrganismName引物1400PreSequenceStringggcaagagtt acacgttcct gatc24210Sequence4211Length24212TypeDNA213OrganismName引物2400PreSequenceStringgtgattatag cctaagaccc ggag24210Sequence5211Length22212TypeDNA213OrganismName引物3400PreSequenceStringggagctgcag atgctgacca ac 22210Sequence6211Length21
序列表.seq212TypeDNA213OrganismName引物4400PreSequenceStringggccacaaaa tcatacagtg c 11210Sequence7211Length19212TypeDNA213OrganismName引物5400PreSequenceStringagagtttgat cctggctag 19210Sequence8211Length21212TypeDNA213OrganismName引物6400PreSequenceStringacggntacct tgttacgact t 1權利要求
1.一種新的命名為BARB杆狀細菌，其在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日。
2.如權利要求1所述的名為BARB的杆狀細菌，其特徵在於所述的BARB的16S rRNA的部分核苷酸序列如下CGACCCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTCGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGAGTACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCT；BARB的16S rRNA的又一部分核苷酸序列如下TTCGCTGACCCTACCGTGGTCGGCTGCCTCCATTGCTGGTTAGCGCACCGCCTTCGGGTAAAGCCAACTCCCATGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGACTTTTAGGGATTAGCTCCGCTTCGCAGCATCGCAACCCTCTGTAGTCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCACCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTACCACCGGCGGTCCCATTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCCTGTCCCCGAAGGGAAAACTGGATCTCTCCAGCGATCAGGGCATGTCAAAAGGTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCCTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGTCACCGACATGCATGCATGCCGACAACTAGCACTC。
3.如權利要求1所述的名為BARB的杆狀細菌，其特徵在於所述的BARB革蘭氏染色陰性，不溶血，菌體粗糙型，為短杆狀細菌；所述的BARB在腦心浸液液體培養基中，革蘭染色呈鏈狀，BARB的直徑為0.5～1.0μm，長為3μm，鞭毛染色為單鞭毛，鞭毛位於菌體的一端；BARB的生化試驗細菌氧化酶陽性，觸酶試驗陽性，經典的微生物生化檢驗說明其具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特徵。
4.如權利要求1所述的名為BARB的杆狀細菌，其特徵在於將BARB感染人的腫瘤細胞系如HL60和U937和人的正常細胞如人的臍帶血單核細胞和外周血單核細胞等，一定時間後，細胞內就發生Bcr與Abl的融合，產生Bcr-Abl(p210Bcr-Abl)融合基因及其基因產物p210Bcr-Abl蛋白質。
5.一種如權利要求1所述的杆狀細菌BARB的用途，其特徵在於所述的BARB用於誘導人體染色體易位，人的正常細胞和人的細胞系產生Bcr-Abl融合基因，可作為人的細胞內染色體易位的研究模型。
6.如權利要求5所述的杆狀細菌BARB的用途，其特徵在於所述研究模型為可用於白血病研究的模型。
7.如權利要求5所述的杆狀細菌BARB的用途，其特徵在於所述研究模型在藥物研究和開發中的應用。
8.如權利要求7所述的杆狀細菌BARB的用途，其特徵在於所述的研究模型在藥物篩選中的應用。
9.如權利要求5所述的杆狀細菌BARB的用途，其特徵在於所述的研究模型在試劑及試劑盒中的應用。
10.一種含有如權利要求1所述杆狀細菌BARB的生物製品。
全文摘要
本發明涉及一種新型微生物及其用途和應用，尤其涉及一種從人的腫瘤細胞系K562細胞中分離培養得到的新菌種，在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日。該菌種具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特徵，並且與已知的假單孢菌種均有不同，暫將這一新菌種命名為BARB，即Bcr－Abl相關桿菌(BARB，Bcr－Abl associated rod bacteria)，BARB可誘導人的正常細胞和腫瘤細胞系產生Bcr－Abl融合基因。這個融合基因及其編碼蛋白質就是慢性髓系白血病的Bcr－Abl融合基因及其編碼蛋白，為人類進一步認識腫瘤及相關疾病提供研究基礎和模型，該模型可用於研製藥物、試劑盒、試劑，可利用BARB誘導製造研究模型。
文檔編號A61K35/66GK1737113SQ20041001606
公開日2006年2月22日 申請日期2004年1月21日 優先權日2004年1月21日
發明者胡汛 申請人:胡汛