使用超聲誘導的報導分子構建體轉染的體內表達分析的製作方法

2023-06-19 16:46:26

專利名稱：使用超聲誘導的報導分子構建體轉染的體內表達分析的製作方法
使用超聲誘導的報導分子構建體轉染的體內表達分析 發明領域
學和化學領域中，更特別地在診斷學領域中。本發明特別涉及體內表達 分析。
背景技術：
基因調節的研究是生物科學的急速增長的學科。很長時間以來已了
解基因(編碼和非編碼)轉錄成RNAs在大多數情況下受緊在編碼區5， (或"上遊")的非編碼調節區控制。DNA的這些非編碼序列包含決定其 中基因在生物的壽命過程中表達的條件(何時、何地和在何種外部刺激 下)的序列模式。這些非編碼序列由轉錄因子(其依賴於其功能通常稱 為增強子或阻遏物)結合，所述轉錄因子隨後募集後生調節物和其它蛋 白，它們形成較大複合物且對靶轉錄物的表達施加控制。理解基因調節 的機制是理解疾病進展以及來自對最複雜的生物過程最基礎的一切的 基礎。
經過數年，已設計了許多方法以研究在調節和表達水平上的基因表 達。在個體水平上，基因表達通常使用稱為逆轉錄酶聚合酶鏈反應
(RT-PCR)的技術非常可靠地進行測量。為了平行測定數千種基因的 表達分析，已採用諸如微陣列、基因表達系列分析(SAGE)和大量平 行標記測序(MPSS)的技術。為了推斷基因表達的模式，已開發了許 多方法以統計分衝斤。
缺點是所有這些方法要求包含目的RNAs的組織或細胞的物理分離 和破壞。這使得基因表達的研究變得昂貴和勞力密集。研究隨時間的基 因表達是特別複雜的，因為需要獲得許多樣品且使樣品中的所有細胞的 基因表達同步。最重要的是當樣品用各種試劑進行處理時，不能避免使 細胞"休克"，這使表達模式不正常。因此將希望手中具有體內表達分析 系統。然而，以無側面介導的表達發生的方式將表達系統帶進器官或甚 至組織內也是問題，這必須應對以直接和有效方式轉染所述載體的問 題。因此，還需要關於與此種表達分析系統組合的實際和有效的載體送 遞方法。通過常規注射針方法的載體注射的主要問題是載體材料必須大 量注入耙位點內，這是由於將載體材料擴散到細胞的核內的嘗試的無效 率和酶系統立即移動以破壞注入的載體核酸分子的問題。例如，使用注
射針的治療注射技術已相對緩慢地進展。
例如，陽離子脂質體已廣泛用於體內基因轉移到內皮細胞內
(Brigham， K.B.等人(1989 ) Am. J. Med. Sci. 298, 278-281; Hofland, H.E丄等人(1997) , Pharm. Res. 14， 742-749; Liu, F.等人(1997), Gene Therapy 4, 517-523; Mahato, R. I.等人(1998) , Hum. Gene. Ther. 9, 2083-2099; Rolland, A. P. ( 1998 ) , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15,1 43-198)。由於缺乏靶細胞特異性和低體內基 因轉移效率，目前基於陽離子脂質體的系統用於靶向腫瘤內皮的用途是 有限的(Lesoon-Wood, L.A.爭乂( 1995 ), Hum. Gene. Ther. 6, 395-405; Anwer等人(Human gene Therapy, 提交的))。
已提出通過共價綴合單克隆抗體或其它靶向部分(例如，特異性肽 和脂質)修飾脂質體表面，以改善肺瘤特異性基因送遞(BouIikas， T.
(1996 ) ， Int. J. Oncol. 9， 941-954; Kong, H丄.和Crystal, R.G. ( 1998 ), J. Natl. Cancer Inst. 90,273-286; Pietersz, G.A.和McKenzie， I.F.C.( 1992 ), Immunol. Rev. 129, 57-80; Thorpe, P.E.和Derbyshire, EJ. ( 1997), J. Cont. Release 48, 277-288; Kircheis, R.等人(1997) , Gene Therapy 4， 409-418 )。
機械法例如電穿孔和噴射注射已描述為增強靶組織中的基因轉移 的有用外部方法(Gallo, S.A.等人(1997) ， Biophys. J. 72, 2805-2811 )。
超聲介導的送遞具有作為用於將治療化合物增強且靶向施用到細 胞和組織內以及經過細胞和組織施用的有效新方法的潛力。超聲增強的 對細胞的送遞已通過將細胞外液、藥物和DNA攝取到細胞內在體外得 到證實(Lm, J.爭乂( 1998 ) ， Pharm. Res. 15, 918-924; Mitragotri，等 人(1996) , Pharm. Res. 13, 411-420; Wyber, J.A.等人(1997) , Pharm. Res. 14, 750-756; Tata, D.B.，爭乂 ( 1997) ， Biochem. Biophys. Res. Commun. 234， 64-67)。
發明概述
6數據證實用於表達分析的組合物的超聲送遞使得能夠在不存在外源效 應子物質的情況下以及在提供外源效應子物質後在體內分析基因表達， 所述組合物包含孩￡泡以及哺乳動物表達載體系統，所述外源效應子物質 例如致熱原、藥物化合物、藥物前導化合物、變應原、自身免疫原、毒 素、多克隆抗體、單克隆抗體、抗原、脂質、碳水化合物、肽、蛋白、
蛋白-複合物、胺基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA 和擺i小RNA。
本發明涉及用於特異性查詢"X"的表達分析的組合物，其包含(a) 包含封裝遺傳有效負載或與遺傳有效負載締合的微泡的載體，(b)包 含下述的遺傳有效負載(i)處於將確保在體內的組成型表達的啟動子 控制下的螢光報導基因，(ii)處於非組成型表達的啟動子控制下的第 二螢光報導基因，(v)第一螢光報導基因的啟動子和(vi)在"X"的體 內狀態下條件激活的第二螢光報導基因的啟動子，(c)與微泡載體相 互作用的超聲裝置，以便釋放有效負載、和/或增強其經由細胞的4聶取、 和/或增強其在細胞中的表達，和(d)對第一和第二報導基因的表達水 平定量，並且由結果推斷關於查詢"X"的相關回答的讀出裝置或方法。
因為所述詢問對動物或患者實施最低限度水平的創傷，所以 一旦遺 傳有效負載從靶組織或細胞中消失(一般為數天)，就可以重複表達分 析。如果超聲裝置可以局部觸發微泡載體，那麼查詢"X"可以幾乎立即 在先前未詢問的相似組織或細胞中重複。任一方式，暫時可重複性是本 發明的獨特益處。
因為遺傳有效負載的表達可以用超聲裝置在大多數動物抹和物種 的大多數軟組織中激活，所以可以執行表達分析而不局限於特別地遺傳 工程化的動物。對於大多數動物的基本上通用的可應用性是本發明的另 一個獨特益處。
如本文所使用的，術語"微泡"指平均尺寸小於10 pm ( 1-3 pm是最 典型的)的乳化的穩定化泡。特別的氣體， 一般是高分子量的惰性氣體 例如0^10和SF6封裝在這些泡中，以使體內穩定性增至數分鐘到數小 時級別。泡殼由脂質、多糖、白蛋白或其它聚合物製成。特定製造步驟 和增強，阻止了泡的聚集(簇集)和融合(合併)。此外，通過使聚乙 二醇(PEG)或其它生物學"隱蔽"分子附著於殼，使泡成為非免疫原性
7的。幾種診斷產物目前用於心臟、放射學和腫瘤學背景中的超聲成像。 使分子配體與這些泡附著用於分子成像，目前在研究階段中。封裝、附 著或締合治療分子，包括常規藥物和遺傳物質也作為新方法進行研究， 以送遞局部幹預同時使全身副作用降到最低。
如本文所使用的，術語"表達載體系統"指由遺傳物質(即，核酸) 構成的構建體。它包括這樣排列的遺傳元件，即，使得插入的編碼序列 可以在真核細胞中轉錄。同樣，儘管質粒可以包括來自病毒核酸的序列， <旦此種病毒序列優選不引起質粒^參入病毒顆粒內，並且質粒因此是非病
毒載體。優選地，此種載體是閉合環狀DNA分子。如本文所使用的， 表達載體指包含設計用於直接轉化粑細胞的遺傳物質的構建體。它優選 包含鄰接的DNA或RNA片段，所述片段與其它必需元件定位且順次定 向，使得核酸可以在轉染的細胞中轉錄並且必要時翻譯。
如本文所使用的，術語"轉染促進劑"指與上文描述的載體形成複合 物的試劑。這種分子複合物以共價或非共價方式與載體分子締合。轉染 促進劑應能夠以穩定狀態轉運核酸分子並且將結合的核酸分子釋放到 細胞內。此外，轉染促進劑可以阻止核酸分子經由胞內體裂解的溶酶體
至核膜且進入核內，並且提供保護作用。
在一個實施方案中，轉染促進劑是非縮合聚合物、油和表面活性劑。 已發現非縮合聚合物特別適合於注入所需表達位點內例如在瘤內施用 中。當表達載體需要延長定位時，這些可能適合於使用。在某些情況下， 具有例如根據本發明的表達載體的持續釋放可能是有用的。因此，下述 化合物中的某些可能在本發明的上下文中是有用的聚乙烯吡咯烷酮； 聚乙烯醇；丙二醇；聚乙二醇；聚乙酸乙烯酯；泊洛沙姆(Pluromcs) (環氧丙烷和環氧乙烷的嵌段共聚物，兩種亞單位的相對量在不同泊洛 沙姆中可能不同)；泊洛沙胺(poloxammes ) ( Tetromcs );乙烯乙酸 乙烯酯；纖維素，包括羧甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥 丙基曱基纖維素的鹽；透明質酸鹽；海藻酸鹽；雜多糖(果膠)；磷脂 醯膽鹼(卵磷脂)；miglyols;聚乳酸；聚羥基丁酸。
在另一個實施方案中，陽離子縮合劑例如陽離子脂質、肽或脂肽， 或例如右旋糖普、殼聚糖、樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺(PEI)或聚賴 氨酸，可以與本發明的載體締合，並且可以促進轉染和與超聲靶-微泡破壞結合。
化合物(PINC),並且其它的是持續釋放化合物，同時某些可以以任一方式在分別合適的條件下使用。
PINC增強核酸分子，即本發明的載體對哺乳動物細胞的體內送遞，
並且優選地，核酸分子，即載體包括編碼序列，如將在下文對於待在所述細胞中表達的基因產物的啟動子更詳細地概述的。
根據本發明的表達載體還可以與由 一種或多種陽離子脂質形成的
脂質體複合。優選地，陽離子脂質是DOTMA,並且中性輔脂質是膽固醇(chol) 。 DOTMA是1,2-二-0-十八烯基-3-三甲銨丙烷，這在於1990年1月30日授權的Eppstem等人，美國專利4,897,355中描述且討論，所述專利引入本文作為參考。然而，其它脂質和脂質組合也可以在其它實施方案中4吏用。各種此種脂質在Gao和Huang, 1995, 7T^ra/7z;y2: 710-722中描述，所述參考文獻在此引入作為參考。
因為陽離子脂質和DNA的電荷比也是重要因素，所以在優選實施方案中，DNA和陽離子脂質以使得負和正電荷比是約1: 3的量存在。因此，優選地，組合物的電荷比是約l: 1至1: 10,更優選約1: 2至1: 5。
術語"陽離子脂質，，指在生理學pH下具有淨正電荷，並且優選在此種pH下不攜帶負電荷的脂質。此種脂質的 一 個例子是D O TMA 。
如本文所使用的，術語"聲致穿孔(sonoporation)裝置，，涉及能夠通過超聲工具引起核酸分子，即本發明的載體攝入生物的細胞內的儀器。細胞膜因此可以失穩定並且導致在細胞膜中形成通道或孔。聲致穿孔裝置類型不視為本發明的限制方面。聲致穿孔裝置的主要重要性事實上是該裝置將配製的核酸分子，即本發明的載體送遞到生物的細胞內的能力。
如本文所使用的，術語"生物，，指本領域普通技術人員的通常使用。生物可以包括微生物例如酵母或細菌、植物、鳥類、爬行動物、魚類或哺乳動物。生物可以是伴侶動物或馴養動物。優選地，生物是哺乳動物。優選的哺乳動物包括小鼠、大鼠、黑猩猩、犬和在臨床研究中使用的其它哺乳動物。
本發明的表達載體在人類中的使用將依賴於它的診斷或治療應用是否是可能的。術語"螢光報導基因，，指能夠表達這樣的蛋白的基因，所述蛋白用必需波長激發時，能夠發螢光或產生光。
為了本發明的目的，螢光報導基因可以是產生這樣的蛋白的任何基因，所述蛋白用合適的波長激發時，導致發出可以檢測出的光信號。在
一個優選實施方案中，來自本發明的螢光蛋白的發射譜為445-660 nm、550-660 nm,並且最優選550-660謹。
此外，在一個優選實施方案中，本發明的螢光蛋白具有高於0.10、優選高於0.20、更優選高於0.40、最優選高於0.50且最優選高於0.60的量子產額。由於更佳的體內結果，量子產額以及550-660 nm的發射譜已在本發明中顯示具有極大優點。
術語"哺乳動物複製起點"、"細菌複製起點"、"啟動子，，以及"遍在"表達的，在本文中指本領域普通技術人員的通常使用。
附圖簡述
附圖顯示本發明的原理(圖1 )以及它的一個優選實施方案(圖2)。實施方案詳述
本發明人已令人驚訝地發現通過使用用於表達分析的組合物，可以執行體內表達分析，所述組合物包含(a)微泡，(b)包含下述成分的哺乳動物表達載體系統(i)處於將確保在體內的組成型表達的啟動子控制下的第一焚光報導基因，(ii)處於非組成型表達的啟動子控制下的第二螢光報導基因，(in)哺乳動物複製起點，(iv)細菌複製起點，(v)第一螢光報導基因的啟動子，和(vi)可激活且無遍在表達的第二螢光報導基因的啟動子。在一個優選實施方案中，哺乳動物載體系統包含一種或多種另外的焚光報導基因，其處於非組成型表達的啟動子控制下。
在一個優選實施方案中，所述第二或另外的螢光報導基因的啟動子來源於本發明的表達載體系統穿梭到其內的生物。
進一步地，優選一種或多種另外的螢光報導基因處於非組成型表達的啟動子控制下。
例如，啟動子可以來源於激素基因、細胞因子基因、胰島素基因、白介素基因、促生長素基因、促紅細胞生成素基因、幹擾素基因，特別是促紅細胞生成素-a、幹擾素-y、幹擾素-a以及來自粒細胞巨噬細胞刺 激因子(GM-CSF)的促紅細胞生成素-a。千擾素、纖溶酶基因激活物、 葡糖腦苷脂酶基因、降釣素基因、生長因子基因、參與甲/乙/丙/丁/戊型 肝炎的基因以及參與例如人疾病的任何其它基因。例如，啟動子可以來 源於參與癌症發展的基因。此種基因可以是例如細胞周期控制基因、腫 瘤抑制基因、參與凋亡的基因等。
本發明人已發現通過在第二或另外的啟動子在載體系統上的表達 位點處將此表達載體系統帶進組織內，首次能夠解決例如在基因表達方 面的體內藥物開發問題。
在一個優選實施方案中，第一螢光報導基因選自編碼綠色螢光蛋 白、藍色螢光蛋白、青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、去 穩定的綠色螢光蛋白的基因。第二或另外的螢光報導基因選自編碼綠色 螢光蛋白、藍色螢光蛋白、青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋 白和去穩定的綠色螢光蛋白的基因。
在一個優選實施方案中，第一螢光報導基因的啟動子選自巨細胞病 毒啟動子(CMV) 、 CMV-正、編碼轉錄啟動子LTR的HIV-1長末端重 復序列(LTR) 、 SV40IE、 HSVtk、卩-肌動蛋白、人珠蛋白ct、人珠蛋 白卩和人珠蛋白y啟動子。
在一個優選實施方案中，微泡介質包含選自游離氣泡、穩定化的氣 泡、膠體懸浮液、乳狀液和水溶液的介質。
在一個優選實施方案中，微泡介質是包含十二氟代戊烷的膠體懸浮液。
在一個特別優選的實施方案中，微泡介質是包含超聲處理的白蛋白 的水溶液。
如上所述，本發明的綠色螢光蛋白可以是綠色螢光蛋白、藍色螢光 蛋白、青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、橙色和紅色螢光蛋白中的任何。 其它螢光蛋白也是可能的。然而，某些螢光蛋白是優選的。
在選擇綠色螢光蛋白的情況下，它優選選自EGFG、 AcGFP、 TurboGFP、 Emerald 、 Azani Green和ZsGreen。
在選一奪藍色螢光蛋白的情況下，它優選選自EBFP、 Sapphire和 T-Sapphire。
選擇青色螢光蛋白，可以從ECFP 、 mCFP 、 Cerulean 、 CyPet、 amCyan 1 、Midori畫Ishi Cyan和mTFPl (Teal)中選擇蛋白。
還可以選擇黃色螢光蛋白，在這種情況下，可以從EYFP、 Topaz、Venus、 mCitrine、 Ypet、 PhiYFP、 ZsYellol和mBanana中選擇蛋白。
當選擇橙色或紅色螢光蛋白時，優選地，蛋白選自Orange 、 mOrange、dTomato、 dTomato-Tandem、 DsRed、 DsREd2、 DsRed-Expresss ( Tl )、DSRed-Monomer、 mTangerine、 mStrawberry、 AsRed2、 mRFPl、 Jred、mCherry、 HcRedl、 mRaspbeny、 HcRed-Tandem、 mPlum禾口 AQ143。
螢光蛋白的選擇顯示於表1中。炎^f
最大激最大發
蛋白摩爾消光系量子產體內結相對亮度
發射
(簡稱)數額構(EGFP % )
(nm)(nm )
GFP ( wt)395/47550921,0000.77單體*48
綠色螢光蛋白
EGFP48450756,0000.60單體*100
AcGFP48050550,0000.55單體*82
TurboGFP48250270,0000.53單體*110
Emerald48750957,5000.68單體*116
Azmni Green49250555，000.74單體121
ZsGresn49350543,0000.91四聚體117
藍色螢光蛋白
EBFP38344529,0000.31單體*27
Sapphire39951129,0000.64單體*55
T-Sapphire39951144,0000.60單體*79
青色螢光蛋白
ECFP43947632，5000.40單體*39
mCFP43347532,5000.40單體39
Cerulean43347543,0000.62單體*79
12CyPet 435
AmCyanl 458
Midoriishi Cyan 472
黃色螢光蛋白
EYFP 514
Topaz 514
Venus 515
mCitrine 516
YPet 517
PhiYFP 525
Zs Yellow 1 529
mBanana 540
橙色和紅色螢光蛋白
Kusabira Orange 548
mOrange 548
dTomato 554
dTomato-Tandem 554
DsRed 558
DsRed2 563
DsRed-Express ( Tl ) 555
DsRed-Monomer 556
mTangerine 568
mStrawberry 574
AsRed2 576
mRFPl 584
JRed 584
mCherry 587
HcRedl 588
477 35,000 489 44,000 495 27,300
0.51 單體* 53 0.24 四聚體31 O.卯 二聚體73
527
527
528
529
530 537 539 553
559 562 581
581
583
582
584 586
585 596 592 607 610 610 618
83,400
94,500
92，200
77,000
104,000
124,000
20,200
6,000
51,600
71,000
69,000
138,000
75,000
43,800
38,000
35,000
38,000
90,000
56，200
50,000
44，00
72,000
20,000
0.61 0.60 0.57 0.76 0.77 0.39 0.42 0.7
0-60 0.69 0.69 0.69 0.79 0.55 0.51 0.10 0.30 0.29 0.05 0.25 0.20 0.22 0.015
單體* 單體*
單體*
單體
單體*
單體*
四聚體
單體
單體
單體
二聚體
單體
四聚體
四聚體
四聚體
單體
單體
單體
四聚體
單體
二聚體
單體
二聚體
151 169 156 174 238 144
25 13
92
146
142
283
176
72
58
10
34
78
8
37
26 47 1
13mRaspberry59862586,0000.15單體38
HcRed-Tandem590637160,0000.04單體19
mPlum柳649,41,0000.10單體12
AQ143595655卯,OOO0.04四聚體11
在一個優選實施方案中，本發明的組合物包含編碼兩種或更多螢光
蛋白的兩種或更多基因，並且這些蛋白發出相差至少20nm、 30nm、 40 nm、 50nm、 60 nm、 70 nm或優選80 nm或更多的發射謙。理想地，當 使用兩種或更多螢光蛋白時，以使得發射譜不重疊的方式執行蛋白的選 擇。因此，在一個優選實施方案中，當使用例如3種螢光蛋白時，3種 蛋白各自的發射譜分開至少20 nm、優選30nm或更多。明顯地，當使 用4種或更多螢光蛋白時，由於具有有限量的發射譜的可用蛋白的數目， 僅能夠具有可能20nm、 30 nm或40 nm的分離。然而，當使用僅兩種 螢光蛋白時，可以使蛋白分開例如80nm的發射譜。
同時，編碼兩種或更多螢光蛋白的兩種或更多基因編碼以下螢光蛋 白是重要的，所迷蛋白顯示出60%、 80%、 100%、 120%、 160%、 180 %或優選更多的相對亮度，所述相對亮度是以增強型綠色螢光蛋白 (EGFP)的百分比表示的。因此，本發明人已發現儘管兩種或更多螢光 蛋白的發射譜分離是重要的，但選擇的螢光蛋白顯示出使得能夠在體內 使用的相對亮度同樣是重要的。
在本發明的一個方面，本發明涉及組合物，其中組合物另外包含選 自轉染促進劑的物質。
在一個優選實施方案中，本發明的組合物具有已封裝哺乳動物表達 載體系統的微泡。在任何情況下，在其應用於生物前必須已封裝哺乳動 物表達載體系統。
本發明還涉及用於體內表達分析的方法，其包括以下步驟(a) 提供本發明的組合物，(b)將(a)的組合物應用於生物、目的組織或 器官，(c)步驟(b)的組合物在目的組織或器官位點處用聲致穿孔裝 置的超聲靶微泡破壞，(d)通過應用光源激發由兩種或更多報導基因 編碼的兩種或更多蛋白中的至少一種，其中光源發出具有與兩種或更多
14螢光蛋白的激發範圍或優選最大激發相應的波長的光，(e)第一螢光
報導基因的表達的檢測，(f )第二或另外的螢光報導基因的表達的檢測， 和任選地(g)重複步驟(d)至(f)。
在根據本發明用於體內表達分析的方法的一個優選實施方案中，該
方法另外包括以下步驟(a)在步驟(d)至(f)的第一次重複前將潛 在的效應子物質應用於生物，其中所述效應子物質被認為可能誘導第二 或另外的報導基因的轉錄。在本發明的這個實施方案中，首次可能在應 用潛在的效應子物質後在體內分析生物的表達反應。顯而易見的是，此 種物質可以例如是藥物化合物或藥物前導化合物。因此，在本發明的這 個應用中，可以測試例如給定藥物候選物的有毒副作用。將例如具有表 達載體系統，其具有目的免疫學基因的啟動子，所述基因已知產生有毒 副作用，例如某些白介素或細胞因子，其當表達時，導致嚴重的免疫學 副作用。隨後，將應用作為效應子物質的藥物候選物，並且在體內測試 第二或另外的報導基因是否被誘導且因而導致光發射，所述報導基因處 於白介素或細胞因子啟動子控制下。因此，本發明首次允許在待分析藥 物前導化合物的有毒副作用的情況下的體內表達分析。
然而，在一個優選實施方案中，可以選擇眾多不同的效應子物質。 因此，這些可以選自例如致熱原、藥物化合物、藥物前導化合物、過每文 原、自身免疫原、毒素、多克隆抗體、單克隆抗體、抗原、脂質、碳水 化合物、肽、蛋白、蛋白複合物、胺基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA和孩i小RNA。
在一個進一步的實施方案中，本發明涉及本發明的組合物用於診斷 和/或治療的用途。本發明還涉及包含根據本發明的組合物的試劑盒。
在一個實施方案中，本發明涉及用於體內表達分析的方法，其包括 步驟提供根據本發明的組合物，將(a)的組合物應用於生物、目的 組織或器官，步驟(b)的組合物在目的組織或器官位點處用聲致穿孔 裝置的超聲耙微泡破壞，通過應用光源激發由兩種或更多報導基因編碼 的兩種或更多蛋白中的至少一種，其中光源發出具有與兩種或更多螢光 蛋白的激發範圍或優選最大激發相應的波長的光，第 一螢光報導基因的 表達的檢測，第二或另外的螢光報導基因的表達的檢測，其中第二螢光 報導基因的啟動子是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的啟動子。實施例
II型糖尿病胰島素抗性
II型糖尿病胰島素抗性引起血液中的葡萄糖水平變得異常高。這因 為胰島素信號傳遞途徑受損而發生；功能性胰島素信號傳遞正常地將導
致血糖水平的穩定。在n型糖尿病中，起因於進食的增加的胰島素水平 無法觸發胰島素信號傳遞途徑。胰島素生產其自身減少也是可能的。在 任一情況下，儘管近期消化的食物的葡萄糖很豐富的事實，這種失敗允 許肝和脂肪組織的細胞持續將脂質和糖原轉儲存換成葡萄糖。這是異常 高的血糖水平是如何達到的。因此，感興趣的將是鑑定在肝和脂肪組織 中減少糖原和脂質轉換成葡萄糖的化合物。
許多途徑在細胞代謝調節中起作用。與胰島素信號傳遞直接連接的
佔優勢途徑是PI3K/Akt途徑。這個途徑直接調節稱為FOXO的轉錄因 子家族的活性。當胰島素水平在健康個體中很低時，PI3K途徑被滅活。 這種滅活允許轉錄因子FOXO家族定位至核，並且調節參與代謝和其它 過程的各種耙基因。這些耙基因中的許多促進碳水化合物和脂質分解成 葡萄糖。這些粑基因之一，即磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)主要通 過FOXO家族成員FOXOl上調。儘管可以選^^其它基因，^f旦經由通過 FOXO1調節與胰島素信號傳遞級聯的這種關聯和這種基因直接參與代 謝，使得PEPCK成為功能性胰島素途徑活性特別有用的"報導分子"。 當胰島素信號傳遞活性高時，PEPCK表達被阻遏，當胰島素信號活性低 時，PEPCK表達被激活。
報導分子構建
任何合適的哺乳動物表達載體可以用作"骨架"用於報導分子構建。 最低限度，這種載體必須與可選細菌標記一起複製。合適骨架的例子將 是商購可得的。例如可從Promega獲得的phRG-B或pCAT⑧3-Basic。
使用標準基因工程技術，修飾所選擇的骨架以包含4種必需元素。 A)用作對照的螢光報導分子。這是將組成型表達且充當成功轉染的可 見標記的報導分子。B)將處於在研究中的啟動子或調節區控制下的熒 光報導分子。C)將驅動組成型表達的螢光報導分子的表達的啟動子。 克隆在組成型表達的啟動子的上遊。D)在研究中的、克隆在螢光報導 分子上遊的啟動子或調節區，其選作實驗輸出。理想地，對照螢光報導分子應是螢光報導分子的穩定、長壽變體， 其具有顯著不同於用於研究的報導分子的激發和發射光譜。 一個例子是
商購可得的.來自 Clontech的 DsRed Monomer (可在載體 pDsRed-Monomer中獲得)。"研究"報導分子的選擇可以依賴於除光鐠 性質外的許多因素。因為本文的主要應用是基因表達的測量，所以去穩 定的螢光蛋白是優選的。這將顯著增加更新速度，這將允許更敏感檢測 影響表達的調節轉變。然而，更新速度不能太高，以至於可檢測水平的 螢光無法累積——可檢測通過成像儀器的靈敏度和通過超聲達到的轉 染效率限定。 一種合適的蛋白是在美國專利6,306,600中描述並且在載 體pZsGreenl-DR中從Clontech商購可得的去穩定的GFP。用於組成型 表達的報導分子的啟動子的選擇也是重要的，並且將控制通過對照報導 分子達到的表達水平。理想地，這種啟動子應在研究中的生物的組織中 遍在表達，並且一般以^氐和穩定的水平表達。表達在本文中應充分調整 以提供成功轉染的細胞的可靠檢測。對於強表達，可以使用遍在表達的 CMV啟動子。對於更適度的表達，可能是具有非常穩定、適度和遍在 表達的啟動子p-肌動蛋白或某些其它基因。在這個具體實施方案中，"研 究"啟動子或目的調節區是PEPCK的啟動子。
隨後/人細菌宿主中純化質粒，與超聲"泡"偶耳關，位點注入耙組織內 並且通過應用合適的超聲頻率轉染。
超聲轉染
超聲增強的基因轉染涉及4種組分(1)微泡製備，(2)使微泡 與上述DNA構建體組合的設備，(3 )將DNA拔i泡組合注入動物內的 設備(其可以僅僅是注射器)，(4)激活轉染的超聲裝置。
同時成像特別是超聲成像已顯示提供轉染區的精確放置且指導用 於轉染的超聲參數設置。關鍵技術挑戰是達到靶區中的高轉染率且使副 作用降到最低，所述副作用例如殺死或損傷細胞和非特異性轉染。因為 轉染率和細胞殺死隨著超聲暴露而增加，所以小心的設置強度對於成功
是關鍵的。某些技術例如泡破壞的動態成像可能提供關於超聲強度的精 確控制的反饋。
在器官內的特定類型細胞的選擇性轉染可能是希望的。在某些情況 下，如果針對特定細胞類型的配體是可獲得的，那麼可以達到這點。在一個優選實施方案中， 一定量的配體(一般是抗體)可以與微泡的表面 綴合。當給予充分的時間時，微泡與所需細胞類型選擇性結合，增強對 於相關細胞群體的轉染率。
轉染的基因的相互作用
在轉染和允許合適的控制時間，例如dsRed表達和螢光發生後，可 以執行成像以評估轉染效率和定位。如果這是令人滿意的，那麼可以執 行化合物、基因治療技術或任何其它治療的評估。在這種具體情況下， 多隻小鼠(例如，疾病才莫型和對照小鼠)已以上述方式用PEPCK淨艮道 分子構建體進行超聲轉染。每隻小鼠接受不同化合物或化合物和治療的 組合。對於這些小鼠中的每一隻，通過焚光成像監控通過去穩定形式的 GFP產生的螢光強度。在這個研究中，目的化合物或治療導致GFP螢光 在肝、脂肪組織或兩者中的猝滅。焚光隨時間的減少與PEPCK啟動子 活性相關，表明已鑑定了在體內在目的組織中可能減弱脂質和糖原不受 控制地代謝為葡萄糖的化合物、治療或因素組合。化合物事實上可能不 一定影響PI3K/Akt途徑或FOXO功能性。它們可能影響特異性影響 PEPCK啟動子調節的平行途徑或其它細胞組分。更一^fe地，鑑定的因素 可能影響也將產生對PEPCK報導分子活性的影響的轉錄或翻譯過程。
螢光成像
GFP在化學和光化學上都是非常穩定和有彈性的螢光團。由於內源 自體螢光，使用螢光蛋白用於讀出基因表達不是直接的。為了解決自體 螢光的問題，重要的是不具有其可能來源。存在可能引起自體螢光的各 種物質，例如黃素、NADH、脂褐質、膠原、木質素和其它。 一般地， 我們使用濾波器以挑選出其中GFP可以激發，並且用大於如上所述分子 的自體螢光的效率傳送它的螢光的光譜區域。
增強的藍色、青色、綠色、黃色和DsRed蛋白的激發和發射光譜是 廣泛不同的。通過用藍光(Imax = 470 nm )照射分子容易地誘導來自 GFP (Imax = 508-515 nm)的亮綠色螢光發射。
本領域已知的標準技術之 一 例如光漂白或光轉換用於去除自體螢光。
在成像和測定最佳萸光團的整個過程中，我們考慮了決定支持系統的使用，其考慮超聲和成像裝置以及報導分子構建體，以便在整個研究 設置過程中提供更容易的指導和監控。


圖1顯示了本發明的原理。
圖2為了測定針對1型糖尿病的實驗治療"T"是否對"A"和"B"型動 物都有效，"查詢"啟動子是胰島素依賴性啟動子。
權利要求
1.用於表達分析的組合物，其包含，a.微泡，b.哺乳動物表達載體系統，其包含，i.處於將確保在體內的組成型表達的啟動子控制下的第一螢光報導基因，ii處於非組成型表達的啟動子控制下的第二螢光報導基因，iii.哺乳動物複製起點，iv.細菌複製起點，v.所述第一螢光報導基因的啟動子，和vi.可激活且遍在表達的所述第二螢光報導基因的啟動子。
2. 根據權利要求1的組合物，其中所述哺乳動物載體系統包含一種 或多種另外的螢光報導基因，其處於非組成型表達的啟動子控制下。
3. 根據權利要求1或2的組合物，其中i. 所述第一螢光報導基因選自編碼綠色螢光蛋白、藍色螢光蛋白、 青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、去穩定的綠色螢光蛋白 的基因，ii. 所述第二或另外的螢光報導基因選自編碼綠色螢光蛋白、藍色 螢光蛋白、青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、去穩定的綠 色螢光蛋白的基因，iii. 所述第 一螢光報導基因的啟動子選自巨細胞病毒啟動子 (CMV) 、 CMV-IE、編碼轉錄啟動子LTR的HIV-1長末端重複序列 (LTR) 、 SV40正、HSVtk、 P-肌動蛋白、人珠蛋白a、人珠蛋白p和人i朱蛋白Y啟動子，和iv. 所述微泡介質包含選自游離氣泡、穩定化的氣泡、膠體懸浮液、 乳狀液和水溶液的介質。
4. 根據權利要求3的組合物，其中所述微泡介質是包含十二氟代戊 烷的膠體懸浮液。
5. 根據權利要求3的組合物，其中所述微泡介質是包含超聲處理的 白蛋白的水溶液。
6. 根據權利要求3-5的組合物，其中a.所述綠色焚光蛋白選自EGFG、 AcGFP、 TurboGFP、 Emerald、Azani Green禾口 ZsGreen,b. 所述藍色螢光蛋白選自EBFP、 Sapphire和T-Sapphire,c. 所述青色焚光蛋白選自ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、 Midon-Ishi Cyan和mTFPl (Teal),d. 所述黃色螢光蛋白選自EYFP、 Topaz、 Venus、 mCitrine、 Ypet、 PhiYFP、 ZsYellowl和mBanana,e. 所述才登色和紅色螢光蛋白選自Kusabira Orange 、 mOrange 、 dTomato、 dTomato國Tandem、 DsRed、 DsRed2、 DsRed-Express (Tl )、 DSRed-Monomer、 mTangerine、 mStrawberry、 AsRed2、 mRFPl、 Jred、 mCheny、 HcRedl、 mRaspbeny、 HcRed-Tandem、 mPlum禾口 AQ143。
7. 根據權利要求1-6的組合物，其中編碼所述兩種或更多螢光蛋白 的所述兩種或更多基因編碼顯示相差至少20 nm、 30 nm、 40 nm、 50 nm、 60 nm、 70nm或優選80nm或更多的發射譜的螢光蛋白。
8. 根據權利要求1-7的組合物，其中編碼所述兩種或更多螢光蛋白 的所述兩種或更多基因編碼顯示出60%、 80%、 100%、 120%、 160%、 180%或優選更多的相對亮度的螢光蛋白，所述相對亮度是以增強型綠 色螢光蛋白(EGFP)的百分比表示的。
9. 根據權利要求1-8的組合物，其中所述組合物另外包含選自轉染 促進劑的物質。
10. 根據權利要求1-9的組合物，其中所述哺乳動物表達載體系統 由所述微泡封裝。
11. 用於體內表達分析的方法，其包括步驟a. 提供根據權利要求1-10的組合物，b. 將根據(a)的組合物應用於生物、目的組織或器官，c. 步驟(b)的組合物在目的組織或器官位點處用聲致穿孔裝置的 超聲耙孩i泡破壞，d. 通過應用光源激發由所述兩種或更多報導基因編碼的所述兩種 或更多蛋白中的至少一種，其中所述光源發出具有與所述兩種或更多熒 光蛋白的激發範圍或優選最大激發相應的波長的光，e. 所述第一螢光報導基因的表達的檢測，f. 所述第二或另外的螢光報導基因的表達的檢測，和任選地g. 重複步驟(d)至(f)。
12. 根據權利要求11的用於體內表達分析的方法，其另外包括在步 驟(d)至(f)的第一次重複前將潛在的效應子物質應用於所述生物的步驟。
13. 根據權利要求12的用於體內表達分析的方法，其中 所述效應子物質選自致熱原、藥物化合物、藥物前導化合物、變應原、自身免疫原、毒 素、多克隆抗體、單克隆抗體、抗原、脂質、碳水化合物、肽、蛋白、 蛋白複合物、胺基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA和 微小RNA。
14. 根據權利要求1-10的組合物用於診斷和/或治療的用途。
15. 試劑盒，其包含根據權利要求1-10的組合物。
16. 用於體內表達分析的方法，其包括步驟a. 提供根據權利要求1-10的組合物，b. 將根據(a)的組合物應用於生物、目的組織或器官，c. 步驟(b)的組合物在目的組織或器官位點處用聲致穿孔裝置的 超聲革巴微泡破壞，d. 通過應用光源激發由所述兩種或更多報導基因編碼的所述兩種 或更多蛋白中的至少一種，其中所述光源發出具有與所述兩種或更多熒 光蛋白的激發範圍或優選最大激發相應的波長的光，e. 所述第一螢光報導基因的表達的檢測，f. 所述第二或另外的焚光報導基因的表達的檢測，其中所述第二熒 光報導基因的啟動子是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的啟動子。
全文摘要
本發明的特徵在於用於體內表達分析的組合物和方法。本文呈現的數據證實用於表達分析的組合物的超聲送遞和/或表達使得能夠在體內分析基因表達，而既不需要測試受試者(動物或患者)的先前準備(特別是遺傳修飾)，也不對受試者造成長期或全身效應，所述組合物包含微泡載體以及遺傳有效負載，所述遺傳有效負載包含「始終打開的」啟動子、「參照」報導基因、「查詢」啟動子和「回答」報導基因。此種發明可以用於例如查詢個體受試者對外源效應子物質的後生或表型應答，所述外源效應子物質例如致熱原、藥物化合物、藥物前導化合物、變應原、自身免疫原、毒素、多克隆抗體、單克隆抗體、抗原、脂質、碳水化合物、肽、蛋白、蛋白-複合物、胺基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、RNA、PNA、siRNA和微小RNA。
文檔編號C12Q1/68GK101688252SQ200880024258
公開日2010年3月31日 申請日期2008年6月26日 優先權日2007年7月11日
發明者C·T·陳, E·E·桑託, N·迪米特羅瓦 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司