一種黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法
2023-06-11 15:54:56 1
專利名稱：一種黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法
技術領域：
本發明涉及的是一種黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，屬於蔬菜分子遺傳育種技術領域。
背景技術：
黃瓜是我國主要蔬菜作物之一，具有極高的經濟和社會價值。黃瓜植株性型多樣，有純雄株、兩性花株、雌雄同株、雄花兩性花株和全雌株等多種類型。限制黃瓜經濟產量的首要因子是植株雌雄花比例，因為除全雌株外，其它性型植株都表現為枝葉繁茂、源大庫少、經濟係數低。雌性系黃瓜是指植株只長雌花而不長雄花或長極少量雄花的品系。此品系往往表現出早熟、瓜密、採瓜期集中、豐產性強等優點。利用雌性系作母本配製的一代雜種也多表現出早熟、採瓜期集中和豐產等優點。同時，利用雌性系製備雜種一代無需人工授粉，節約了勞動力，降低了制種成本，而且製成的一代雜種純度很高。因此，對黃瓜育種來說，雌性系在雜種優勢利用以及雜交制種中極具利用價值，雌性系的選育與應用是黃瓜育 種中一項重要的研究內容。目前，黃瓜雌性系的選育主要依靠田間開花習性進行表型鑑定，該方法不僅需時漫長，會消耗大量的人力、物力，而且黃瓜植株性型複雜，易受外界條件影響而發生變化，所以從表型上進行全雌性基因的選擇效率不高，雌性系的選育難度大、成功率低，選育的黃瓜雌性系品種大都存在雌性不穩定，易受栽培環境影響等弊端。分子標記的出現，為雌性系的選育提供了新的途徑，利用分子標記不僅可以定位目標基因，也可以利用與目標基因緊密連鎖的分子標記追蹤目標基因，實現對目標性狀的間接選擇，這就是所謂的分子標記輔助選擇(Molecular Marker Assisted Selection)。與傳統表型選擇相比,它具有以下優點
(I)對目標性狀的選擇不受基因表達和環境因素的影響；(2)可在早代和植株生長的任何階段進行選擇，大大縮短了育種年限；(3)在分離世代能夠快速地鑑定植株的基因型，不受基因顯隱性的影響；(4)可以打破目標基因與不利基因的連鎖。其中，SSR分子標記是利用真核生物基因組中存在的大量微衛星重複序列設計引物，通過PCR擴增串聯的重複序列，依據微衛星的重複次數在同一物種不同基因型間的差異，揭示長度多態性。由於SSR標記在單個座位上檢測到的多態性遠高於其它幾種分子標記，且廣泛、隨機、均勻地分布於整個基因組，具共顯性遺傳，分布廣、穩定性和多態率高，操作簡單、重複性好、對DNA質量要求較低等特點，能準確高效地鑑別大量等位基因，應用與目的基因相連鎖的分子標記進行輔助育種能直接從基因型上對後代單株進行選擇，實現苗期的性型鑑定，提高選擇效率及準確性，從而加快黃瓜雌性系育種進程，在黃瓜雌性系育種中具有極高的應用價值。
發明內容
本發明的目的在於針對現有黃瓜雌性系育種中常規採用的田間鑑定與植株表型相結合方法所存在的工作量大、周期長、易受環境條件的影響、育種效率低、成本高等缺陷，提供一種在黃瓜雌性系育種進程中，用於早期分離世代與苗期雌性系鑑定，能準確、快速、高效選擇出雌性系材料的分子標記輔助選擇的方法。本發明目的通過以下技術方案得以實現所述的黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於所述的方法按以下步驟進行(I)待檢測黃瓜葉片樣品的採集將待檢測黃瓜材料播種,待1-2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°c下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的採集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA ;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預冷，使用麗301細胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設定 為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨後加入2XCTAB提取緩衝液700 μ I (事先預熱至65°C)浸透粉末並倒轉離心管，使粉末充分散開，於65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉移上清於另一離心管中，加入2/3體積的預冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min, 12000rpm離心IOmin,去上清,將離心管倒置於吸水紙上,控幹上清；用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，室溫下微幹，加入300 μ I去離子水溶解沉澱，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預冷無水乙醇沉澱DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用70(^ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，通風乾燥或者自然乾燥；加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存於-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置於-20°C保存備用；(4)獲得與黃瓜全雌性相關基因的分子標記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進行SSR分子標記分析；選用699對SSR引物進行PCR擴增，PCR擴增反應總體系為20 μ 1，擴增反應體系成分為黃瓜基因組 DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I TaqDNA聚合酶O. I μ I，10 X buffer 2 μ I，加無菌重蒸水補齊至20 μ I ;(5)樣品鑑定利用獲得的標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分離分析，獲得多態性片段，根據凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結合田間鑑定和其他育種目標性狀的選擇；選擇出具有全雌性特徵的優良單株。步驟(3)中，研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz ;研磨後加入事先預熱至65°C的2XCTAB提取緩衝液700 μ I浸透粉末；利用正交試驗，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴增體系。步驟(4)中，PCR反應擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin ;在2(^ I的PCR擴增產物中加入8 μ I Loading Buffer 94°C變性5min,迅速置於冰上冷卻；每樣品各取6 μ I上樣於6%變性聚丙烯醯胺凝膠上，在恆定100W功率下電泳至溴酚藍到達凝膠另一端；銀染後，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現出共顯性分離的引物利用F2代強雌和弱雌混合基因池進行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的一個SSR多態性片段，其標記引物為 CSWCT25。本發明的有益效果是(I)本發明採用了對目標材料DNA進行PCR及SSR分子標記技術，該技術具有高效和低成本的特點，適合對大量樣本材料進行分析與鑑定，大大提高了選擇效率；(2)本發明可在任何時期對黃瓜育種材料進行準確、快速的檢測，周年均可在實驗室內進行，不受環境條件的影響，且不影響植株的正常生長；本發明分子標記輔助選擇黃瓜雌性系育種方法，與常規育種、鑑定方法相比，具有周期短、成本低、操作簡便等優點。
圖I為CSWCT25標記引物在親本及F2群體中部分單株PCR擴增產物的凝膠電泳圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但以下描述不對本發明的保護範圍構成任何意義上的限定。本發明用於黃瓜雌性系分子標記輔助選擇的PCR擴增及SSR標記引物(CSWCT25 )，其中正向引物序列5 ' -AAAGAAATTAAGTCAATCAAACCG-3 '，反向引物序列5' -CCCACCAATAGTAAAATTATACAT-3'。本發明所述的黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，它按以下步驟進行( I)待檢測黃瓜葉片樣品的採集將待檢測黃瓜材料播種,待1-2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°c下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的採集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA ;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預冷，使用麗301細胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨後加入2X CTAB提取緩衝液700 μ I (事先預熱至65°C)浸透粉末並倒轉離心管，使粉末充分散開，於65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉移上清於另一離心管中，加入2/3體積的預冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min, 12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置於吸水紙上,控幹上清；用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，室溫下微幹，加入300 μ I去離子水溶解沉澱，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預冷無水乙醇沉澱DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用70(^ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，通風乾燥或者自然乾燥；加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存於-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置於-20°C保存備用；(4)獲得與黃瓜全雌性相關基因的分子標記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進行SSR分子標記分析；選用699對SSR引物進行PCR擴增，PCR擴增反應總體系為20 μ 1，擴增反應體系成分為黃瓜基因組 DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I TaqDNA聚合酶O. I μ I，10 X buffer 2 μ I，加無菌重蒸水補齊至20 μ I ;(5)樣品鑑定利用獲得的標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分離分析，獲得多態性片段，根據凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結合田間鑑定和其他育種目標性狀的選擇；選擇出具有全雌性特徵的優良單株。步驟(3)中，研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz ;研磨後加入事先預熱至65°C的2XCTAB提取緩衝液700 μ I浸透粉末；利用正交試驗，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴增體系。步驟(4)中，PCR反應擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30sec，按特定引物·特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin ;在2(^ I的PCR擴增產物中加入8 μ I Loading Buffer 94°C變性5min,迅速置於冰上冷卻；每樣品各取6 μ I上樣於6%變性聚丙烯醯胺凝膠上，在恆定100W功率下電泳至溴酚藍到達凝膠另一端；銀染後，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現出共顯性分離的引物利用F2代強雌和弱雌混合基因池進行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的一個SSR多態性片段，其標記引物為 CSWCT25。實施例I :(利用分子標記輔助選擇方法對雜交後代材料的抗性檢測I)(I)待檢測黃瓜葉片樣品的採集將待檢測黃瓜材料Η174-1-2播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的採集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA。稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預冷，使用麗301細胞破碎儀研磨成粉末狀。研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨後加入2 X CTAB提取緩衝液700 μ I (事先預熱至65°C)浸透粉末並倒轉離心管，使粉末充分散開，於65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合
2-3次。取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin。12000rpm離心15min。轉移上清於另一離心管中，加入2/3體積的預冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min。12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置於吸水紙上,控幹上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，室溫下微幹。加入300 μ I去離子水溶解沉澱。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預冷無水乙醇沉澱DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，通風乾燥或者自然乾燥。加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存於-80°C超低溫冰箱備用。制1%瓊脂糖凝膠進行檢測。用SMA3000微量紫外分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置於_20°C保存備用；(4) PCR擴增及擴增產物檢測對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H174-1-2的DNA樣本進行SSR分子標記分析，標記引物為CSWCT25。PCR擴增反應總體系為20 μ 1，擴增反應體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，lOpmol/μ I 引物各 O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I Taq DNA 聚合酶 O. I μ 1，IOXbuffer 2 μ I,加無菌重蒸水補齊至20 μ I。PCR反應擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30seC，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin, 35個循環，72°C延伸IOmin ;在20μ I的PCR擴增產物中加入8 μ ILoading Buffer 94°C變性5min，迅速置於冰上冷卻。每樣品各取6 μ I上樣於6%變性聚丙烯醯胺凝膠上，在恆定100W功率下電泳至溴酚藍到達凝膠另一端。銀染後，在膠片觀察燈上照相、觀察並記錄結果；(5)樣品鑑定利用獲得的標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分離分析，獲得多態性片段，Η174-1-2凝膠上譜帶的相對位置，與240-1-2-2-3-1自交系擴增出的片段相同，說明該品種是全雌性品種，結合田間鑑定和其他育種目標性狀的選擇，與田間接種鑑定結果完全符合，說明本發明所建立的檢測方法能準確、快速的鑑定出 黃瓜全雌性優良單株。實施例2 (利用分子標記輔助選擇方法對雜交後代材料的抗性檢測2)(I)待檢測黃瓜葉片樣品的採集將待檢測黃瓜材料Η158-1-1-2-2播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(2)黃瓜對照樣品葉片的採集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1_2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份O. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存；(3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA。稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預冷，使用麗301細胞破碎儀研磨成粉末狀。研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨後加入2 X CTAB提取緩衝液700 μ I (事先預熱至65°C)浸透粉末並倒轉離心管，使粉末充分散開，於65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合
2-3次。取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin。12000rpm離心15min。轉移上清於另一離心管中，加入2/3體積的預冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min。12000rpm離心lOmin,去上清,將離心管倒置於吸水紙上,控幹上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，室溫下微幹。加入300 μ I去離子水溶解沉澱。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預冷無水乙醇沉澱DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清。用700 μ I 70%的乙醇洗滌沉澱2次，通風乾燥或者自然乾燥。加入30 μ I去離子水溶解DNA，保存於-80°C超低溫冰箱備用。制1%瓊脂糖凝膠進行檢測。用SMA3000微量紫外分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置於_20°C保存備用；(4)PCR擴增及擴增產物檢測對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H158-1-1-2-2的DNA樣本進行SSR分子標記分析，標記引物為CSWCT25。PCR擴增反應總體系為20 μ 1，擴增反應體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，IOpmol/μ I 引物各O. 4 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ l,2mM dNTPl μ l,5U/y I Taq DNA聚合酶0. I μ 1，IOXbuffer 2 μ I,加無菌重蒸水補齊至20 μ I。PCR反應擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin, 35個循環，72°C延伸IOmin ;在20μ I的PCR擴增產物中加入8 μ ILoading Buffer 94°C變性5min，迅速置於冰上冷卻。每樣品各取6 μ I上樣於6%變性聚丙烯醯胺凝膠上，在恆定IOOW功率下電泳至溴酚藍到達凝膠另一端。銀染後，在膠片觀察燈上照相、觀察並記錄結果； (5)樣品鑑定利用獲得的標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分離分析，獲得多態性片段，Η158-1-1-2-2凝膠上譜帶的相對位置，與
3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系擴增出的片段相同，說明該品種不是全雌性品種，結合田間鑑定和其他育種目標性狀的選擇，與田間接種鑑定結果完全符合。
權利要求
1.ー種黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於所述的方法按以下步驟進行 (1)待檢測黃瓜葉片樣品的採集將待檢測黃瓜材料播種，待1-2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存； (2)黃瓜對照樣品葉片的採集將黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種.3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播種，待1-2片真葉期時，取植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0. 5g，採集後現用或在-20°C下冷凍保存； (3)樣品基因組DNA提取用CTAB法提取每株葉片DNA;稱取150mg新鮮的葉片，連同適配器、研磨球在液氮中預冷，使用MM301細胞破碎儀研磨成粉末狀；研磨程序設定為研磨時間I. 5min，研磨頻率20Hz。研磨後加入2 X CTAB提取緩衝液700 (事先預熱至65°C)浸透粉末並倒轉離心管，使粉末充分散開，於65°C水浴保溫30min，其間輕柔混合2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心15min ;轉移上清於另ー離心管中，加入2/3體積的預冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min，12000rpm離心lOmin，去上清，將離心管倒置於吸水紙上，控幹上清；用700 U I 70%的こ醇洗滌沉澱2次，室溫下微幹，加入300 u I去離子水溶解沉澱，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5體積的NaAc，2. 5倍體積的預冷無水こ醇沉澱DNA，放置Ih左右，12000rpm離心lOmin，去上清；用700 70%的こ醇洗滌沉澱2次，通風乾燥或者自然乾燥；加入30 Ul去離子水溶解DNA，保存於-80°C超低溫冰箱備用；制1%瓊脂糖凝膠進行檢測；用SMA3000微量紫外分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到所需濃度，分裝，置於_20°C保存備用； (4)獲得與黃瓜全雌性相關基因的分子標記對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代DNA樣本進行SSR分子標記分析；選用699對SSR引物進行PCR擴增，PCR擴增反應總體系為20 yl，擴增反應體系成分為黃瓜基因組DNA20ng，10pmol/ii I 引物各0.4ii l，2.5mM Mg2+2 u l,2mM dNTP I u l,5U/u I Taq DNA聚合酶0. I u I, IOXbuffer 2 u I,加無菌重蒸水補齊至20 U I ； (5)樣品鑑定利用獲得的標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分離分析，獲得多態性片段，根據凝膠上譜帶的相對位置，選擇電泳帶型與供體親本相同的單株，結合田間鑑定和其他育種目標性狀的選擇；選擇出具有全雌性特徵的優良單株。
2.根據權利要求I所述的黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於步驟(3)中,研磨程序設定為研磨時間I. 5min,研磨頻率20Hz ;研磨後加入事先預熱至65°C的2 X CTAB提取緩衝液700 ill浸透粉末；利用正交試驗，建立黃瓜全雌性基因連鎖特異片段的最佳擴增體系。
3.根據權利要求I所述的黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，其特徵在於步驟(4)中，PCR反應擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30sec，按特定引物特定溫度退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin;在20yl的PCR擴增產物中加入8 y ILoading Buffer 94°C變性5min,迅速置於冰上冷卻；姆樣品各取I上樣於6%變性聚丙烯醯胺凝膠上，在恆定100W功率下電泳至溴酚藍到達凝膠另一端；銀染後，在膠片觀察燈上照相、觀察，對在親本間表現出共顯性分離的引物利用F2代強雌和弱雌混合基因池進行再次篩選，從而獲得與黃瓜全雌性緊密連鎖的ー個SSR多態性片段，其標記引物為CSWCT25。
全文摘要
本發明公開了一種黃瓜雌性系育種的分子標記輔助選擇方法，該方法是利用黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F2代分離群體篩選出與黃瓜全雌性基因緊密連鎖的SSR標記引物；通過提取對照品種和待測種子幼苗基因組DNA，利用篩選出的SSR標記引物，經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳、銀染，得到對照與待測樣的凝膠圖譜，根據凝膠上條帶的相對位置，快速而準確地檢測黃瓜全雌性基因的存在。本發明對黃瓜全雌品種240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品種3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系進行SSR分子標記的篩選可有效開展黃瓜雌性系的分子標記輔助選育，提高選擇效率和標準化程度，從而加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102816860SQ20121033217
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者張鵬 申請人:浙江省農業科學院