用於洗滌劑領域的新的脂酶變異體的製作方法

2023-06-11 15:09:26

專利名稱：：用於洗滌劑領域的新的脂酶變異體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及修飾的脂酶及其在例如洗滌劑或清洗組合物中的用途。脂酶是能夠水解脂類的酶，它們被廣泛用於如脂肪和油類加工、洗滌劑、診斷試劑等領域。許多微生物生產細胞外脂酶(三醯基甘油醯基水解酶，E.C.3.1.1.3)。已在美國專利No.3,950,277中公開了適宜的脂酶。這些脂酶是從各種微生物如假單胞菌屬、麴黴菌屬、肺炎球菌屬、葡萄球菌屬、結核分枝桿菌、解脂芽生圓酵母、和核盤菌屬中得到的。在如EP463100(產鹼假單胞菌)、EP0218272(類產鹼假單胞菌)、EP0214761(洋蔥假單胞菌)、EP0258068(Thermomyces)，EP206390(Pseccdomonaschromobacter、螢光假單胞桿菌、菌實假單胞菌、還原氮假單胞菌、劃界假單胞菌和Chromobacterviscosum)中，給出了脂酶在洗滌劑組合物中用途的實例。對於所需的應用領域，假單胞菌脂酶似乎具有良好的特徵。因此，已經用假單胞菌屬菌種來得到脂酶。為了在發酵中提高脂酶的產率，在同源和異源的宿主菌株中，已克隆並表達了幾種脂酶基因。已經報導過的，從中克隆脂酶基因的假單胞桿菌屬種的實例是洋蔥假單胞菌(EP331376)、Pseudomonasglumae(EP464922)、類產鹼假單胞菌(EP334462)、莓實假單胞菌(EP318775)。假單胞桿菌屬種的分類是以Palleroni等人(IntJ.Syst.Bacteiol.23333(1973))報導的，DNA-rRNA和DNA-DNA雜交研究為基礎的。在Bergey′sManualofSystematicBacteriology(Vol.l，Seetion4，PP.160-161(1984)，EdsN.R.KriegandJ.G.Hoet，WilliamsandWilkins，Baltimor/rondon)中，可見到更詳細的綜述。該綜述同時報導的形態學數據和16s核糖體RNA同源性也支持該種分類法。可以將具有良好應用特徵的所述假單胞單菌菌株分成兩個DNA同源組類產鹼假單胞菌、產鹼假單胞菌、銅綠色假單胞桿菌(參見，如EP0334462)、施氏假單胞菌和門多薩假單胞菌非常相似，屬於I類。例如銅綠色假單胞桿菌脂酶與類產鹼假單胞菌脂酶有81％的同源性。Pseudomonasglumae和洋蔥假單胞菌屬於II類。表1列出了得自不同菌株的脂酶基因的同源性比較。從這種同源性比較中，可以看出，得自莓實假單胞菌的脂酶介於I類和II類之間。來源於I類和II類的脂酶間有許多差異。發現屬於I類假單胞菌的脂酶比屬於II類的那些有更高的疏水性，因此是更親脂的。這種特性對用於洗滌劑中是非常有益的。類產鹼假單胞菌脂酶的疏水性使其容易粘附於表面。其它類或生物如HumicolaLanuginosa的脂酶常具有更高的親水性。I類高疏水性脂酶僅需適當處理即可用於洗滌劑。表1與其它假單胞菌脂酶的同源性表的下部分是核酸序列的比較。上部分是胺基酸序列的比較。可以用已提到的脂酶作為洗滌劑組合物中的組分。除脂酶外，根據其配方，洗滌劑組合物還可含有許多已知組分。——洗滌劑粉末一般含有助洗劑(如沸石，磷酸鹽)，表面活性劑(陰離子的，非離子的)聚合物(如，丙烯醯聚合物)，漂白劑前體(如硼酸鹽)，漂白激活劑，結構劑(Structurant)(如矽酸鹽)。調整pH的化合物(如，鹼)。——液體洗滌劑一般含有表面活性劑(如，陰離子的和非離子的)，漂白劑前體(如，硼酸鹽)，漂白激活劑，調整pH的化合物(如，鹼)。也可將其它組分如酶(如，蛋白酶，澱粉酶)，有機酸，無機鹽，纖維軟化劑加到上述組合物中。為了可在洗滌劑組合物中作為一種組分使用，除洗滌特性外，脂酶還應對所述組合物中的其它組分具有耐受性。可以經若干途徑，如經典的篩選方式或現代遺傳和蛋白質工程技術，研製或發現用於洗滌劑組合物的酶。對具有所需酶活性的生物或微生物的篩選可以通過如下完成，例如，從微生物或所述微生物的培養上清液中分離並純化所述酶，確定其生化特性，檢測這些生化特性是否符合特定用途的需要。如果不能從其天然的產生菌中得到所鑑定的酶，則可用重組DNA技術分離編碼酶的基因，在另一種生物中表達該基因，分離並純化所表達的酶，然後檢測其是否適於所預期的用途。另一種獲得具有預期用途的新酶的方法是修飾現存的酶。特別是可經化學修飾方法(參見WO91/16423)達到該目的。通常，這些方法是非特異性的，也就是說它們可修飾帶一般側鏈的所有可接觸的殘基，或它們依賴於所修飾的適當胺基酸的存在，而經常不能修飾難以達到的胺基酸，除非酶分子是未摺疊的。然而，通過誘變編碼基因進行的酶修飾則沒有上述的非特異性問題。可以用隨機誘變或定點誘變完成誘變。通過用化學誘變劑或放射誘變處理整個微生物而進行的隨機誘變當然產生修飾過的酶。在這種情況下，必須要有極有效的選擇方法以篩選這些特定、稀少的突變體。也可以作到提高經隨機誘變分離突變體酶的可能性，即在克隆編碼基因後，在體外或體內對其進行誘變，並在適當的宿主細胞內，通過再克隆突變基因表達所編碼的酶。用於生產修飾酶的適當宿主有，例如，細菌(大腸桿菌、芽胞桿菌，假單胞菌)，酵母或真菌(麴黴菌屬)。這種情況下，必須要有適宜的生物學選擇方法，以選擇所需的突變體酶。這些生物學選擇方法不必直接選擇酶，但最好適於工業化應用。例如，EP0407225描述了一種脂酶，它具有改善了的抗蛋白酶或氧化劑作用的穩定性。事實上，這些改進可以解決特定的問題，但不一定會產生適宜的，甚至更好的洗滌性能(參見，如EP0328229)。EP0407225還公開了在Pseudomonasglumae脂酶序列中的突變。但該申請未說明對於編碼來源於其它微生物的脂酶的基因，應取代哪個殘基。通常，對於一種特定酶的最佳突變選擇並不是另一種同源酶自身最好的突變選擇，而對於相關程度更低的酶當然更不是。WO92/05249描述了帶有不同疏水性或靜電特性的脂類接觸區的脂酶突變體，它可以產生改善的洗滌性能、穩定性、貯存穩定性以及特異性。但，該申請中描述的脂酶與假單胞桿菌屬脂酶幾乎沒有同源性，並且實際上具有完全不同的特性，因此，不能用申請WO92/05249來確定哪個位置應被突變以得到具有所需特性的假單胞菌屬脂酶。本發明現提供了一種新的修飾過的脂酶，其中，至少相當於野生型、類產鹼假單胞菌脂酶中21位的甲硫氨酸被另一種胺基酸取代，以得到所需的性質改變。在本發明優選的實施方案中，在使用條件下，這些脂酶變異體表現出改善的洗滌性能。優選的是其M21殘基被亮氨酸、絲氨酸或丙氨酸取代的突變體。圖1使用PCR的定點誘變圖2將質粒pBRflank整合到染色體中圖3從染色體中，重組缺失脂酶基因和質粒圖4將突變體脂酶DNA導入染色體和質粒圖5在3′側區域重組。在本說明書中，用術語「改善的洗滌性能」說明在應用條件下，即存在完整的洗滌劑組合物及已確立的條件下，洗滌結果改善。在進行胺基酸序列排列比較時，銅綠色假單胞菌脂酶(Wohlfarthetal，(1992)，J.ofGeneralMicrobiology138(7)1325-1335)16位的甲硫氨酸殘基相當於類產鹼假單胞菌酶在21位的甲硫氨酸。優選地，野生型脂酶是由I類假單胞菌微生物生產的脂酶，所述野生型脂酶與類產鹼假單胞菌脂酶優選地有70％或更高的同源性，同源性指不同胺基酸序列(或蛋白質)排列比較時，相同的胺基酸數目。我們第一次成功地得到突變體或修飾的酶，它們在工業生產條件下，表現出適當的甚至改善的洗滌性能。使用能夠使一個或多個胺基酸被任何其它所需胺基酸特異性取代的定點誘變，以構建並進一步選擇具有改善了性能的酶。具體地說，至少在相當於類產鹼假單胞菌脂酶21位發生的特異性突變(其中原甲硫氨酸被另一種胺基酸取代)，在存在或不存在漂白劑的情況下，令人驚異地改善了洗滌性能，這說明，該位置對於洗滌性能的重要性，因此，在21位的甲硫氨酸取代，不僅會提高氧化穩定性，而且會改善洗滌性能。以高度的胺基酸同源性為基礎，類產鹼假單胞菌脂酶與其它屬於I類假單胞桿菌菌株的假單杆胞菌脂酶非常相近。這意味著這些脂酶的三維結構非常相似。因此，在假單胞菌菌株的屬於I型的其它脂酶中的該結構位置進行修飾也有助於洗滌性能的改善。適於取代所述甲硫氨酸的胺基酸實例包括Ala，Ser，Leu，Val，Phe，Asn和Asp。在本發明優選的實施方案中，相當於野生型類產鹼假單胞菌脂酶21位的原甲硫氨酸由亮氨酸取代，並表現出明顯改善的性能，儘管在該突變體中，在疏水性或靜電特性方面基本沒有變化。本發明也提供生產方法，包括在編碼假單胞杆脂酶的DNA中，至少在相當於類產鹼假單胞菌脂酶Met+21的位置上，進行突變，然後檢測由所述突變產生的酶中，所需特性的變化。所述的特性變化包括洗滌性能改善，特異性活性改變，pH活性改變，底物活性改變或氧化穩定性提高或所述特性的結合。本發明的另一目的是提供一種選擇方法，它能夠選擇洗滌性能提高了的突變體。在洗滌條件下確定脂酶性能的檢測方法(SLM-試驗)為了本發明的目的，用所謂SLM-試驗評估洗滌過程中的鹼性脂酶突變體。SLM-試驗使用的原理與由T.Hashimoto等人(Yukagaku34(1985)，606-612)開展的方法的原理相同，但分析所需的時間大大減少。該方法包括用纖維上固定的非乳化脂肪或油作為試驗汙漬，洗滌後提取小布塊，分析提取物的脂肪及脂肪酸。根據所用的條件，洗滌過程中，形成的脂肪酸與殘留的甘油三酯可以駐留在織物上，脂肪酸作為脂酶活性的效果。因此，在布塊上剩餘的產物數量看起來是洗滌過程中脂酶性能的良好尺度。下面是如何優選地完成SLM試驗的典型實例。用聚酯布塊作為纖維，三油酸甘油酯或純化的橄欖油(均是Sigma的產品，USA)作為底物。提取織物後，可接著對水解後的三油酸甘油酯進行色譜分析。用於SLM試驗目的的優選的洗滌過程如下將80ml溶於正己烷(12.5％)的10mg橄欖油沾在聚酯布(3×3cm)上。室溫下，將該布塊空氣乾燥。將含10mLSTW(標準自來水含2mM氯化鈣和0.7mM氯化鎂的蒸餾水)的洗滌液或溶於STW的洗滌劑放在帶毛玻璃塞的Erlenmeyer燒瓶(50ml)中，然後於40℃保持在振蕩水浴中。洗滌過程從將脂酶Ml(40ILU，見下文)和隨後將汙漬的布塊加到Erlenmeyer燒瓶中開始，然後振蕩40分鐘。空白實驗中，沒有加入脂酶。洗滌後，用STW漂洗布塊，隨後於55℃乾燥1小時，然後進行第二輪洗滌。在含5ml溶劑的玻璃試管中旋轉提取乾燥的布塊，所述溶劑含有與底物及產物色譜分離所用的洗脫液相同的組成。由HPLC測定所提取溶液中殘留的甘油三酯量及形成的游離脂肪酸和1，2和1，3-二醯基甘油酯的量。設備及條件泵LKB(2150型)檢測折光監測儀(JobinYvon)注射系統Perkin-ElmerIss-101；10ul積分儀SpectraPhysics，Chromjet柱CPMicrospher-Si(Chrompack)，100×4.6mm洗脫液正己烷/異丙醇/甲酸975∶25∶2.5(v/v)，1ml/分鐘溫度室溫在這些條件下，三油酸甘油酯、油酸，1.3和1.2-二醯基甘油酯的保留時間分別為1.2，1.6，2.4和3.4分鐘。測量峰面積或峰高。在從布塊提取後，它們是三甘油酯、游離脂肪酸和二醯基甘油酯的回收尺度。以從未洗滌的布塊提取後，三甘油酯的回收率為100％。在上述條件下，以峰高度為基礎，發現橄欖油、油酸、1.2和1.3-二醯甘油酯之間的折光指數反應比例為1.00，0.98，2.10和1.30.確定脂酶活性的檢測方法以橄欖油的水解為基礎，確定按ILU表達的本發明脂酶及突變體的活性。在30℃，存在20mM氯化鈉和10Mm氯化鈣的情況下，在一含10％橄欖油的0.4mMTris緩衝液(pH9)的恆pH槽中測量水解。將1ILU定義為在檢測條件下，每分鐘釋放1μmol脂肪酸所需的酶量。提供下列實施例說明但不限制本發明。實施例1研製脂酶基因的誘變系統可以將目前的定點誘變法分成兩類(1)缺口雙鏈DNA由突變引物引導的錯誤植入(ill-in)會產生一個異源雙鏈DNA，它含一條突變鏈。(2)通過取代靶基因內的盒，可以導入適當突變的序列。然後將含所需突變的PCR片數換到表達盒內。使用PCR的定點誘變該方法來自Xiong，他在第三屆假單胞桿菌會議(1991)上，對該方法作了綜合描述。圖1對該方法作了圖示說明。為了分離單鏈DNA，我們使用質粒pTMPv18A，在EP0334462中有描述。Vent-聚合酶(Biolabs)用於擴增反應。該聚合酶含3′校對(Proofreading)活性，因此減少了因PCR反應引起的錯誤摻入。在下列緩衝液中完成PCR反應；所述緩衝液含10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl，pH8.8，2mMMgSO4，及0.1％TritonX-100，0.2mMdATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP，0.2mMdTTP和1單位Vent聚合酶。在步驟1中，將0.5μM引物A(含突變)，0.05μM引物B和1-10ng單鏈pTMPv18A加至50μl反應混合物中，並完成98℃2分鐘，55℃2分鐘；72℃2分鐘的25個循環。加入KlenowDNA聚合酶和連接酶，用含突變的片段作為引物補平單鏈DNA。這樣產生一異源雙鏈DNA，含一條突變的鏈。然後，用核酸外切酶處理混合物以除去單鏈DNA和引物A及B。然後沉澱DNA，並將其溶於PCR反應緩衝液。用含突變的新合成的DNA鏈作為步驟2中的模板。步驟2中，將0.05μM引物C加到該混合物中。按上述完成第2次PCR。然後用適當的限制酶消化PCR片數，然後將其亞克隆到整合的載體中。實施例2在活性位點附近導入突變改變M21位按上述導人突變。選XhoI和BclI作為適當的限制酶。所用的寡核苷酸列於表2表2實施例3類產鹼假單胞菌M1(CBS473.85)脂酶基因的染色體失活用自殺性整合質粒(它不能在類產鹼假單胞菌中複製，但能在其它微生物中複製)使類產鹼假單胞菌染色體中的脂酶基因失活。將酯酶基因片段從質粒pTMPv18亞克隆到質粒pBR322(Bolivar等Gene2(1977)95-113)上，該質粒能在大腸桿菌中複製，但不能在類產鹼假單胞菌中複製。然後從該質粒中缺失一個內片段。所得質粒稱為pBRflank。用pBRflank轉化類產鹼假單胞菌M1(CBS473.85)。由於該質粒不能在假單胞菌中複製，所以只有經整合才能得到四環素抗性菌落。挑選數個四環素抗性(5mg/l)菌落。在這些菌株中，通過在5′或3′側區域的單一重組，質粒pBRflank被整合到細菌染色體上(圖2)。由於這些菌株仍含有能發揮功能的脂酶基因，因此，它們表現出脂酶陽性及四環素抗性表型。為了從染色體中缺失脂酶基因和該質粒，必須進行第二次重組(切割)。通過在沒有抗生素的情況下，使菌株在BHI(腦心浸出物)培養基中生長數天，達到上述目的。然後將細胞鋪在含三丁酸甘油酯的瓊脂培養基上。同樣檢測含脂酶陰性表型的菌落，看其是否不能在選擇性瓊脂盤中生長。將所得的脂酶陰性菌株稱為Ps600。在圖2和3中，列出了該整合過程，然後是第二次重組的示意圖。將突變的脂酶基因導入脂酶陰性菌落類產鹼假單胞菌Ps600。為了生產高產量的突變體酶，在質粒上的突變基因被整合到染色體中同時被導入相同的菌株質粒上。用與上述實施例中相似的方法，將突變脂酶基因整合到染色體中。圖4和5給出了該過程的示意圖。生產突變體脂酶按EP0334462所述，使菌株生長。然後從培養液中純化脂酶蛋白質。EP0334462對該方法也作了描述。實施例4測定M21L突變體脂酶的特異性活性用上述的活性檢測法及對確定蛋白質含量的定量胺基酸分析，確定野生型和突變體的特異性活性。突變體的特異性活性為野生型酶的1.4倍8000比6390ILU/mg蛋白質。實施例5在應用條件下(SLM試驗)野生型脂酶M1(CBS473.85)和某些M21突變體的脂酶活性按上文所述完成SLM試驗。在下列條件下，於單和雙循環洗滌試驗中，檢測野生型和突變體——標準自來水(STW)——洗滌劑是ArielUltraTM(2g/l)——脂酶量如所示ArielUltraTM是ProcterGamble的產品，可從市場上買到。該洗滌劑既不含蛋白酶也不含脂酶。這些條件基本代表歐洲人的洗滌條件。表3有和沒有脂酶M1及某些M21突變體的情況下，1和2個洗滌循環後，殘留甘油三酯的百分比表3<nd＝未測定從該表可以看出，所用的脂酶對織物有脂解特性。這些結果清楚地說明當加入相同的重量時，在這些應用條件下，M21L和M21A突變體比野生型酶更有活性。M21S突變體的脂解特性可與野生型脂酶相比。實施例6根據SLM試驗，在洗滌過程中，野生型脂酶(M1)與突變體M21L的性能。在下列條件下，檢測這些酶與粉末洗滌劑及漂白系統的相容性——標準硬度的水(0.75mM的鈣和0.25mM的鎂)——洗滌劑是TideTM(1g/l)——按標明的脂酶量——2個循環的洗滌試驗TideTM是ProcterGamble的產品，可從市場上買到。該洗滌劑含蛋白酶但沒有脂酶。這些條件基本代表美國的洗滌條件。從表4可清楚地看出實施例中所用的脂酶對織物具有脂解特性，特別是在粉末洗滌劑中的洗滌性能。在含有和不含漂白劑的洗滌劑中，該突變體酶的洗滌性能優於野生型脂酶。表4脂酶M1和突變體M21L的洗滌性能*漂白系統(所用的濃度為0.3g/l)是過硼酸鹽/NOBS(6.6∶1)；NOBS代表壬醯氧基苯磺酸酯**TG＝甘油三酯，DG＝甘油二酯，FFA＝游離脂肪酸實施例7根據SLM試驗，在洗滌過程中野生型脂酶M1(CBS473.85)和M21S及M21A突變體的性能在下列條件下，檢測這些酶與粉末洗滌劑和漂白系統的洗滌性能和相容性——標準硬度的水(0.75mM的鈣和0.25mM的鎂)——洗滌劑是TideTM(1g/l)——按標明的脂酶量——2個循環的洗滌試驗TideTM是ProcterGamble的產品，可從市場上買到。該洗滌劑含蛋白酶但沒有脂酶。在本洗滌試驗中所用的布塊來自在洗滌中有不同行為的不同批次。這些條件基本代表美國的洗滌條件。從表5可清楚地表明本實施例中所用的脂酶在含有和不含漂白系統的洗滌劑中，對織物表現出脂解特性和其洗滌性能。而M21S的洗滌性能可與野生型的相比，M21A的洗滌性能得到改善。表5脂酶M1、突變體M21S和突變體M21A的洗滌性能*漂白系統(所用的濃度為0.3g/l)是過硼酸鹽/NOBS(6.6∶1)；NOBS代表壬醯氧基苯磺酸酯**TG＝甘油三酯，DG＝甘油二酯，FFA＝游離脂肪酸實施例8在不同溫度的應用條件下，野生型M1脂酶和M21L突變體的脂酶活性按上文所述完成SLM試驗。在下列條件下的單一洗滌試驗中檢測野生型和突變體——標準自來水(STW)——洗滌劑是ArielUltraTM(2g/l)——按標明的脂酶劑量ArielUltraTM是ProcterGamble的產品，可從市場上買到。它不含酶。表6在有和無M21L突變體和野生型脂酶M1存在下，在不同溫度下一個洗滌循環後，殘留的甘油三脂的百分比*TG＝甘油三酯本實施例清楚地說明在檢測的應用條件下，在所有的檢測溫度下，突變體的脂解能力均優於野生型。在這些應用條件下，發現脂酶M1的最佳溫度(甘油三酯水解的最大值)40℃，突變體的值更高50℃。實施例9配製的脂酶M1和某些M21突變體的存放穩定性在-PEG成粒器(PEG-Prill)中配製脂酶M1和M21L，M21S及M21A突變體。然後在下列表7中標明的溫度下，將這些顆粒存於密封的玻璃試管中。貯存8個星期後，在恆pH槽中，測定脂酶的殘留活性。正如從表中看到的，在37℃貯存8個星期後，所含的所有脂酶的殘留活性均為其原活性的90％以上。表7脂酶M1和各種M21突變體的貯存穩定性">在℃貯存的殘留活性42527脂酶酯酶M1989595M21L突變體97102102M21S突變體979492M21A變體939595根據本發明的新脂酶變異體在洗滌方面，如洗衣，洗碗盤是特別有用的，但也可將其用於本領域已知的其它方面。優選的是以顆粒(如散顆粒)或液體的形式。通常與穩定劑一起用脂酶作為洗滌劑添加劑。Met+21的取代對洗滌劑的穩定性有積極效果，其程度取決於所用的特定胺基酸。在含和不含漂白系統的情況下，Met+21突變體在溶液中的穩定性特別好。可以與其它酶，如澱粉酶、蛋白酶、纖維素酶和各種細胞壁降解酶一起使用。本發明說明書中提到的所有公開文本(包括專利和專利申請)是與本發明有關的
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的專業人員可以理解的。所有公開文本均併入本文作為參考。儘管為了清楚理解的目的，以說明及實施例的方式詳細描述了本發明，但對本領域專業人員顯而易見的是，在不背離本發明權利要求精神和範圍內，也可以進行多種變化和修改。序列目標(1)一般信息(i)申請人(A)名稱GIST-BROCADESN.V.(B)街道P.O.Box1(C)城市Delft(E)國家Netherlands(F)郵政編碼(ZIP)NL-2600MA(G)電話31.15.791111(H)電話31.15.793957(ii)發明題目用於洗滌劑領域的新的脂酶變異體(iii)序列數目3(iv)計算機閱讀形式(A)介質類型Floppg盤(B)計算機兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先中請資料(A)申請號EP93201212.3(B)申請日27-APR-1993(2)SEQIDNo.1的資料(i)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(合成)(iii)假設無(vi)來源(C)個體分離物引物A(xi)序列描述SEQIDNO1CGAAGCCGAGNNNGCCGTGGGTC(2)SEQIDNo.2的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(合成的)(iii)假設無(vi)來源(C)個體分離物引物B(xi)序列描述SEQIDNo2GGATGCAAGGATGGATCAGTGCCC(2)SEQIDNo.3的資料(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(合成的)(iii)假設無(vi)來源(C)個體分離物引物C(xi)序列描述SEQIDNo3CTGCGGGCTGGTGCTGGAGCTGCC權利要求1.一種修飾過的脂酶，其中至少相當於野生型類產鹼假單胞菌(PseudomonasPseudoalcaligenes)脂酶21位的甲硫氨酸被另一種胺基酸取代，所述脂酶表現出所需的特性變化。2.根據權利要求1的修飾的脂酶，其中野生型脂酶來源於I型假單胞菌(Pseudomonas)微生物。3.根據權利要求1或2的修飾的脂酶，其中野生型脂酶與類產鹼假單胞菌脂酶有至少70％的同源性。4.根據權利要求1-3之任一的修飾的脂酶，其中21位上的甲硫氨酸被Leu，Ser或Ala取代。5.根據權利要求1-4之任一的修飾的脂酶，表現出改善的洗滌性能。6.一種洗滌劑組合物，含有權利要求1-5之任一的修飾的脂酶。7.權利要求1-5之任一的修飾的脂酶作為洗滌劑組分的用途。8.一種重組DNA序列，其編碼權利要求1-5之任一的修飾的脂酶。9.一種重組DNA載體，其含權利要求8的重組DNA序列並可用於表達修飾的脂酶。10.一種轉化的宿主微生物，其含有權利要求8的重組DNA序列或權利要求9的重組DNA載體。11.根據權利要求10的微生物，轉化的宿主微生物是假單胞菌。12.一種方法，包括在至少相當於類產鹼假單胞菌脂酶Met+21的位置，在編碼假單胞桿菌脂酶的DNA中進行突變，並檢測在由所述突變產生的酶中，所需特性的變化。13.根據權利要求12的方法，其中所述特性變化選自洗滌性能改善、特異性活性改變、pH活性改變、底物活性改變和氧化穩定性提高的一種或多種。全文摘要本發明公開了修飾的脂酶，其中，至少相當於野生型類產鹼假單胞菌脂酶21位上的甲硫氨酸被另一種胺基酸取代，該脂酶表現出所需性質的改變，特別是改善了洗滌性能。優選的實施方案中，所述甲硫氨酸由亮氨酸、絲氨酸或丙氨酸取代。文檔編號C12R1/38GK1108457SQ94190243公開日1995年9月13日申請日期1994年4月27日優先權日1993年4月27日發明者J·M·范·德·蘭,H·B·M·倫廷,L·J·S·M·馬倫納斯,M·M·J·考克斯申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司