靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其應用的製作方法

2023-06-11 09:30:21 1

專利名稱：靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種siRNA，特別涉及一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其應用。
背景技術：
血液腫瘤是發病率較高的惡性腫瘤之一，每年全國約有10萬初發病人，嚴重危害人們、尤其是青少年的健康。T細胞腫瘤是血液腫瘤的一種主要類型，主要由於T細胞惡性克隆增殖而形成，包括多種類型的T細胞白血病和淋巴瘤，多數惡性程度高，治療效果差， 預後不良。臨床治療上一直存在難治療、耐藥和易復發等難題，因此尋找更有效和特異的治療方案一直是研究者的一個重要目標。隨著對腫瘤細胞分子特點的逐漸明確，不斷發現腫瘤T細胞特異的分子，設計和研製有效的靶向治療藥物，成為提高T細胞腫瘤治療效果的一個重要手段。PPP2R5C基因是在1996年被發現並克隆出來的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的一個亞單位，在調節細胞增殖、分化和轉化等過程中具有重要作用，目前研究認為其屬於一種抑癌基因。近期研究提示其表達模式的改變與細胞惡性轉化相關，我們的前期研究也發現 PPP2R5C在T細胞腫瘤中有異常高表達情況。近年來，利用RNA幹擾技術，將化學合成的小幹擾RNA(small interfering RNA, siRNA)轉導至特定的細胞，沉默相關基因的表達，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治療最有吸引力的方法之一。選擇特異性的靶基因合成有效的siRNA，並且選擇合適轉染方式，使其在宿主細胞中高效作用，是實施這一靶向治療措施的重點。靶向針對 PPP2R5C基因的siRNA序列對於開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應用前景和經濟價值。

發明內容
本發明的首要目的在於提供一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的 siRNA，名稱為 PPP2R5C-siRNA991。本發明的另一目的在於提供上述PPP2R5C_siRNA991的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T 細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991，核糖核苷酸序列如下所示正義鏈5，-CA⑶G GUGAU GGCAC UUCUC AAAUA-3，反義鏈5，-UAUUU GAGAA GUGCC AUCAC CACUG-3，。所述的靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C_siRNA991用於製備抑制PPP2R5C基因表達的製劑。所述靶向抑制PPP2R5C基因表達的siRNA應用於製備治療T細胞腫瘤的藥物。所述T細胞腫瘤為T細胞白血病。
本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果1、本發明所提供的PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表達，mRNA的下調程度達到2 4倍，蛋白表達明顯得到抑制，如圖2和圖3所示。2、本發明所提供的PPP2R5C-siRNA991能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖，如圖4所
7J\ ο3、本發明所提供的PPP2R5C_siRNA991對於開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，其具有很大的應用前景和經濟價值。


圖1是實施例1中通過流式細胞儀檢測Molt-4細胞轉染效率圖，其中A為轉染Alexa Red Oligo的柱形圖；B為對照組的柱形圖。圖2是實施例2的實驗組和對照組的實時定量PCR結果圖。圖3是實施例2的實驗組和對照組的PPP2R5C蛋白水平變化Wfestern Blot圖(RNA 幹擾後48h)。圖4是通過Armexin V/PI雙染後流式細胞儀得到的實驗組和對照組的細胞凋亡圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1SiRNA的合成和轉染T淋巴細胞白血病細胞株(Molt_4)(購自中科院上海細胞所)細胞條件的穩定，具體步驟如下(1)設計和得到siRNA在 GenBank (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)裡查找 PPP2R5C 基因序列(ACCESSION NM_178587)，然後根據 hvitrogen 公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth RNAi設計法則，在線設計針對PPP2R5C的siRNA。本發明所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表達的siRNA是從PPP2R5C基因序列991bp開始的25nt siRNA (稱為siRNA-991)，同時設計與目的基因序列無同源性的無關序列siRNA (non-silencing scrambled control, SC,25nt)為對照組，siRNA均由美國hvitrogen公司化學合成。siRNA-991 的序列如下正義鏈序列5，-CAGUG⑶GAUGGCACUUCUCAAAUA-3，；反義鏈序列5，-UAUUUGAGAA⑶GCCAUCACCACUG-3，。無關序列siRNA的序列如下正義鏈序列5，-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3，；反義鏈序列5，-UUACUGG⑶UAAGCUAGGUAGACUA-3，。(2)準備處於對數生長期的Molt-4細胞將Molt-4細胞接種於含體積分數10%新生牛血清、100U/mL青黴素和100U/mL鏈PPP2R5Cf5 ·- GTAATAAAGCGGGCAGCAGG -3 』
PPP2R5Cb5'- CAAAGTCAAAGAGGACGCAACA -3'
β2Μ5'- CAGCAAGGACTGGTCTTTCTAT -3 『
β2Μ5'- GCGGCATCTTCAAACCTC -3 『
黴素的RPMI1640培養基中，在含體積百分數5% CO2的培養箱37°C連續培養，2 3天傳代一次，得到處於對數生長期的Molt-4細胞。(3)PPP2R5C-siRNA991 轉染 Molt-4 細胞A、收集2. 5 X IO6個Molt-4細胞，200g離心lOmin，完全去除上清；B、用 100 μ 1 預熱至室溫的 Nucleofector Solution 和 Supplement 混合液 (Amaxa，德國)懸浮細胞；C、加入 IOOnM Alexa Red Oligo (Invitrogen，美國)，混勻後加入核轉杯(Amaxa, 德國)，啟動Molt-4特異性程序C-005 ；同時設置對照組，對照組為與轉染Alexa Red Oligo 的步驟相同，但是沒有加入Alexa Red Oligo ；D、程序完成後立刻用核轉染試劑盒(Amaxa，德國)裡配套的移液器將轉染後的細胞液接種於培養瓶中，終體積為5ml ；E、放入培養箱10小時後利用螢光顯微鏡和流式細胞儀檢測螢光值，分析轉染效率。通過螢光顯微鏡和流式細胞儀檢測的結果如圖1所示，可見通過上述轉染方法的轉染效率穩定在56. 2 士 14. 14%。實施例2將siRNA-991轉染Molt_4細胞後，檢測PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水平的表達， 明確其幹擾效應。(1)實驗分組實驗組為轉染siRNA-991，對照組分別為無關序列對照組(SC)、轉染條件對照組(MOCK)和空白對照組(NC)，實驗方法同實施例1步驟(3)，各組的siRNA量均為3 μ g。轉染條件對照組系不加入siRNA，其餘處理條件同實驗組，空白對照組是未經任何實驗處理的細胞。(2)螢光實時定量PCR檢測分別收集各組轉染後24h、4 !和72h的細胞，按照 TRIZol試劑盒(invitrogen，USA)說明書操作步驟提取RNA，並使用AMMLV (promega，USA) 和0LIG0 dT合成cDNA (根據AMMLV的說明書操作)。應用於螢光實時定量PCR的引物序列見表1，以β 2M基因作為內參照。總反應體積為20 μ 1，包括Real Master Mix 9yL，上、下遊引物的終濃度分別為0. 5 μ mol/L以及1 μ lcDNA。在95°C、3min變性後，共進行40循環擴增，每一循環包括95°C、10s和62°C、30s。採用相對定量法(2"ctX100%, ACt = Ct目的 Η -Ct # Η)計算PPP2R5C mRNA的相對表達量。結果顯示，轉染後24h、4 i和72h，與各對照組相比，siRNA-991組PPP2R5C的mRNA表達水平均明顯下調，下調倍數約為2 4倍不等(如表2和圖2所示)。表1應用於實時定量PCR的引物序列
^mMi~
5 5 二
弓弓弓弓遊遊遊遊上下上下
5
表2 實時定量PCR檢測轉染後PPP2R5C基因mRNA水平變化
權利要求
1.一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991，其特徵在於其核糖核酸序列如下正義鏈5，-CA⑶G GUGAU GGCAC UUCUC AAAUA-3，； 反義鏈5』 -UAUUU GAGAA GUGCC AUCAC CACUG-3，。
2.權利要求1所述靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991 的應用，其特徵在於所述的PPP2R5C-siRNA991用於製備抑制PPP2R5C基因表達的製劑或用於製備治療T細胞腫瘤的藥物。
3.根據權利要求2所述靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的 PPP2R5C-siRNA991的應用，其特徵在於所述T細胞腫瘤為T細胞白血病。
全文摘要
本發明公開了一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其應用。PPP2R5C-siRNA991的正義鏈為5』-CAGUGGUGAUGGCACUUCUCAAAUA -3』；反義鏈為5』-UAUUUGAGAAGUGCCAUCACCACUG-3』。PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表達，mRNA的下調程度達到2～4倍，蛋白表達明顯得到抑制；同時其能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖。本發明所提供的siRNA對於開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應用前景和經濟價值。
文檔編號A61P35/02GK102382828SQ20111033783
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者劉思初, 李揚秋, 李萡, 楊力建, 沈琦, 鄭海濤, 陳宇, 陳少華 申請人:暨南大學