一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑的製作方法

2023-06-12 00:08:11 1

一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種穩定性強的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，屬於臨床體外檢測【技術領域】。本發明採用單一試劑方法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT），以酶偶聯的連續檢測法為基礎，解決了原有配方中單一試劑中不穩的問題，操作簡單方便，有利於臨床的應用和推廣。
【專利說明】一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，屬於臨床體外檢測

【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)是一種參與人體蛋白質新陳代謝的酶(相當於工業生 產中的催化劑)，起加快體內蛋白質胺基酸在體內轉化的作用，它廣泛存在於人體各種組 織、器官、肌肉、骨骼中，以肝臟細胞的細胞漿中最多，血清中ALT的正常含量參考值是：男 9-51U/L，女8-41U/L (各醫院的測試方法不同，參考值不完全相同)。當人體內各組織器官 活動或病變時，就會把其中的ALT釋放到血液中，使血清ALT含量增加。例如，肝臟發炎時， 轉氨酶就會從肝細胞釋放到血液中，肝臟有病，血清轉氨酶一定增高，當肝細胞千分之一有 炎症時，血清轉氨酶含量就會增高一倍以上，因此，血清轉氨酶數量是肝臟病變程度的重要 指標。
[0003] ALT升高臨床意義就在於對急性B型肝炎、慢性肝炎、HBV攜者、重型肝炎以及肝 硬化、肝癌等一系列病毒性肝炎的診斷和分析，ALT的升高只表示肝臟可能受到了損害。除 了肝炎，其他很多疾病都能引起谷丙轉氨酶轉氨酶升高。
[0004] ALT檢測方法眾多，國內過去多使用比色法檢測血液ALT，目前主要開展的為酶偶 聯的連續檢測法。前者操作簡單，不需要特殊的儀器和試劑，但結果不夠準確，重複性差，效 果不理想；後者結果準確，是公認的好方法，但是對儀器和試劑有一定的要求。現在市面上 多採用的是雙試劑的酶偶聯的連續檢測方法檢測血清ALT，操作步驟較繁瑣，而單試劑的酶 偶聯的連續檢測方法操作簡單方便，但試劑中酶和NADH不穩定，容易造成衰減，這為單試 劑方法檢測血清ALT帶來很大困難。因此本發明針對此問題，特發明了一種穩定性強的單 試劑血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑。


【發明內容】

[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種穩定性強的血液丙氨酸氨基 轉移酶檢測試劑。該試劑配方為單一試劑，操作簡單方便，且試劑具有很好的檢測穩定性。 [0006] 本發明所採用的技術方案是： 一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其特徵在於，它為單一試劑配方，其 組成包括以下組分： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 4〇-60mmol/L L-丙氛酸 400-600mmol/L 氯化鉀 lg/L-10g/L EDTA.Na2 5mmol/L_10 mmol/L 海藻糖 lg/L-lOg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L-lOg/L 二硫蘇糖醇 0· lg/L-10g/L EMERGEN A-60 0. lg/L-10g/L Prod in-300 0· 5ml/L_lml/L a-酮戊二酸 10-20mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1000-14000U/L NADH 0. 15-0. 25mmol/L。
[0007] 作為本發明的一種優選，它的試劑組成為： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L-丙氛酸 500mmol/L 氯化鉀 8g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫蘇糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L α _ 麗戊二酸 15mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
[0008] 本發明試劑的配製方法為：先將Tris、L-丙氨酸、氯化鉀、海藻糖、BSA、EDTA. Na2 、二硫蘇糖醇、EMERGEN A-60和Proclin-300按照配方量依次溶解到IL去離子水中，使用 氫氧化鈉調節溶液pH至7. 8,然後依次加入配方量乳酸脫氫酶（LDH)和NADH溶解於上述溶 液中製備完成。
[0009] 本發明的有益效果是： (1) 本發明採用單一試劑方法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，操作簡單方便，有利 於臨床的應用和推廣； (2) 本配方以酶偶聯的連續檢測法為基礎，解決了原有配方中單一試劑中不穩的問題， 本發明優先選擇了 Tris-EDTA. Na2緩衝體系，Tris-EDTA. Na2緩衝液能夠有效的去除試劑中 重金屬離子對NADH的幹擾，提高了 NADH的穩定性； (3) 本發明在試劑中還添加了二硫蘇糖醇和氯化鉀原材料同樣能夠較好的減緩NADH 在試劑中的哀減，提1?試劑的穩定性； (4) 本發明中還添加了牛血清白蛋白和EMERGEN A-60兩種物質作為保護劑，保護LDH 的活性基團不被破壞，能夠有效的提高LDH生化試劑的穩定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發明實施例1-3與對照1、2組的37°C 7天熱穩定性低值質控試驗結果 圖； 圖2是本發明實施例1-3與對照1、2組的37°C 7天熱穩定性高值質控試驗結果圖； 圖3是本發明實施例1-3與對照1、2組的15天開瓶穩定性低值質控試驗結果圖； 圖4是本發明實施例1-3與對照1、2組的15天開瓶穩定性高值質控試驗結果圖； 圖5是本發明實施例1-3與對照1、2組的37°C 7天熱穩定性試劑空白趨勢圖； 圖6是本發明實施例1-3與對照1、2組的15天開瓶穩定性試劑空白趨勢圖。

【具體實施方式】
[0011] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0012] 實施例1 一種穩定性強的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其試劑組成為： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 40mmol/L L-丙氛酸 400mmol/L 氯化鉀 lg/L EDTA-Na2 5mmol/L 海藻糖 lg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L 二硫蘇糖醇 〇. lg/L EMERGEN A-60 0. lg/L Prod in-300 0. 5ml/L α _ 麗戊二酸 lOmmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1000U/L NADH 0·15mmol/L 。
[0013] 上述試劑的配製方法為：先將Tris、L-丙氨酸、氯化鉀、海藻糖、BSA、EDTA. Na2、 二硫蘇糖醇、EMERGEN A-60和Proclin-300按照配方量依次溶解到IL去離子水中，使用氫 氧化鈉調節溶液pH至7. 8,然後依次加入配方量乳酸脫氫酶（LDH)和NADH溶解於上述溶液 中製備完成。
[0014] 實施例2 一種穩定性強的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其試劑組成為： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) BOmmoI /T, L-丙氛酸 600mmol/L 氯化鉀 l〇g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 l〇g/L 牛血清白蛋白（BSA) l〇g/L 二硫蘇糖醇 l〇g/L EMERGEN A-60 10g/L Proclin-300 lml/L α _ 麗戊二酸 20mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 14000U/L NADH 0·25mmol/L 。
[0015] 本實施例試劑製備方法同實施例1。
[0016] 實施例3 一種穩定性強的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其試劑組成為： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L-丙氛酸 500mmol/L 氯化鉀 8g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫蘇糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L α _ 麗戊二酸 15mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
[0017] 本實施例試劑的製備方法同實施例1。
[0018] 將本發明實施例1-3製得的試劑進行穩定性試驗驗證。驗證試驗分為15天開平 穩定性和7天37°C熱穩定性驗證。以市場上現有的某公司生產的單試劑丙氨酸氨基轉移酶 檢測試劑作為對照1，以市場上現有的北京某公司出售的雙試劑丙氨酸氨基轉移酶檢測試 劑ALT(14-0912P)作為對照2,進行對比驗證試驗。
[0019] 試驗所用校準品和質控品分別為： 校準品：朗道複合標準（848UN)其中ALT的含量為38U/L 質控品：朗道複合高值質控：620UE(ALT靶值：131 U/L，靶值範圍：105-157U U/L);朗 道複合低值質控：897UN(ALT靶值：38U/L，靶值範圍：30-46U/L)。
[0020] 試劑穩定性驗證具體操作方法： 首先將本發明實施例1-3中的檢測試劑按照配方配置好並分別命名為1-3試驗組，取 市場上現有的一種單試劑丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑作為對照1組，取市場上現有的某公 司出售的雙試劑丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑作為對照2組；分別自上述5組試劑中各取相 同的兩組，一組做15天開瓶穩定性試驗，將試劑開瓶放置在儀器的2-8°C冷藏箱中（15天不 取出），作為15天開瓶穩定性檢測；另一組做37°C熱穩定性檢測，封閉放置在37°C恆溫水浴 鍋中（每天僅在檢測的時候取出，檢測完畢後，依然封口放回37°C水浴鍋中，連續7天)，作 為7天37°C熱穩定性驗證試驗。將對照2組試劑按照常規雙試劑檢測方法在東芝-120全 自動生化分析儀器進行檢測，將實施例1-3和對照1組試劑同時在東芝-120全自動生化分 析儀器上按照如下表1方法進行檢測，並在儀器上建立標準曲線。分別取朗道的高、低值凍 乾粉質控品，溶解均勻後，各自平均分成15份，-20°C儲存，每天高、低值質控各取一個，並 且跟蹤檢測結果，其跟蹤監測趨勢如圖1-4。每天檢測各組試劑的試劑空白，檢測結果如圖 5,圖 6。
[0021] 表I ALT (丙氨酸氨基轉移酶）檢測試劑檢測方法

【權利要求】
1. 一種穩定性強的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其特徵在於，它為單一試劑配方， 其組成包括以下組分： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 4〇-60mmol/L L_ 丙氛酸 400-600mmol/L 氯化鉀 lg/L-10g/L EDTA. Na2 5mmol/L_10 mmol /T, 海藻糖 lg/L-lOg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L-lOg/L 二硫蘇糖醇 0? lg/L-lOg/L EMERGEN A-60 0. lg/L-10g/L Prod in-300 0? 5ml/L_lml/L a-酮戊二酸 10-20mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1000-14000U/L NADH 0?15-0. 25mmol/L。
2. 根據權利要求1所述的血液丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑，其特徵在於，它的試劑組 成為： Tris 緩衝液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L_ 丙氛酸 500mmol/L 氯化鉀 8g/L EDTA. Na2 10 mmol /T, 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫蘇糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L a _ 麗戊二酸 15mmol/L 乳酸脫氫酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
【文檔編號】C12Q1/32GK104404127SQ201410698137
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】楊君莉, 羅維曉, 甘宜梧, 譚柏清, 王綺, 朱玉娥, 肖慧 申請人:山東博科生物產業有限公司