一種基於pcr-elisa的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法

2023-06-12 02:40:51

專利名稱：一種基於pcr-elisa的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥體外診斷試劑領域，更具體地講，涉及一種基於PCR-ELISA 的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法。
背景技術：
長期以來結核分枝桿菌藥敏試驗一直是結核病細菌學診斷中十分重要的技術。但傳統的結核病藥敏檢測方法為表型耐藥檢測方法，建立在結核分枝桿菌的培養基礎之上，通常需要4到6周的時間，遠不能滿足臨床治療的需要。隨著基於PCR技術的分子生物學診斷技術的發展及結核病耐藥分子機制的逐步闡明，依據分子生物學技術檢測結核桿菌耐藥基因檢測方法也得到了迅速的發展。目前， 特別是基於反向系列探針雜交技術的PCR-ELISA方法對臨床結核桿菌進行快速藥敏檢測顯示了極大的應用前景。與目前常規的實驗室鑑定方法和其它分子鑑定方法相比，具有下列優勢首先，它可以一次實驗同時對多種耐藥基因的多種基因位點進行快速基因型別鑑定，具有檢測信息量大的特點。其次，它可以直接對臨床痰標本進行檢測，因此，實驗室常規的結核桿菌藥敏檢測時間可以從目前的4 - 6周縮短至6個小時，真正可能起到對指導臨床醫生及早準確用藥的作用。此外，同DNA序列測定和最近幾年發展的DNA晶片技術相比， 該技術無需額外添置貴重儀器，即可以在大多數臨床實驗室進行推廣應用。因此PCR-ELISA 方法是一項非常適合在發展中國家臨床實驗室開展使用的新型耐藥基因快速檢測技術。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種特異性好、準確度高且適用於大規模檢測的基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法。為了解決上述問題，本發明提供一種基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法，包括以下步驟(1)針對rpoB基因突變位點(依據Genbank中結核分枝桿菌標準株 H37Rv的全基因序列和rpoB基因序列，GenBank登錄號L27989)設計11個探針，且將所述探針點樣於96微孔板；(2)每一個檢測樣本的DNA分3個反應管，每管中都加入rpoB-F和 rpoB-R兩種引物，每對引物中的下遊5』端均帶有地高辛標記，經PCR擴增出大量含有所述地高辛標記的結核分枝桿菌相應的基因片段產物；(3)將所述擴增產物與所述探針進行特異性雜交，雜交後帶有所述地高辛標記的目標基因與所述探針結合在一起，洗去未結合的片段，通過ELISA反應，測量OD值得出結果。步驟(1)中11個探針分別為
MTC :5，-CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3，，序列如 SEQ ID N0:1 所示； Rffl :5，-CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3，，序列如 SEQ ID NO:2 所示； RW2 :5，-AATTCATGGACCAGAACAACCC-3，，序列如 SEQ ID N0:3 所示； RW3 :5，-CCGCTGTCGGGGTTGACC-3，，序列如 SEQ ID N0:4 所示； RW4 :5，-GTTGACCCACAAGCGCCGA-3，，序列如 SEQ ID N0:5 所示； RW5 :5，-GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3，，序列如 SEQ ID N0:6 所示；RM2 5' -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3，，序列如 SEQ ID NO:7 所示； RM4a :5，-GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3，，序列如 SEQ ID NO:8 所示； RM4b :5，-GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3，，序列如 SEQ ID NO:9 所示； RM5a :5，-GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3，，序列如 SEQ ID NO: 10 所示； RM5b :5，-GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3，，序列如 SEQ ID NO: 11 所示。步驟(2)中兩種引物分別為
rpoB-F :5，-GTGGTCGCCGCGATCAAG-3，，序列如 SEQ ID N0:12 所示； rpoB-R :5，-CACGTCGCGGACCTCCAG-3，，序列如 SEQ ID N0:13 所示。其中，RWl — RW5覆蓋了 rpoB耐藥基因的81個鹼基突變熱點區，而RM2至RlKb的 5 條探針分別檢測 R516 (GTC)、R526 (TAC)、R526 (GAC)、R531 (TTG)和 R531 (TGG) 5 個高頻率耐藥基因的突變位點。本發明的有益效果主要是
(1)特異性好擴增的特異性及探針雜交的特異性使本方法具有較高的特異性；(2) 準確度高採用PCR技術，數量極少的結核分枝桿菌耐藥基因以幾何倍數擴增，提高了靈敏度，同時特異性達到100% ； (3)價格低廉使用普通ELSIA設備即可完成，結果觀察方便； (4)適用於大規模檢測96微孔板使得一次性完成多次試驗，可以同時對大量的不同結核分枝桿菌臨床株進行檢測。與常規PCR相比，不需要對產物進行電泳、避免使用溴化乙錠等毒性物質；檢測中所用的耗材成本也較便宜，而且保證了較高的特異性和靈敏度等優點。操作快速簡便又安全可靠，適用於對結核分枝桿菌耐藥基因檢測並對結核分枝桿菌進行初步菌種鑑定。本發明應用該方法設計了一個放置11條探針的多重寡核苷酸探針陣列，可以快速檢測與RFP耐藥相關的rpoB基因的鹼基突變，並同時可對結核分枝桿菌複合群進行鑑別診斷。應用本發明建立的方法檢測52株耐多藥結核分枝桿菌，47株(90.4%)在rpoB突變熱點區檢出突變。與rpoB的PCR產物測序結果對比分析，探針陣列上野生型探針和突變型探針檢測RFP耐藥rpoB的序列與DNA測序的結果符合率均為是100%(52/52)。PCR-ELISA 雜交方法通過一次雜交實驗即可同時快速獲得結核分枝桿菌對多個臨床分離株的藥物耐受信息，使得結核分枝桿菌分離株耐藥性檢測從常規的4 - 6周的時間縮短到6 - 8h，充分顯示了該方法的優越性。因此該方法有可能發展成為應用於臨床快速耐藥檢測的新方法， 這種基於PCR-ELISA的反向系列探針雜交方法也可以用於耐多藥結核病的流行病學調查和研究，為耐藥結核病的控制起到重要作用。


圖1為PCR-ELISA檢測結核分枝桿菌耐藥基因rpoB。列第1列Control為探針空白對照，第2-12列MTC - RlKb分別為探針名稱；行第1-8行分別為待測的菌株標本號。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
做詳細說明。1、模板DNA的製備待測標本中結核分枝桿菌的DNA提取，取臨床分枝菌株置於1. 5 ml離心管中，溶於0. 5 mlTE液，14000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩禍混勻，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min, IOmin,取上清液。2、PCR 反應
a、配製3X504 1^反應體系每反應管中引物印08寸、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 PL，模板DNA 0.5 μ L, dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，總體積50 μ L。其中引物的靶基因為rpoB 基因(GenBank 登錄號L27989)
其中下遊引物的5丨端均用地高辛標記，引物序列分別為 rpoB-F 5』 -GTGGTCGCCGCGATCAAG-3』 rpoB-R 5』 -CACGTCGCGGACCTCCAG-3，
b、混勻反應體系，PCR反應程序設置如下預變性95°C，5min ；進入循環，94 V變性30s， 58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35個循環；循環結束後72°C延伸15min，冷卻至4°C備用。3、特異探針進行ELISA反應
①包被用鏈黴親合素( ο μ g / ml)包被96孔酶標板，4°C過夜。②固定第1列設為空白對照，不加標記探針，其他操作相同。從第2列開始，每列分別加入生物素標記的探針(3 pmol / ml)。第2列加入1個用於菌種初步鑑定的探針，可以鑑定出是否是結核分枝桿菌複合群。從第3列開始，依次加入10個用於結核分枝桿菌耐藥基因檢測的探針。用於菌種初步鑑定的1個DNA探針命名為MTC，其探針序列為 MTC 5' -CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3'
結核分枝桿菌檢耐藥基因檢測的探針分別為 Rffl5' -CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3『
RW25』 -AATTCATGGACCAGAACAACCC-3』
RW35' -CCGCTGTCGGGGTTGACC-3『
RW45' -GTTGACCCACAAGCGCCGA-3『
RW55' -GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3'
RM25』 -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3』
RM4a5' -GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3'
RM4b5』 -GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3』
RM5a5' -GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3'
RM5b5』 -GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3』。③變性將地高辛標記的PCR產物，95°C變性lOmin，然後迅速冰浴。④雜交將地高辛標記的PCR產物與5XSSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 在58°C溫水浴中雜交池。洗去未雜交的PCR產物。⑤加入酶標抗體每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗體標記的辣根過氧化氫酶，孵育30min。洗板。⑥顯色檢測每孔加入100 μ 1顯色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室溫，lOmin，然後每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04終止反應。4、用酶標儀測定OD值，觀察結果Cut off值=陰性對照組OD值(450nm)的算術平均值+3倍標準差，凡檢測孔的OD值 (450nm )大於Cut off值者判定為雜交陽性，小於Cut off值者為雜交陰性。實施例1
待測標本1例大腸桿菌株，1例結核分枝桿菌H37Rv株，3例非結核分枝桿菌分別為鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和恥垢分枝桿菌；1例臨床結核分枝桿菌rpoB基因野生型株、2例為臨床結核分枝桿菌rpoB基因突變型株。1、模板DNA的製備
取分枝菌株置於1. 5 ml離心管中，溶於0. 5 mlTE液，14000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩渦混勻，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min，取上清液。2、PCR 反應
a、配製3X50 4 1^反應體系每反應管中引物印08呼、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 μ L，模板DNA 0. 5 μ L，dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，總體積50 μ L。其中引物的靶基因為 rpoB基因的突變熱點區。b、混勻反應體系，PCR反應程序設置如下預變性95°C，5min ；進入循環，94°C變性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35個循環；循環結束後72°C延伸15min，冷卻至4°C備用。3、特異探針進行ELISA反應
①包被用鏈黴親合素(10μ g / ml)包被酶標板，4°C過夜。②固定從第2列開始加探針，第2列加入MTC探針，3-7列分別加入RW1、Rff2, Rff3, Rff4和RW5共5個野生型探針，8_12列分別加入冊2、RM4a、冊4b、RM5a和RM5b共 5個突變型探針。加入生物素標記探針濃度3 pmol / ml。③變性將地高辛標記的PCR產物，95°C變性lOmin，然後迅速冰浴。④雜交將地高辛標記的PCR產物與5 X SSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 PCR產物加入的順序第1行加入大腸桿菌株，第2行結核分枝桿菌H37Rv株，第3_5行加入分類上屬於非結核分枝桿菌的鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和恥垢分枝桿菌；第6行加入臨床結核分枝桿菌rpoB基因野生型菌株、第7-8行分別加入臨床結核分枝桿菌rpoB基因突變型菌株。在58°C溫水浴中雜交池。⑤加入酶標抗體每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗體標記的辣根過氧化氫酶，孵育30min。⑥顯色檢測每孔加入100 μ 1顯色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室溫，lOmin，然後每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04終止反應。4、用酶標儀測定OD值，觀察結果
結果見附圖1，第1行，所有各列的檢測結果均為雜交陰性；第2行，第1列對照檢測陰性，第2列陽性，3-7列RffU Rff2, Rff3, RW4和RW5共5個野生型探針均檢測陽性，8-12列 RM2、RM4a、RM4b、RM5a和RlKb共5個突變型探針均檢測陰性；第3_5行的三個非結核分枝桿菌，第1列對照檢測陰性，第2列陰性，3-12無明顯雜交顯色結果，檢測陰性；第6行的1例臨床結核分枝桿菌rpoB基因野生型，第1列對照檢測陰性，第2列陽性，3-7列RW1、 Rff2, Rff3, RW4和RW5共5個野生型探針均檢測陽性，8-12列RM2、RM4a、RM4b、RM5a禾口
6RM5b共5個突變型探針均檢測陰性，經DNA測序驗證，結果吻合；第7行的1例臨床結核分枝桿菌rpoB基因突變型，第1列對照檢測陰性，第2列陽性，3-6列RW1、Rff2, Rff3, RW4共 4個野生型探針均檢測陽性，第7列RW5野生型探針檢測陰性，但第11列RMfe突變型探針陽性，說明該菌株在rpoB的531胺基酸位點發生鹼基突變，為耐藥株，經DNA測序驗證，結果吻合；第8行的1例臨床結核分枝桿菌rpoB基因突變型，第1列對照檢測陰性，第2列陽性，3-7列中的RW1、RW2、RW3、RW5共4個野生型探針均檢測陽性，而第6列的RW4野生型探針檢測陰性，但第10列的RM4b突變型探針陽性。說明該菌株在rpoB的5 胺基酸位點發生鹼基突變，為耐藥株，經DNA測序驗證，結果吻合。說明該探針陣列可以很好工作，用於結核分枝桿菌耐藥檢測和初步菌種鑑定。實施例2
1、細菌DNA的製備156株結核分枝桿菌臨床分離株來源於臨床住院患者，依《全國結核病診斷細菌學檢驗規程》進行結核分枝桿菌培養，並對結核分枝桿菌複合群與非結核分枝桿菌進行初步鑑定和藥敏分析。取臨床分枝菌株置於1.5 ml離心管中，溶於0.5 mlTE 液，14000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入100 μ L 1% TritonX-100裂解液，漩渦混勻，100°C水浴15 min，立即冰浴3 min ； 140000 r/min，取上清液。2、PCR 擴增
a、配製3X50 4 1^反應體系每反應管中引物印08寸、印08-1 各2 μ L, IOXBuffer 5 PL，模板DNA 0.5 μ L, dNTPs 2 μ L，Taq酶2U，總體積50 μ L。其中引物的靶基因為rpoB 基因的突變熱點區。b、混勻反應體系，PCR反應程序設置如下預變性95°C，5min ；進入循環，94°C變性 30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共；35個循環；循環結束後72°C延伸15min，冷卻至4°C備用。3、特異探針進行ELISA反應
①包被用鏈黴親合素(10μ g / ml)包被酶標板，4°C過夜。②固定從第2列開始，每列分別加入生物素標記探針(3 pmol / ml)。③變性將地高辛標記的PCR產物，95°C變性lOmin，然後迅速冰浴。④雜交將地高辛標記的PCR產物與5XSSC按1 :9混合均勻，每孔加入100 μ 1。 在55°C溫浴中雜交池。⑤加入酶標抗體每孔加入100 μ 1 (1 :1000)抗地高辛抗體標記的辣根過氧化氫酶，孵育30min。⑥顯色檢測每孔加入100 μ 1顯色混合液(ΤΜΒ-Η202)，室溫，lOmin，然後每孔加入100 μ 1 2Μ H2S04終止反應。4、用酶標儀測定OD值，觀察結果
應用寡核苷酸探針陣列鑑定結核分枝桿菌臨床分離株156例，經培養初步鑑定為結核分枝桿菌複合群的139株臨床分離株均與群特異探針MTC雜交陽性；經培養初步鑑定為非結核分枝桿菌的17株臨床分離株除均與群特異探針MTC雜交陰性。應用寡核苷酸探針陣列檢測結核分枝桿菌臨床分離株156例，112結核分枝桿菌藥敏檢測結果為敏感的菌株中，所有菌株均為野生型探針雜交陽性，耐藥型探針雜交陰性。 檢測27例耐藥菌株的rpoB的突變熱點區，25株(92. 6%)檢出突變。僅2株未檢出rpoB基
7因突變，但經測序驗證，此兩種菌株的rpoB基因未發生突變，說明二者結果一致。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)針對rpoB基因突變位點設計11個探針，且將所述探針點樣於96微孔板；(2)每一個檢測樣本的DNA分3個反應管，每管中都加入rpoB-F和rpoB-R兩種引物，每對引物中的下遊引物5』端均帶有地高辛標記，經PCR擴增出大量含有所述地高辛標記的結核分枝桿菌相應的基因片段產物；(3)將所述擴增產物與所述探針進行特異性雜交，雜交後帶有所述地高辛標記的目標基因與所述探針結合在一起，洗去未結合的片段，通過ELISA反應，測量 OD值得出結果。
2.根據權利要求1所述的一種基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法，其特徵在於，步驟(1)中11個探針分別為MTC5' -CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3'Rffl5' -CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3『RW25』 -AATTCATGGACCAGAACAACCC-3』RW35' -CCGCTGTCGGGGTTGACC-3『RW45' -GTTGACCCACAAGCGCCGA-3『RW55' -GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3'RM25』 -AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3』RM4a5' -GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3'RM4b5』 -GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3』RM5a5' -GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3'RM5b5』 -GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3』。
3.根據權利要求1所述的一種基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法，其特徵在於，步驟(2)中兩種引物分別為rpoB-F 5』 -GTGGTCGCCGCGATCAAG-3』 rpoB-R 5』 -CACGTCGCGGACCTCCAG-3，。
全文摘要
本發明提供一種基於PCR-ELISA的結核分枝桿菌耐藥基因檢測方法，包括以下步驟(1)針對rpoB基因突變位點設計11個探針，並將之點樣於96微孔板；(2)每一個檢測樣本的DNA均分3個反應管同時擴增，每管加入rpoB-F和rpoB-R兩種引物，每對引物中的下遊引物5』端均用地高辛標記，經PCR擴增出大量含有地高辛標記的結核分枝桿菌相應的基因片段產物；(3)將擴增產物與探針進行雜交，雜交後帶有地高辛標記的目標基因與探針結合在一起，洗去未結合的片段，通過ELISA反應，測量OD值得出結果。本方法提供了一次雜交實驗即可快速獲得結核分枝桿菌對多個臨床分離株的藥物耐受信息，使得結核分枝桿菌分離株耐藥性檢測縮短到6－8h，充分顯示了該方法的優越性。
文檔編號C12Q1/68GK102465177SQ20101054136
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優先權日2010年11月12日
發明者唐神結, 孫戰強, 張舒林, 張穎, 王洪海, 郭曉奎 申請人:上海交通大學醫學院