用轉基因技術提高林木抗旱性的方法
2023-06-11 08:42:16 1
專利名稱：用轉基因技術提高林木抗旱性的方法
技術領域：
本發明涉及利用轉基因技術提高林木抗旱性的方法。
背景技術：
乾旱、低溫和鹽鹼是影響植物分布、生長和作物產量的一個主要因素。應用植物基因工程方法培育抗旱、抗凍與耐鹽鹼植物新品種已成為現代植物育種的一個重要內容。對植物在乾旱、低溫與高鹽等脅迫環境下的應答反應機制的闡明是其中一個重要部分。近年來，在擬南芥、西紅柿、菸草、水稻、玉米和大豆等多種植物中發現了一類新的轉錄因子，這些轉錄因子因含有保守的AP2/EREBP DNA結合域而被稱為AP2/EREBP轉錄因子。AP2/EREBP轉錄因子調控(激活或抑制)植物體內乾旱、低溫與高鹽脅迫應答基因的表達，在植物脅迫應答與耐受逆境中發揮著重要的作用。
轉錄因子，也稱為反式作用因子或DNA結合蛋白，是能夠與基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性相互作用的DNA結合蛋白。植物許多誘導型基因定時、定量表達，都是由特定的轉錄因子與特定的順式作用元件的相互作用所調控。劉強等1998年用酵母單雜交技術從擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)中分離得到五個DRE元件結合蛋白(DRE binding protein)基因，分別命名為DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B。這五個基因可以分為兩類DREB1和DREB2，它們都含有AP2/EREBP結構域，但DREB1的表達受低溫誘導，DREB2受乾旱和高溫的誘導(Qiang Liu，Mie Kasuga，Yoh Sakuma，Hiroshi Abe，etal.The Plant Cell，1998，101391-1406)。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用轉基因技術提高林木抗旱性的方法，將DREB2A基因用於抗旱性林木新品種的培育。包括1.將DREB2A與植物表達載體構建pBin438嵌合體將目的基因DREB2A用雙酶切從克隆載體pBlueScriptII SK(+)上切下，純化後連接到pBin438載體上，得到DREB2A/pBin438嵌合體。
2.林木抗逆性的分子改良工作將DREB2A/pBin438嵌合體轉化農桿菌LBA4404，通過平板培養選擇含有嵌合體基因的農桿菌菌株。通過葉圓盤法將目的植物組培苗葉片與上述農桿菌工程菌共培養，經誘導愈傷和分化篩選得到轉基因植株。
3.對所得抗旱轉基因植株，用TTC法進行植株抗旱性測定，進而篩選抗旱植物新品種。
其中，本發明所用之DREB2A基因來源於擬南芥，其全長cDNA序列已在GenBank註冊，註冊號為AB007790。所用克隆載體為pBlueScriptII SK(+)，DREB2A在EcoRI位點插入。本發明人通過轉化大腸桿菌菌株DH5；來擴增DREB2A/SK嵌合體基因。通過質粒提取提到該嵌合體，質粒提取法按照已知的鹼裂解法進行。通過SalI和BamHI雙酶切將DREB2A基因從pBlueScriptIISK(+)上切下，以瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收1.4kb左右大小的片段，得到DREB2A目的基因。
植物表達載體pBin438用大腸桿菌JM109菌株進行擴繁，按前述方法提取質粒。同樣用SalI與BamHI進行雙酶切。通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收13kb左右大小的片段。將上述回收之DREB2A與回收之pBin438按4∶1以上比例進行混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌，通過平板培養篩選單菌落得到DREB2A/pBin438嵌合體基因。進一步擴繁後提取DREB2A/pBin438嵌合體，轉化得到農桿菌工程菌。
將農桿菌工程菌與毛白楊、刺槐等植物組培苗的幼嫩葉片進行共培養，有關過程按已知的葉圓盤法進行。通過抗生素抗性篩選得到轉基因植株。並對轉基因植株進行PCR、Southern及Northern分析，證明外源基因已經整合到抗旱轉基因植株中。
氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Tripheyl Tetrazolium Chloride，TTC)被廣泛用作酶實驗的氫受體，植物根所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性，並作為根系活力的指標。按照王華芳等的方法對轉基因植株進行乾旱處理(王華芳、尹偉倫、張建華等，林業科學，2000，362-8)，修改趙士傑等的方法對轉基因植株進行耐旱性生理測定(趙士傑、劉華山、董新純，植物生理學實驗指導，北京農業科學技術出版社，199854-56)。確定所得轉基因植株抗旱性已經得到改良。進而通過組織培養技術進一步快速擴繁所得轉基因新品種。
具體實施例方式
實施例一植物表達載體的構建
1.目的基因的製備將擬南芥DREB2A基因與pBlueScriptII SK(+)質粒的融合基因轉化大腸桿菌菌株DH5；，用含氨苄青黴素50mg/L的LB培養基37℃200rpm過夜培養。用鹼裂解法提取質粒DNA。用BamHI與SalI雙酶切DREB2A/pBlueScriptII SK(+)嵌合體，反應按SalI體系進行，加入同樣濃度的BamHI酶，37℃消化30分鐘。用1％瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收約1.4kb大小的片段，即得到處理好的DREB2A基因。
2.載體DNA的製備所用植物表達載體pBin438為卡那黴素抗生素篩選、具有雙增強子的35S強啟動子。將pBin438轉化JM109大腸桿菌菌株，用含卡那黴素50mg/L的LB培養基37℃200rpm過夜培養。用鹼裂解法提取質粒DNA。用BamHI與SalI雙酶切此質粒，反應按SalI體系進行，加入同樣濃度的BamHI酶，37℃消化3小時。用1％瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收約13kb大小的片段，即得到處理好的表達載體pBin438。
3.嵌合基因的構建將上述處理的pBin438和DREB2A基因按1∶4以上比例進行混合，用T4 DNA連接酶，16℃過夜反應。連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5，用含卡那黴素50mg/L的LB固體培養基進行平板培養，待菌斑長至2mm直徑大小時，挑取進行含卡那黴素50mg/L的LB培養基37℃200rpm過夜培養。
按鹼裂解法提取DREB2A/pBin438嵌合基因，分別通過SalI-XhoI、SalI-SmaI和HindIII三組酶切籤定所構建DREB2A/pBin435嵌合基因方向正確，二者連接無誤。
實施例二DREB2A基因在毛白楊、刺槐等植物中的轉化1.農桿菌工程菌的製備上述DREB2A/pBin438嵌合基因按Horsch方法轉化農桿菌菌株LBA4404(Horsch RB，Fry JE，Hoffman NL.，Science 1985，2271229-1231)，轉化菌液用含50mg/L卡那黴素和50mg/L鏈黴素的YEP固體培養基塗平板，待菌斑長至2mm直徑大小時，挑取進行含卡那黴素50mg/L和50mg/L鏈黴素的YEP培養基28℃200rpm培養48小時。
2.植物葉盤法轉化含DREB2A/pBin438嵌合基因的農桿菌接種於5ml含卡那黴素50mg/L和鏈黴素50mg/L的YEP培養基中，28℃200rpm培養過夜；用1/2MS稀釋30倍用於共培養。將無菌苗葉片邊緣和中脈用手術刀切去，沿與中脈垂直方向將葉片切成5-8mm寬的葉條，葉片切割後立即放入農桿菌菌液中浸泡30-40分鐘。用鑷子取出共培養的葉片，放到滅菌的濾紙上吸去過多的菌液，葉條移入含有共培養培養基的平皿中，28℃暗培養48小時。
3.轉化植株的篩選將共培養葉片轉移到含300mg/L卡那黴素和500mg/L羧苄青黴素的愈傷組織培養基上，使轉化葉片充分接觸培養基，有利於營養和激素的吸收，以及卡那黴素損傷未轉化的細胞。兩周後，將葉片轉移到含同樣抗生素的分化誘導培養基上，誘導分化芽的產生。每2-3天觀察一次，小心切下小芽轉移到含100mg/L卡那黴素和500mg/L羧苄青黴素的生跟培養基上，誘導生跟；每3-7天觀察一次，將生跟的植株轉移到含相同培養基的較大的容器中培養。
4.轉化植株的田間移植小心取出植株，清洗其跟部的瓊脂，將植株轉移到含10ml 1/10 MS無機鹽溶液的容器中，稍打開蓋子幾小時。之後將植株移栽到溼潤的土壤裡；並用玻璃器皿或塑膠袋罩上，直到新的根系形成後再移開。
實施例三TTC法測定植物抗旱性1.植物抗旱性處理苗木種植在土壤體積分別為3.4×10-3m3和11.5×10-3m3的大小明顯不同的兩種塑料盆裡，同時澆水一次，澆透使土壤含水量達到飽和，以後不再澆水使土壤自然乾旱。小盆土壤較大盆的慢因此形成急性乾旱和緩慢乾旱處理。為跟蹤土壤乾旱過程中的土壤含水量以及在植株乾旱的生理狀態基本相同的條件下恢復澆水，土壤乾旱處理到植株出現明顯乾旱症狀如葉片發白下垂時，再恢復澆水。
2.TTC法對植物根系抗旱性的定性測定將植物根仔細洗淨，從莖基切除其地上部分，然後放入三角瓶；將1％TTC溶液，0.4mol/L琥珀酸鈉和磷酸緩衝液按1∶5∶4比例混合，製成反應液。將根浸於反應液中，暗處37℃放置1小時。觀察，新根尖端幾毫米以及側根都明顯變成紅色，則表明該處有脫氫黴存在，根尚具有呼吸作用，植物具活力。
權利要求
1.一種提高林木抗旱能力的方法，包括a.將DREB2A與植物表達載體構建嵌合體；b.用上述嵌合體，用轉基因方法進行林木抗逆性的分子改良工作；c.對上述抗旱轉基因植株，進行植株抗旱性測定，進而篩選抗旱植物新品種。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的DREB2A基因為來源於擬南芥。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，本發明所用的植物表達載體是pBin438。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的林木是毛白楊、刺槐、美洲黑楊、國槐、月季、菊花。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的抗逆性是指抗旱、耐旱性、抗凍性、耐受低溫性和抗鹽、耐鹽性。
6.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，本發明用TTC法對植株抗旱性進行測定。
全文摘要
本發明提供了一種利用轉基因技術提高林木抗旱性的方法，包括將來源於擬南芥的DREB2A基因向植物表達載體pBin438的構建，用得到的嵌合體通過葉圓盤法轉化目的植物組培苗葉片，經誘導愈傷和分化篩選得到轉基因植株。用本方法建立的轉基因技術平臺進行楊樹、槐樹等植物的轉基因工作，通過抗生素抗性篩選得到轉基因植株。並對轉基因植株進行PCR、Southern及Northern分析，證明外源基因已經整合到抗旱轉基因植株中。通過TTC法從生理水平上測定植物根系耐旱性活力。進而通過組織培養技術與田間中試進一步選育優良抗性轉基因林木新品種。
文檔編號A01H5/00GK1544626SQ20031011534
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年11月20日
發明者曾會明, 王華芳, 尹偉倫, 陳受宜, 劉強, 夏新莉 申請人:北京林業大學