一種金花茶組培繁育方法與流程
2023-06-03 07:07:06 1
本發明屬於植物組培繁育領域，具體涉及一種金花茶組培繁育方法。
背景技術：
金花茶屬於山茶科、山茶屬，與茶、山茶、南山茶、油茶、茶梅等為孿生姐妹，是國家一級保護植物之一。金花茶的花金黃色，耀眼奪目，仿佛塗著一層蠟，晶瑩而油潤，似有半透明之感。金花茶單生於葉腋，花開時，有杯狀的、壺狀的或碗狀的，嬌豔多姿，秀麗雅致。以前，人們沒有見到過花色金黃的種類。1960年，中國科學工作者首次在廣西防城一帶發現了一種金黃色的山茶花，被命名為金花茶。國外稱之為神奇的東方魔茶，被譽為「植物界大熊貓」、「茶族皇后」。
然而，傳統的茶花繁殖方法(扦插、嫁接、壓條、播種)對金花茶的植株和種子材料需求量大，嚴重製約珍稀瀕危金花茶物種的保護和大量繁殖；同時，這一繁育瓶頸也使得一些名貴的結實率低的茶花雜交新品種難以擴大推廣。因此，實現金花茶的快速繁殖是當前金花茶育種工作者的當務之急。
植物組織培養是在無菌條件下，將植物的離體器官、組織、細胞或原生質體，培養在人工配製的培養基上，人為控制培養基條件，使其生長、分化、增殖，發育成完整植株的過程。由於組織培養是在脫離植物母體的條件下進行的，所以也稱為離體培養。植物組織培養具有所需植株原材料少，不受生長季節限制，培養周期短，變異低，可保持母本的優良遺傳特性等優點；因此，植物組織培養技術可用於拯救瀕危植物，解決植物產種子少或無而無法大量繁殖的難題。植物組織培養技術無疑是茶花育種工作者的福音，這為金花茶的繁育提供了更加可行的方案，避免了雜交一代的純種選育工作，大大縮短了育種期限。已有茶花育種工作者進行了相關方面的研究，李建安等(2003)對小果油茶和廣寧紅花油茶的花葯進行離體培養，並誘導形成愈傷組織；陳麗華(2007)等以雲南紅花油茶的嫩芽及帶芽嫩莖段為外植體材料，研究探索其莖尖組織培養的外植體處理方法和叢芽誘導培養基，篩選出了雲南紅花油茶較適宜的叢芽誘導培養基；高宇瓊和賴鍾雄(2010)以金花茶子葉胚切塊和成年植株葉片為材料，進行愈傷組織培養研究，成功誘導出愈傷組織，並能較好地繼代。
技術實現要素：
針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種金花茶組培繁育方法，該種組培繁育方法不受季節影響，培育時間短，繁殖速率快，解決了目前金花茶種質資源稀少，結果率低等問題，實現了金花茶良種低成本大規模繁育。
為了達到上述目的，本發明通過以下技術方案來實現的：
一種金花茶組培繁育方法，按照以下步驟進行：
(1)外植體的選擇及消毒：選取健康無病的金花茶種子作為外植體，先將種子經流水衝洗2-4min後，在超淨工作檯上用體積百分數為75％的乙醇溶液表面滅菌1-3min，無菌水衝洗3次，質量百分數為0.1％的hgcl2溶液滅菌4-6min，無菌水衝洗4次；
(2)金花茶提取液的製備：取適量新鮮嫩綠的金花茶葉片加入到開放的提取罐中，加入水加熱到煮沸狀態煎煮40-60min，葉片與水的料液體積比為1:2-4，之後倒出提取液至液體存儲罐中；再向提取罐中加入水加熱到煮沸狀態煎煮1-2h，且葉片與水的料液體積比為1:3-5，倒出提取液至所述液體存儲罐中，最後濃縮液體存儲罐中的提取液至原體積的1/5-1/3，得金花茶提取液；
(3)初代誘導培養：把步驟(1)經消毒的種子，接種到初代誘導培養基上，在無菌條件下，培養8-12天，直至所述種子長出頂芽；
初代誘導培養基為1/2ms基本培養基+金花茶提取液0.8～1.2g/l+6-ba0.4～0.8mg/l+naa0.2～0.6mg/l+蔗糖20～30g/l+營養液4.0～8.0g/l；
(4)繼代增殖培養：將所述頂芽接種到繼代增殖培養基上培養16-20天，誘導頂芽增殖，得叢生芽；
增殖培養基為1/2b5基本培養基+金花茶提取液0.8～1.2g/l+6-ba0.4～0.6mg/l+naa0.3～0.5mg/l+蔗糖20～30g/l+瓊脂4.0～6.0g/l；
(5)生根培養：待所述叢生芽的單芽長至3.0～5.0cm時，將金花茶組培苗接種到生根培養基中進行誘導生根培養22～26天；
生根培養基為dcr培養基+金花茶提取液1.0～1.6g/l+iba0.6～0.8mg/l+naa0.4～0.6mg/l+蔗糖15～25g/l+瓊脂6.0～8.0g/l；
(6)試管苗的馴化和移栽：將金花茶生根試管苗從培養室移至塑料大棚放置4～6天後，去瓶蓋煉苗2～4天，取出金花茶幼苗，將其根部用0.1％多菌靈處理1～2min後，移栽至穴盤中的栽培基質內，覆膜保溼3～5天，其間上午及下午各通風透氣一次，每次20～30min，遮蔭65-75％，揭膜後噴施600-800倍液的甲基託布津，且按照10g/m2的用量進行噴施，此後進行正常的栽培管理，即可。
優選地，所述營養液包括以下組份及其對應的濃度：
硫酸銨0.02～0.04g/l、二水氯化鈣0.01～0.03g/l、七水硫酸鎂0.01～0.03g/l、無水磷酸二氫鉀0.04～0.06g/l、硫酸鋅0.01～0.03g/l、碘化鉀0.02～0.04g/l。
進一步地，所述初代誘導培養、繼代增殖培養以及生根培養的培養條件：環境溫度24±2℃，光照時間12～16h/d，光照強度為2000～3000lx。
優選地，所述dcr培養基的組成及其含量為：nh4no30.03-0.05g/l、kh2po40.06-0.08g/l、cacl2·2h2o0.02-0.04g/l、ca(no3)2·4h2o0.06-0.1g/l、mgso4·7h2o0.06-0.08g/l、feso4·7h2o0.04-0.06g/l、znso4·7h2o0.05-0.07g/l、ki0.04-0.08g/l、甘露醇0.3-0.5g/l、vb10.01-0.03g/l、vc0.02-0.04g/l。
進一步地，所述初代誘導培養基為1/2ms基本培養基+金花茶提取液1.0g/l+6-ba0.6mg/l+naa0.4mg/l+蔗糖25g/l+營養液6.0g/l。
進一步地，所述增殖培養基為1/2b5基本培養基+金花茶提取液1.0g/l+6-ba0.5mg/l+naa0.4mg/l+蔗糖25g/l+瓊脂5.0g/l。
進一步地，所述生根培養基為dcr培養基+金花茶提取液1.3g/l+iba0.7mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂7.0g/l。
優選地，所述的栽培基質包括以下按重量份計的原料：硅藻土30-50份、生物炭15-25份、陶粒10-20份、礱糠灰8-12份、塘泥5-15份；
所述生物炭是通過以下方法製備得到的：將棉花杆、蔬菜杆雜木枝或/和瓜秧曬乾至含水量在20％以下，然後切割或粉粹，投入碳化爐內，在420℃～480℃下碳化2.5～3.5小時後出炭，出炭時用水過濾降溫至室溫，然後將炭烘乾，粉碎，即得生物炭。
本發明具如下的有益效果：
(1)本發明的金花茶組培繁育方法大大縮短了金花茶的育苗周期，節省了育苗材料，克服了傳統金花茶育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產成本，提高了生產效率，解決了目前金花茶扦插成活率低、繁殖周期長、品質退化等問題；
(2)本發明的金花茶組培繁育方法具有種苗繁殖快，種苗繁殖不受季節的影響，一年四季都可培育苗木，同時解決了科學研究選育的良種應用的問題，以往良種生產單純依賴建設種子園的方法，採用該方法節約了土地、經費以及解決了種子園投產周期長的問題，推廣應用前景好；
(3)採用本發明的金花茶組培繁育方法，採用金花茶提取液作為營養添加劑，能有效地使良種通過組培大規模擴繁，具有良好的經濟效益、社會效益和生態效益。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的具體實施方式作進一步描述，以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護範圍。
實施例1
下列初代誘導培養、繼代增殖培養以及生根培養的培養條件：環境溫度22℃，光照時間12h/d，光照強度為2000lx。
一種金花茶組培繁育方法，按照以下步驟進行：
(1)外植體的選擇及消毒：選取健康無病的金花茶種子作為外植體，先將種子經流水衝洗2min後，在超淨工作檯上用體積百分數為75％的乙醇溶液表面滅菌1min，無菌水衝洗3次，質量百分數為0.1％的hgcl2溶液滅菌4min，無菌水衝洗4次；
(2)金花茶提取液的製備：取400g新鮮嫩綠的金花茶葉片加入到開放的提取罐中，加入水加熱到煮沸狀態煎煮40min，葉片與水的料液體積比為1:2，之後倒出提取液至液體存儲罐中；再向提取罐中加入水加熱到煮沸狀態煎煮1h，且葉片與水的料液體積比為1:3，倒出提取液至所述液體存儲罐中，最後濃縮液體存儲罐中的提取液至原體積的1/5，得金花茶提取液；
(3)初代誘導培養：把步驟(1)經消毒的種子，接種到初代誘導培養基上，在無菌條件下，培養8天，直至所述種子長出頂芽；
初代誘導培養基為1/2ms基本培養基+金花茶提取液0.8g/l+6-ba0.4mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+營養液4.0g/l；
(4)繼代增殖培養：將所述頂芽接種到繼代增殖培養基上培養16天，誘導頂芽增殖，得叢生芽；
增殖培養基為1/2b5基本培養基+金花茶提取液0.8g/l+6-ba0.4mg/l+naa0.3mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂4.0g/l；
(5)生根培養：待所述叢生芽的單芽長至3.0cm時，將金花茶組培苗接種到生根培養基中進行誘導生根培養22天；
生根培養基為dcr培養基+金花茶提取液1.0g/l+iba0.6mg/l+naa0.4mg/l+蔗糖15g/l+瓊脂6.0g/l；
(6)試管苗的馴化和移栽：將金花茶生根試管苗從培養室移至塑料大棚放置4天後，去瓶蓋煉苗2天，取出金花茶幼苗，將其根部用0.1％多菌靈處理1min後，移栽至穴盤中的栽培基質內，覆膜保溼3天，其間上午及下午各通風透氣一次，每次20min，遮蔭65％，揭膜後噴施600倍液的甲基託布津，且按照10g/m2的用量進行噴施，此後進行正常的栽培管理，即可。
其中，所述營養液包括以下組份及其對應的濃度：硫酸銨0.02g/l、二水氯化鈣0.01g/l、七水硫酸鎂0.01g/l、無水磷酸二氫鉀0.04g/l、硫酸鋅0.01g/l和碘化鉀0.02g/l；
所述dcr培養基的組成及其含量為：nh4no30.03g/l、kh2po40.06g/l、cacl2·2h2o0.02g/l、ca(no3)2·4h2o0.06g/l、mgso4·7h2o0.06g/l、feso4·7h2o0.04g/l、znso4·7h2o0.05g/l、ki0.04g/l、甘露醇0.3g/l、vb10.01g/l和vc0.02g/l。
所述的栽培基質包括以下原料：硅藻土30kg、生物炭15kg、陶粒10kg、礱糠灰8kg、塘泥5kg；上述的生物炭是通過以下方法製備得到的：將棉花杆和蔬菜杆雜木枝曬乾至含水量在20％以下，然後切割或粉粹，投入碳化爐內，在420℃℃下碳化2.5小時後出炭，出炭時用水過濾降溫至室溫，然後將炭烘乾，粉碎，即得生物炭。
實施例2
下列初代誘導培養、繼代增殖培養以及生根培養的培養條件：環境溫度24℃，光照時間14h/d，光照強度為2500lx。
一種金花茶組培繁育方法，按照以下步驟進行：
(1)外植體的選擇及消毒：選取健康無病的金花茶種子作為外植體，先將種子經流水衝洗3min後，在超淨工作檯上用體積百分數為75％的乙醇溶液表面滅菌2min，無菌水衝洗3次，質量百分數為0.1％的hgcl2溶液滅菌5min，無菌水衝洗4次；
(2)金花茶提取液的製備：取500g新鮮嫩綠的金花茶葉片加入到開放的提取罐中，加入水加熱到煮沸狀態煎煮50min，葉片與水的料液體積比為1:3，之後倒出提取液至液體存儲罐中；再向提取罐中加入水加熱到煮沸狀態煎煮1.5h，且葉片與水的料液體積比為1:4，倒出提取液至所述液體存儲罐中，最後濃縮液體存儲罐中的提取液至原體積的1/4，得金花茶提取液；
(3)初代誘導培養：把步驟(1)經消毒的種子，接種到初代誘導培養基上，在無菌條件下，培養10天，直至所述種子長出頂芽；
初代誘導培養基為1/2ms基本培養基+金花茶提取液1.0g/l+6-ba0.6mg/l+naa0.4mg/l+蔗糖25g/l+營養液6.0g/l；
(4)繼代增殖培養：將所述頂芽接種到繼代增殖培養基上培養18天，誘導頂芽增殖，得叢生芽；
增殖培養基為1/2b5基本培養基+金花茶提取液1.0g/l+6-ba0.5mg/l+naa0.4mg/l+蔗糖25g/l+瓊脂5.0g/l；
(5)生根培養：待所述叢生芽的單芽長至4.0cm時，將金花茶組培苗接種到生根培養基中進行誘導生根培養24天；
生根培養基為dcr培養基+金花茶提取液1.4g/l+iba0.7mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂7.0g/l；
(6)試管苗的馴化和移栽：將金花茶生根試管苗從培養室移至塑料大棚放置5天後，去瓶蓋煉苗3天，取出金花茶幼苗，將其根部用0.1％多菌靈處理1.5min後，移栽至穴盤中的栽培基質內，覆膜保溼4天，其間上午及下午各通風透氣一次，每次25min，遮蔭70％，揭膜後噴施700倍液的甲基託布津，且按照10g/m2的用量進行噴施，此後進行正常的栽培管理，即可。
其中，所述營養液包括以下組份及其對應的濃度：硫酸銨0.03g/l、二水氯化鈣0.02g/l、七水硫酸鎂0.02g/l、無水磷酸二氫鉀0.05g/l、硫酸鋅0.02g/l和碘化鉀0.03g/l；
所述dcr培養基的組成及其含量為：nh4no30.04g/l、kh2po40.07g/l、cacl2·2h2o0.03g/l、ca(no3)2·4h2o0.08g/l、mgso4·7h2o0.07g/l、feso4·7h2o0.05g/l、znso4·7h2o0.06g/l、ki0.06g/l、甘露醇0.4g/l、vb10.02g/l和vc0.03g/l。
所述的栽培基質包括以下原料：硅藻土40kg、生物炭20kg、陶粒15kg、礱糠灰10kg、塘泥10kg；上述的生物炭是通過以下方法製備得到的：將棉花杆、蔬菜杆雜木枝和瓜秧曬乾至含水量在20％以下，然後切割或粉粹，投入碳化爐內，在450℃下碳化3小時後出炭，出炭時用水過濾降溫至室溫，然後將炭烘乾，粉碎，即得生物炭。
實施例3
下列初代誘導培養、繼代增殖培養以及生根培養的培養條件：環境溫度26℃，光照時間16h/d，光照強度為3000lx。
一種金花茶組培繁育方法，按照以下步驟進行：
(1)外植體的選擇及消毒：選取健康無病的金花茶種子作為外植體，先將種子經流水衝洗4min後，在超淨工作檯上用體積百分數為75％的乙醇溶液表面滅菌3min，無菌水衝洗3次，質量百分數為0.1％的hgcl2溶液滅菌6min，無菌水衝洗4次；
(2)金花茶提取液的製備：取600g新鮮嫩綠的金花茶葉片加入到開放的提取罐中，加入水加熱到煮沸狀態煎煮60min，葉片與水的料液體積比為1:4，之後倒出提取液至液體存儲罐中；再向提取罐中加入水加熱到煮沸狀態煎煮2h，且葉片與水的料液體積比為1:5，倒出提取液至所述液體存儲罐中，最後濃縮液體存儲罐中的提取液至原體積的1/3，得金花茶提取液；
(3)初代誘導培養：把步驟(1)經消毒的種子，接種到初代誘導培養基上，在無菌條件下，培養12天，直至所述種子長出頂芽；
初代誘導培養基為1/2ms基本培養基+金花茶提取液1.2g/l+6-ba0.8mg/l+naa0.6mg/l+蔗糖30g/l+營養液8.0g/l；
(4)繼代增殖培養：將所述頂芽接種到繼代增殖培養基上培養20天，誘導頂芽增殖，得叢生芽；
增殖培養基為1/2b5基本培養基+金花茶提取液1.2g/l+6-ba0.6mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂6.0g/l；
(5)生根培養：待所述叢生芽的單芽長至5.0cm時，將金花茶組培苗接種到生根培養基中進行誘導生根培養26天；
生根培養基為dcr培養基+金花茶提取液1.6g/l+iba0.8mg/l+naa0.6mg/l+蔗糖25g/l+瓊脂8.0g/l；
(6)試管苗的馴化和移栽：將金花茶生根試管苗從培養室移至塑料大棚放置6天後，去瓶蓋煉苗4天，取出金花茶幼苗，將其根部用0.1％多菌靈處理2min後，移栽至穴盤中的栽培基質內，覆膜保溼5天，其間上午及下午各通風透氣一次，每次30min，遮蔭75％，揭膜後噴施800倍液的甲基託布津，且按照10g/m2的用量進行噴施，此後進行正常的栽培管理，即可。
其中，所述營養液包括以下組份及其對應的濃度：硫酸銨0.04g/l、二水氯化鈣0.03g/l、七水硫酸鎂0.03g/l、無水磷酸二氫鉀0.06g/l、硫酸鋅0.03g/l和碘化鉀0.04g/l；
所述dcr培養基的組成及其含量為：nh4no30.05g/l、kh2po40.08g/l、cacl2·2h2o0.04g/l、ca(no3)2·4h2o0.1g/l、mgso4·7h2o0.08g/l、feso4·7h2o0.06g/l、znso4·7h2o0.07g/l、ki0.08g/l、甘露醇0.5g/l、vb10.03g/l和vc0.04g/l。
所述的栽培基質包括以下原料：硅藻土50kg、生物炭25kg、陶粒20kg、礱糠灰12kg和塘泥15kg；上述的生物炭是通過以下方法製備得到的：將蔬菜杆雜木枝和瓜秧曬乾至含水量在20％以下，然後切割或粉粹，投入碳化爐內，在480℃下碳化3.5小時後出炭，出炭時用水過濾降溫至室溫，然後將炭烘乾，粉碎，即得生物炭。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。