包括白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳和B型肝炎表面抗原的四價聯合疫苗及其...的製作方法

2023-06-11 22:51:36

專利名稱：包括白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳和B型肝炎表面抗原的四價聯合疫苗及其 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種包括白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳苗和B型肝炎表面抗原的四價聯合疫苗(以下稱DTwPH聯合疫苗)及其製備方法。
在世界衛生組織(WHO)的擴大免疫計劃(EPI)中，推薦同時接種抗白喉、破傷風和百日咳的DTP聯合疫苗作為幾乎全世界國家嬰兒使用的基本疫苗。在東南亞、中亞、非洲和南美東南亞最為普遍的B肝感染，被認為是肝癌的一種潛在起因。然而，B肝感染也可通過免疫來預防，因此WHO積極開展全世界B肝疫苗接種活動。
最近，為了消除單獨接種具有不同接種程序的DTP聯合疫苗和B肝疫苗的麻煩，以及將這些疫苗以降低的價格供應給不發達國家以增加其疫苗接種率，現已有商業化的包括白喉類毒素、破傷風類毒素、無細胞百日咳和HBsAg的聯合疫苗產品(DTaPH)(歐洲專利公布號0642355B1，6月15日，1998；韓國專利公布號1992-0009729，綠十字公司)。
背景技術：
與DTwPH聯合疫苗的製備相關進行了積極研究，以解決這種聯合疫苗藥物製備中遇到的問題，在保留HBsAg免疫原性的同時防止毒性的增加。
在聯合疫苗藥物製備中發生的問題包括單個疫苗溶液的聚集和疫苗對玻璃貯藏瓶的粘附。這裡，術語「聚集」指形成輕微搖動不能使其懸浮的固體物質，術語「粘附」指DTwPH聯合疫苗顆粒結合到貯藏玻璃瓶壁上，結合很牢固，輕微搖動不能使其分離。DTwPH聯合疫苗中的聚集是由各疫苗吸附溶液和百日咳桿菌之間尤其是用作吸附劑的氫氧化鋁凝膠和百日咳桿菌之間的靜電引力引起的。這種粘附由DTwPH聯合疫苗顆粒和玻璃瓶壁之間長期的反應引起。因為DTwPH聯合疫苗長期貯存，聚集和粘附現象使聯合疫苗產品的穩定性嚴重降低。
DTwPH聯合疫苗由於吸附劑和蛋白過量而具有毒性增加的問題。此外，因為HBsAg與其它抗原相容性差，與同時接種兩種單獨的疫苗DPT聯合疫苗和B肝疫苗相比，其免疫原性降低(WHO總部，白喉-破傷風-百日咳-B肝四價疫苗非正式會議，1992)。
因此，本發明目的是有效防止上述「聚集」和「粘附」現象，也提供一種新的DTwPH聯合疫苗及其製備方法，可保留HBsAg的免疫原性，使其與同時接種單獨的三價DTP聯合疫苗和單一抗原B肝疫苗具有相同的幾何平均抗體滴度(ab GMT)和有效抗體生成率。
發明詳述本發明提供了一種新的四價DTwPH聯合疫苗，包括白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳和HBsAg，其中白喉類毒素和破傷風類毒素吸附於磷酸鋁凝膠(AlPO4)，HBsAg吸附於氫氧化鋁凝膠(Al(OH)3)。
本發明也提供了DTwPH聯合疫苗的製備方法，包括(a)在製備最終的DTwPH聯合疫苗組合物之前，調節吸附白喉類毒素的磷酸鋁凝膠溶液、吸附破傷風類毒素的磷酸鋁凝膠溶液、吸附HBsAg的氫氧化鋁凝膠溶液和百日咳貯備溶液的pH範圍為6.5-7.5；(b)將調整了pH的白喉類毒素和破傷風類毒素吸附溶液混合；和(c)將在步驟(b)中獲得的混合物與調整了pH的HBsAg吸附溶液和滅活百日咳貯備液混合。
本發明也提供了聯合疫苗貯藏方法，包括將明膠加入普通聯合疫苗或上述DTwPH聯合疫苗，或使用矽塗層的玻璃瓶作為聯合疫苗的貯藏瓶。優選明膠的濃度範圍為0.1-0.7w/v％。
以下將更詳細地描述本發明的結構和作用。
本發明使用的白喉類毒素貯備液通過培養白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)Park Willium株製備。將產生的培養上清過濾、沉澱及福馬林去毒後純化，獲得適當的白喉類毒素貯備液。可使用上述以外的菌株和方法來獲得適當的白喉類毒素貯備液。
破傷風類毒素貯備液通過培養破傷風桿菌(Clostridium tetani)Harvard株製備。將產生的培養上清液過濾、沉澱及福馬林去毒後純化，獲得適當的白喉類毒素貯備液。可使用上述以外的菌株和方法來獲得適當的白喉類毒素貯備液。
百日咳貯備液通過培養百日咳桿菌(Bordetella pertussis)製備。將產生的培養液離心。獲得的百日咳沉澱懸浮在鹽水中並通過處理滅活，獲得適當的滅活百日咳貯備液。可使用上述以外的菌株和方法來獲得適當的百日咳貯備液。
HBsAg從重組酵母培養物通過勻漿提取。來自重組酵母的HBsAg經過一系列的分離方法，包括離子層析、超濾、透析、超速離心、凝膠過濾層析等，獲得適當的HBsAg貯備液。可通過使用上述以外的方法獲得適當的HBsAg，也可利用來自血漿的HBsAg。
本發明使用的適當的吸附劑包括氫氧化鋁和磷酸鋁凝膠。氫氧化鋁和磷酸鋁凝膠可以購買或用已知方法製備。
本發明中用於貯藏聯合疫苗的矽塗層瓶通過將玻璃瓶浸泡在35％聚甲基矽氧烷(Dow Corning 365矽乳劑)的1∶40稀釋液中，然後將玻璃瓶在310℃加熱乾燥10分鐘來製造。任何用上述以外的方法製造的矽塗層玻璃瓶和市售的矽塗層玻璃瓶都可使用。
根據本發明的DTwPH聯合疫苗通過分別將白喉類毒素、破傷風類毒素和HBsAg貯備液吸附到鋁凝膠上，並將上述溶液與百日咳貯備液混合，調整每種單一抗原疫苗的濃度到適當的水平來製備。白喉類毒素貯備液和破傷風類毒素貯備液吸附於磷酸鋁凝膠，HBsAg貯備液吸附於氫氧化鋁凝膠。
根據本發明的DTwPH聯合疫苗中單一抗原疫苗濃度為白喉類毒素20-50Lf/mL、破傷風類毒素4-20Lf/mL、百日咳10-24OU/mL、HBsAg10-30μg/mL。氫氧化鋁凝膠的濃度為15-35μgAl/mL。總的鋁凝膠濃度為550-1000μgAl/mL。術語「氫氧化鋁凝膠的濃度」或「鋁凝膠的濃度」指鋁凝膠中鋁的濃度。


圖1為放大100X的照片，顯示不同氫氧化鋁濃度下百日咳桿菌用氫氧化鋁凝膠的聚集程度。氫氧化鋁凝膠和百日咳桿菌混合時，因靜電引力發生聚集。為了使氫氧化鋁凝膠和百日咳桿菌之間的聚集減至最少，確定氫氧化鋁凝膠的濃度被認為是一個重要因素。當百日咳桿菌終濃度為24OU/mL，在氫氧化鋁凝膠濃度35μgAl/mL時沒有觀察到聚集，如圖1(a)所示。在氫氧化鋁凝膠濃度不低於35μgAl/mL時，氫氧化鋁凝膠和百日咳桿菌開始聚集，在氫氧化鋁濃度不低於200μgAl/mL時聚集程度加重，如圖1(b)所示。
因此，吸附HBsAg的氫氧化鋁凝膠濃度優選範圍在15-35μgAl/mL(基於最終聯合疫苗組合物)。白喉類毒素吸附溶液在中性pH下不帶電或帶負電，在弱酸性pH下帶正電。同時，百日咳桿菌吸附溶液在中性pH下表面帶負電。因此，當百日咳貯備液和白喉類毒素吸附溶液在pH調整到範圍6.5-7.5時(用pH計測量，Zeta-Meter系統3.0，NJB PACIFIC INC.，美國)，可通過靜電斥力防止混合溶液中的聚集。
當將白喉類毒素、破傷風類毒素和HBsAg吸附溶液和百日咳桿菌溶液的pH調整為6.5-7.5範圍並將它們混合在一起時，最終的DTwPH聯合疫苗組合物pH為6.5-7.5，因此可防止各抗原疫苗之間的聚集。
通過上述方法製備的根據本發明的DTwPH聯合疫苗符合各個單一抗原疫苗的生物學製備標準(韓國食品和藥品管理，1999)，具有降低的毒性。另外，在DTwPH聯合疫苗中HBsAg的免疫原性是穩定的。在這裡，免疫原性的穩定性指在4℃貯藏3個月後HBsAg的免疫原性與初始水平保持不變或輕微增加，沒有明顯的降低。
疫苗在貯藏過程中不期望的聚集或對玻璃瓶壁的粘附，可通過向普通聯合疫苗或根據本發明的DTwPH聯合疫苗中加入高粘度物質(如0.1-0.7w/v％的明膠)，或通過使用矽塗層的玻璃瓶貯藏來防止。這樣，普通聯合疫苗或根據本發明的DTwPH聯合疫苗在貯藏過程中保持為白色穩定懸浮液。在這裡，貯藏穩定性指貯藏在溫度為2-8℃的冷藏室，聯合疫苗保持為白色懸浮液，而沒有疫苗的聚集和對貯藏瓶的粘附。
圖表簡述圖1為放大100X的照片，顯示不同氫氧化鋁濃度下百日咳桿菌用氫氧化鋁凝膠的聚集程度。
圖2為蛋白雜交照片，顯示白喉類毒素吸附溶液的吸附程度。
圖3為光學顯微鏡拍攝的放大100X的照片，顯示使用矽塗層的玻璃瓶貯藏對DTwPH聯合疫苗中聚集程度的影響。
實施例本發明將通過下列實施例更詳細地來描述。下列實施例是用於闡述的，而不是用來限制本發明的範圍。實施例1製備白喉類毒素貯備液本發明使用的白喉類毒素貯備液通過培養白喉桿菌Park Willium株製備。向產生的培養上清液加入終濃度為6％的福馬林，並在36℃放置28天用來去毒，然後通過超濾、透析、硫酸銨沉澱、凝膠過濾層析純化，然後透析獲得白喉類毒素貯備液。實施例2製備破傷風類毒素貯備液破傷風類毒素貯備液通過培養破傷風桿菌Harvard株製備。向產生的培養液中加入終濃度為0.45％的福馬林，並在36℃放置28天用來去毒，然後通過微濾、超濾、透析、硫酸銨沉澱、凝膠過濾層析純化，然後透析獲得破傷風類毒素貯備液。實施例3製備全細胞百日咳貯備液百日咳貯備液通過培養百日咳桿菌來製備。將產生的培養液離心。獲得的百日咳沉澱懸浮在鹽水中並在56℃處理30分鐘滅活，以獲得適當的百日咳貯備液。實施例4製備HBsAg貯備液HBsAg通過培養重組多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)來製備。產生的培養物勻漿後進行細胞提取，然後經離子層析、超濾、透析、超離和凝膠過濾層析獲得適當的HBsAg貯備液。實施例5製備白喉類毒素和破傷風類毒素吸附溶液白喉類毒素和破傷風類毒素貯備液通過攪拌混合吸附於磷酸鋁凝膠(pH5.5)，需要時用等滲鹽水稀釋。可適當調整吸附溶液最終的蛋白和類毒素濃度。在該實施例中，白喉類毒素溶液的濃度調整至大約280Lf/mL，破傷風類毒素溶液的濃度調整至大約50Lf/mL。相應的吸附溶液pH為5.5-6.0。通過高效液相色譜(HPLC)和蛋白雜交分析可觀察到白喉類毒素吸附在磷酸鋁凝膠上。蛋白雜交分析的結果顯示於圖2。在圖2中，泳道1為分子量標記，泳道2、3和4分別為0.025Lf/mL、0.05Lf/mL和0.10Lf/mL的白喉類毒素溶液。泳道5為0.4Lf/mL的白喉類毒素吸附溶液離心上清(相當於100％解吸的白喉類毒素)。製備的白喉類毒素和破傷風類毒素吸附溶液貯藏在溫度為2-8℃的冷藏室中。實施例6製備HBsAg吸附溶液為了增加免疫原性，將HBsAg吸附於氫氧化鋁凝膠。攪拌混合HBsAg貯備液與氫氧化鋁凝膠，使HBsAg貯備液吸附在凝膠上，如果需要並用等滲鹽水稀釋。氫氧化鋁凝膠的濃度調整為60μgAl/mL，HBsAg貯備液的濃度調整為72μg/mL。通過HPLC和蛋白雜交分析可觀察到HBsAg吸附在氫氧化鋁凝膠上。製備的HBsAg吸附溶液貯藏在溫度為2-8℃的冷藏室中。實施例7製備DTwPH聯合疫苗將實施例5和6中製備的吸附溶液和百日咳貯備液(192OU/mL)混合，獲得最終的DTwPH聯合疫苗組合物。為了防止百日咳貯備液和吸附溶液混合物中由於靜電引力發生的聚集，在混合前將各溶液的pH調至7.1。
首先，白喉類毒素吸附溶液和破傷風類毒素吸附溶液混合，HBsAg吸附溶液和滅活百日咳貯備液加入該混合物中製備DTwPH聯合疫苗組合物。接下來將磷酸鋁凝膠加入DTwPH聯合疫苗組合物中，調整總的鋁凝膠濃度至預期水平。各貯備溶液的濃度可通過加入鹽水或磷酸緩衝液調整。加入0.05-0.1％mg/mL的硫柳汞作為防腐劑。如果需要則加入3-6mg/mL的2-苯氧基乙醇。最終的DTwPH聯合疫苗組合物具有表1所示的pH為7.1的組成。
表1
實驗實施例1DTwPH聯合疫苗中HBsAg的免疫原性試驗為了測定實施例7中製備的DTwPH聯合疫苗中HBsAg的免疫原性，30隻4-5周齡的ICR小鼠腹部皮下免疫該聯合疫苗。4周後抽血，測定該免疫原性試驗的幾何平均抗體滴度(Ab GMT)和具有有效抗體滴度的小鼠百分數。在此，Ab GMT指不低於1mIU/mL的小鼠抗體滴度的幾何平均數，具有有效抗體滴度的小鼠百分數指抗體滴度不低於10mIU/mL的小鼠佔所有實驗小鼠中的百分數。
作為同時處理的對照組，對小鼠在不同位點皮下免疫0.5-mL抗原組成與實施例1相同的三聯DTwP聯合疫苗(40Lf/mL白喉類毒素、15Lf/mL破傷風類毒素和24OU/mL百日咳桿菌)和0.5-mL單一抗原B肝疫苗(24μg/mL)，然後用上面描述的相同方法對HBsAg對行免疫原性試驗。
如表2所示，與同時免疫單獨的疫苗一樣，DTwPH聯合疫苗顯示了穩定的HBsAg免疫原性(在Ab GMT和具有有效抗體滴度的小鼠百分數)。
表2
實驗實施例2DTwPH聯合疫苗的效力試驗實施例7中製備的DTwPH聯合疫苗中白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳和HBsAg各自的效力試驗根據韓國食品和藥品管理的生物藥物效力要求(1999，122-130白喉、破傷風、百日咳吸附聯合疫苗；和310-313B肝疫苗)進行。
結果為白喉類毒素2-4單位/mL、破傷風類毒素4單位/mL或更高、全細胞百日咳10IU/mL。HBsAg的效力等於或大於參考品(使用綠十字公司的標準)。顯然，DTwPH聯合疫苗符合生物藥物的效力要求。
實施例8明膠的使用為了增加實施例7中製備的DTwPH聯合疫苗組合物的粘度，加入終濃度為0.6w/v％的明膠。結果在2-8℃貯藏3個月後沒有觀察到疫苗的聚集和對玻璃瓶壁的粘附。
實施例9矽塗層玻璃瓶的使用將實施例7中製備的0.5ml DTwPH聯合疫苗組合物分裝到一隻矽塗層的玻璃瓶(3mL)和一隻沒有塗層的玻璃瓶中，在2-8℃貯藏3個月或更長時間。結果沒有觀察到疫苗對矽塗層的玻璃瓶壁的粘附。劇烈搖動這兩隻瓶子後，用顯微鏡在100X(Axioplan，Carl Zeiss Co.，德國)觀察疫苗組合物的穩定狀態。貯藏在矽塗層玻璃瓶中的DTwPH聯合疫苗組合物在貯藏過程中維持了初始的均質分散狀態，如圖3(a)所示。相反，在沒有矽塗層的玻璃瓶中觀察到了DTwPH聯合疫苗的聚集，如圖3(b)所示。
工業適用性如上所述，疫苗的聚集和對貯藏玻璃瓶的粘附能夠通過在調整氫氧化鋁凝膠濃度和各吸附溶液和百日咳貯備液的pH後製備DTwPH聯合疫苗，或通過向DTwPH聯合疫苗中加入明膠，或使用矽塗層的玻璃瓶貯藏來防止。
將白喉類毒素和破傷風類毒素吸附到磷酸鋁凝膠上、將HBsAg吸附到氫氧化鋁凝膠上，並調整各成分濃度之後製備DTwPH聯合疫苗，可保持DTwPH聯合疫苗中HBsAg的免疫原性，各成分的效力可滿足生物學製備標準的要求(韓國食品和藥物管理，1999)。
此外，其它單一抗原疫苗如流感嗜血桿菌b型(Hib)疫苗或滅活脊髓灰質炎疫苗可加入DTwPH聯合疫苗製品中，或可在同時免疫注射前立即與其混合。
權利要求
1.一種DTwPH(白喉-破傷風-百日咳-肝炎)聯合疫苗，其中白喉類毒素和破傷風類毒素吸附於磷酸鋁凝膠，B肝表面抗原吸附於氫氧化鋁凝膠。
2.根據權利要求1的DTwPH聯合疫苗，最終pH為6.5-7.5。
3.根據權利要求1和2中任一項的DTwPH聯合疫苗，其中氫氧化鋁凝膠的濃度範圍是15-35μgAl/mL。
4.根據權利要求1-3中任一項的DTwPH聯合疫苗，其中白喉類毒素的濃度範圍為20-50Lf/mL、破傷風類毒素的濃度範圍為4-20Lf/mL、百日咳的濃度範圍為10-24OU/mL、B肝表面抗原的濃度範圍為10-30μg/mL，總的鋁凝膠濃度範圍為550-1000μgAl/mL。
5.一種聯合疫苗，其含有0.1-0.7w/v％用量的明膠。
6.根據權利要求5的聯合疫苗，其中明膠的用量範圍為0.5-0.7w/v％。
7.根據權利要求5和6中任一項的聯合疫苗，其中聯合疫苗為用於預防白喉、破傷風、百日咳和B型肝炎的DTwPH聯合疫苗。
8.製備DTwPH(白喉-破傷風-百日咳-肝炎)聯合疫苗的方法，該方法包含將吸附白喉類毒素的磷酸鋁凝膠溶液與吸附破傷風類毒素的磷酸鋁凝膠溶液混合(a)；和將在步驟(a)中獲得的混合物與吸附B肝表面抗原的氫氧化鋁凝膠溶液和滅活百日咳貯備液混合(b)。
9.根據權利要求8的方法，其中DTwPH聯合疫苗最終pH為6.5-7.5。
10.根據權利要求8和9中任一項的方法，其中DTwPH聯合疫苗中氫氧化鋁凝膠的濃度範圍調整至15-35μg/mL。
11.根據權利要求8-10中任一項的方法，其中白喉類毒素的濃度範圍調整至20-50Lf/mL、破傷風類毒素的濃度範圍調整至4-20Lf/mL、百日咳的濃度範圍調整至10-24OU/mL、B肝表面抗原的濃度範圍調整至10-30μg/mL，總的鋁凝膠濃度範圍調整至550-1000μgAl/mL。
12.一種聯合疫苗貯藏方法，其中聯合疫苗分裝並貯藏於矽塗層的玻璃瓶中。
13.根據權利要求12的方法，其中聯合疫苗為用於預防白喉、破傷風、百日咳和B型肝炎的DTwPH聯合疫苗。
全文摘要
提供了含有白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳和HBsAg的四價聯合疫苗(DTwPH)及其製備方法。在DTwPH聯合疫苗製品中,白喉類毒素和破傷風類毒素吸附於磷酸鋁凝膠(AlPO
文檔編號A61P31/00GK1383384SQ01801925
公開日2002年12月4日 申請日期2001年7月5日 優先權日2000年7月5日
發明者裴幹淳, 林官悅, 樸景南, 金洪周, 嚴達浩, 金鐘垂 申請人:綠十字疫苗株式會社