一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其製備方法

2023-06-12 00:33:36 1

一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其製備方法，所述副雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilusparagallinarum)HN-VA株，已於2012年7月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCCNO.7211。本發明首次採用副雞嗜血桿菌HN-VA株製備針對雞傳染性鼻炎的滅活疫苗，該疫苗的研究和製備有效解決了當前我國雞傳染性鼻炎難以有效預防，發病率高、死亡率高的問題，且不會對雞產生任何不良反應，實驗安全性高，接種後可在雞體內產生高效價的中和抗體，免疫效果較好。
【專利說明】一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種副雞嗜血桿菌，同時該副雞嗜血桿菌的滅活疫苗及其製備方法， 屬於微生物製劑領域。

【背景技術】
[0002] 副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)是一種引起雞急性上呼吸道疾病 的致病菌。該病首先發現于波蘭和美國，以後在其它各國經常發生。1980年以來，我國也屢 有本病的報導。該呼吸道疾病俗稱雞傳染性鼻炎，臨床上以面部水腫、鼻竇炎、流淚為主要 特徵，可引起產蛋雞的產蛋量下降，育成雞的生長受阻、開產期推遲，肉雞增重下降，給養禽 業造成巨大的經濟損失。目前對副雞嗜血桿菌的治療主要以抗生素為主，但是採用抗生素 常會造成耐藥菌株的出現，導致副雞嗜血桿菌在同一雞群中復發。因此副雞嗜血桿菌疫苗 的研究成為熱點，但是目前副雞嗜血桿菌疫苗對部分患病雞預防效果較差。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種副雞嗜血桿菌。
[0004] 本發明的目的還在於提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
[0005] 本發明的目的還在於提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗的製備方法。
[0006] 為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是提供一種副雞嗜血桿菌，所述副 雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)HN_VA株，已於2012年7月23 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰 西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 7211。
[0007] 所述副雞嗜血桿菌HN-VA株的分離方法如下：
[0008] (1)病料的處理：從發病雛雞鼻竇內深部取分泌物作為病料，將病料接種於雞血清 瓊脂肉湯培養基培養，進行分離純化；
[0009] (2)病原禽胚分離培養：將步驟（1)純化的病原菌接種於SPF雞胚，收集死亡雞胚 的卵黃液，即得副雞嗜血桿菌HN-VA株。
[0010] 本發明所採用的技術方案還在於提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，其活性成分 為滅活的副雞嗜血桿菌HN-VA株。
[0011] 本發明所採用的技術方案還在於提供一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，包 括以下步驟：
[0012] (1)將副雞嗜血桿菌HN-VA株接種於SPF雞胚，收集接種後死亡的SPF雞胚卵黃 液，得到生產用種子；
[0013] (2)將生產用種子擴大培養，加入滅活劑滅活，然後加入防腐劑和礦物油佐劑進行 乳化，製得副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
[0014] 所述滅活劑為甲醛。
[0015] 所述甲醛終體積濃度0· 2%。
[0016] 所述防腐劑為硫柳汞。
[0017] 所述硫柳汞的用量為終質量濃度0. 01%。
[0018] 所述礦物油佐劑為白油佐劑。
[0019] 本發明首次採用副雞嗜血桿菌HN-VA株製備針對雞傳染性鼻炎的滅活疫苗，該疫 苗的研究和製備有效解決了當前我國雞傳染性鼻炎難以有效預防，發病率高、死亡率高的 問題，且不會對雞產生任何不良反應，實驗安全性高，接種後可在雞體內產生高效價的中和 抗體，免疫效果較好。
[0020] 本發明用HN-VA株製備滅活疫苗工藝簡單、操作方便、製備的疫苗抗原性好、安全 性高，對外界環境無任何不良影響，安全評估係數高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為副雞嗜血桿菌HN-VA株的PCR擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] 本發明的副雞嗜血桿菌HN-VA株，是通過以下方式獲得的：
[0024] 2012年6月，鄭州尉氏某雞廠大批7周齡以上雛雞發生多起以打噴嚏，流鼻液，顏 面浮腫，眼瞼和肉髯水腫為主要特徵的傳染病，造成雞隻死亡和產蛋率下降。因此針對該批 發病雛雞，分離純化得到病原菌，命名為HN-VA株。通過對HN-VA株各項觀察，特異性PCR 鑑定和測序分析表明，HN-VA株屬於副雞嗜血桿菌。
[0025] (1)病料的處理：用無菌拭子插入發病雛雞鼻竇內深部取分泌物做病料，然後劃線 培養於雞血清瓊脂肉湯培養基中，37°C培養48h，再挑取單個菌落接種於雞血清肉湯培養基 上中培養16-20h。
[0026] (2)病原禽胚分離培養：將純化的病原菌接種於雞血清肉湯液體培養基中培養 16h，然後將菌液接種於6日齡SPF雞胚3枚，每枚0. lml。觀察接種24h後的雞胚死亡情 況，收集30h內死亡的雞胚的卵黃液，獲得的菌株命名為HN-VA株。將等量的卵黃液分裝於 滅菌瓶內，每瓶2ml，檢驗合格後作為一級種子。也可用雞胚復壯，但不應超過6代。檢驗方 法：取1瓶卵黃液，接種於含有雞肉湯培養基的三角瓶內，培養16-20小時後，觀察三角瓶， 若液體菌種均勻一致渾濁生長，則檢驗菌液合格。
[0027] (3) HN-VA 株的鑑定
[0028] (a)染色鏡檢：挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態特 徵。鏡下可見大量的單個、成對或短璉的兩極濃染的革蘭氏陰性細小桿菌。
[0029] (b)衛星現象：取2個副雞嗜血桿菌培養基的平板，一個劃線接種所分離純化的細 菌並點種金黃色葡萄球菌，另一個只劃線接種分離菌作對照。於37°C培養箱中培養48h，發 現其在葡萄球菌周圍長出"衛星現象"。
[0030] (C)挑取單個菌落用生理鹽水稀釋，震蕩均勻後製成懸液。在載玻片的一端，滴加 菌體懸液50 μ 1，另一端加入50 μ 1生理鹽水，兩端再各加入50 μ 11%雞血紅細胞，輕輕晃 勻。溫箱中反應3分鐘左右觀察。雞血紅細胞出現凝集現象，這說明HN-VA株為A型副雞 嗜血桿菌。
[0031] (d) PCR鑑定：根據副雞嗜血桿菌的16SrRNA基因（GenBank中登錄號為 AY498870. 1)的保守區設計引物，由Invitro-gen公司合成，引物序列如下：
[0032] 上遊引物 HP16S-F :5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'（如 SEQ ID No. 1 所示），
[0033] 下遊引物 HP16S-R :5' -CCGCATAGAATCGGAAGA-3'（如 SEQ ID No. 2 所示）。
[0034] 按照《精編分子生物學實驗指南》的方法提取菌體基因組DNA，進行PCR擴增。
[0035] PCR 反應體系為：10XPCRbuffer2y 1，（1ΝΤΡ2μ 1，MgCl2Iy 1，Taq 酶 0· 2μ 1，上、 下遊引物各 〇· 5μ 1，模板 0· 5μ 1，ddH2013. 5μ 1。
[0036] PCR 反應條件為：95°C 5min，94°C lmin，56°C 50s，2°C 50s，35 個循環；72°C 延長 5min〇
[0037] 將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖I所示。圖I中1、2分別為分離的 2株菌株擴增出的特異條帶，擴增片段大小為250-350bp，條帶位置與預期一致。經測序後 與GenBank中的登錄號為AY498870. 1的序列進行比較，同源性高達98%，擴增片段的核苷酸 序列詳見序列表SEQ ID No. 3所不。以上結果表明，分離於發病雛雞中的HN-VA株屬於副雞 嗜血桿菌。
[0038] 實施例2
[0039] 本發明副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，製備方法如下：
[0040] (1)生產用種子檢驗：將一級種子採用瓊脂平板進行菌落計數。細菌計數按農業 部頒發的獸醫微生物製品規程進行，以ΚΓ 1，1〇_2,1〇_3, KTltl稀釋，然後取0. ImL稀釋液均勻 地塗抹在瓊脂平板上，每個稀釋度做2板，置於37°C培養箱中培養16?20h，2板的平均數 即為該稀釋度的細菌數，用營養肉湯培養的菌液作為對照，每毫升菌落數不低於15億方可 用於生產。
[0041] (2)滅活疫苗製備：將生產用種子按萬倍擴大培養，培養基用半合成肉湯培養基， 調pH到7. 2,115°C滅菌30分鐘。在菌液中加入質量分數10%的甲醛溶液，使甲醛溶液佔菌 液總體積的〇. 2%，然後2-8°C滅活8天，滅活期間每天振搖5次。然後在滅活合格的菌液中 加入硫柳汞，使硫柳汞終濃度為〇. 01% (質量)，和菌液2倍體積的白油佐劑進行乳化，製得 副雞嗜血桿菌滅活疫苗。
[0042] 滅活菌液檢測方法：取檢品在無菌條件下接種沙氏培養基或不滴定pH普通瓊脂 斜面2支、血斜2支、0. 2ml/支、置20?30°C培養。同時接種裝置不少於50ml的馬丁肉液 和厭氣肝湯各2支，Iml/支，置37°C培養，3日後，自厭氣肝湯管中吸取適量培養物，移植於 鮮血瓊脂斜面和厭氣肝湯小管各1支，自馬丁湯大管中吸取適量培養物移植於鮮血瓊脂斜 面和馬丁肉湯小管各一支，連前繼續培養5日，均應無菌生長。
[0043] 上述實施例中所採用的培養基均為半合成培養基，購自鄭州博賽生物技術股份有 限公司。
[0044] 試驗例
[0045] 1、安全檢測
[0046] 用2月齡SPF雞60隻，隨即分成4組，每組15隻，3組實驗組SPF雞分別經頸背部 皮下注射副雞嗜血桿菌滅活疫苗，一次單劑量接種〇. Iml/只，第4組為對照組，注射滅菌生 理鹽水。對實驗組SPF雞和對照組SPF雞連續觀察2周，觀察有無發病、死亡和體重變化。 結果3個實驗組SPF雞和對照組SPF雞體重無差異，無發病、死亡，無局部和全身不良反應。
[0047] 2、效力檢驗
[0048] 用6周齡SPF雞20隻，10隻各皮下注射疫苗0. 25ml，另10隻作對照。接種30日 後，取免疫雞和對照雞，每隻雞各眶下鼻竇內注射副雞嗜血桿菌HN-Vl株培養物0. 2ml，觀 察2周。對照組發病5隻，免疫組保護7隻。
【權利要求】
1. 一種副雞嗜血桿菌，其特徵在於，所述副雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)HN-VA株，已於2012年7月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 7211。
2. 根據權利要求1所述的副雞嗜血桿菌，其特徵在於，所述副雞嗜血桿菌HN-VA株的分 離方法如下： (1) 病料的處理：從發病雛雞鼻竇內深部取分泌物作為病料，將病料接種於雞血清瓊脂 肉湯培養基培養，進行分離純化； (2) 病原禽胚分離培養：將步驟（1)純化的病原菌接種於SPF雞胚，收集死亡雞胚的卵 黃液，即得副雞嗜血桿菌HN-VA株。
3. -種權利要求1所述的副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，其特徵在於，其活性成分為滅活 的副雞嗜血桿菌HN-VA株。
4. 一種如權利要求3所述的副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以 下步驟： (1) 將副雞嗜血桿菌HN-VA株接種於SPF雞胚，收集接種後死亡的SPF雞胚卵黃液，得 到生產用種子； (2) 將生產用種子擴大培養，加入滅活劑滅活，然後加入防腐劑和礦物油佐劑進行乳 化，製得副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
5. 根據權利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述 滅活劑為甲醛。
6. 根據權利要求5所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述 甲醒終體積濃度〇. 2%。
7. 根據權利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述 防腐劑為硫柳萊。
8. 根據權利要求7所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述 硫柳汞的用量為終質量濃度〇. 01%。
9. 根據權利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述 礦物油佐劑為白油佐劑。
【文檔編號】A61P31/04GK104212736SQ201310462857
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】王衛芳, 徐進, 陳建暉 申請人:鄭州后羿製藥有限公司