雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法

2023-06-11 17:01:11

專利名稱：雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法
技術領域：
本發明涉及雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法。
背景技術：
鐵皮石斛是傳統名貴中藥材，具有2000多年的藥用歷史，原植物為蘭科石斛屬鐵 皮石斛(Dendrobium officinale)。被列入《瀕危野生動植物國際貿易公約》瀕危植物後， 我國對採挖、收購、經營石斛進行了嚴格限制和管理，野生的藥用石斛資源稀少、生長慢，已 逐漸成為瀕臨消亡的珍稀瀕危物種。現有的人工種植因規模小、產量低，根本不能滿足市場 需求，因此價格昂貴原料極其緊缺，出現大量的假冒鐵皮石斛。由於鐵皮石斛原球莖分化率 低、增殖係數低、繁殖時間長、生產成本高等問題，限制了鐵皮石斛試管苗生產和發展；導致 了種植市場的鐵皮石斛種苗全部為種子生產實生苗，需要不斷採集野生資源的果實，使其 野生資源逐年減少瀕臨滅絕；而且種子生產實生苗有性繁殖還存在品種雜，變異大，產品 標準不規範，品質無法保證。為此，解決鐵皮石斛原球莖分化率低、增殖係數低、繁殖時間 長、試管苗生產成本高等技術瓶頸，成為當務之急。

發明內容
本發明的目的是提供雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法，該方法利用組織培養的 技術原理，選擇鐵皮石斛優質外植體，進行無性繁殖；攻克了鐵皮石斛原球莖分化率低、增 殖係數低、繁殖時間長、試管苗生產成本高的瓶頸難題。為鐵皮石斛資源可持續利用和發 展、確保中藥材種植市場種苗供應，滿足鐵皮石斛原料需求，實現物種資源保護、再生，及可 持續利用和發展提供了有效的方法。本發明的技術方案如下一、快繁技術材料經過鐵皮石斛多糖含量分析後，選擇含量高優質植株外植體，建立單株無菌 體系，確保種苗品質的一致性，確保鐵皮石斛優質種源。1)對外植體消毒取健狀植株外植體衝洗1小時——75%乙醇擦植株——放到超淨工作檯上按以下 步驟操作用0. 升汞液浸泡10-15min，放入裝有無菌水的瓶子搖洗6次，用消毒鑷子取 出在用消毒刀片先切芽頭部分，然後順著芽頭往下0. 5公分切下，切面成正圓形，將切面向 下沿瓶邊插入MS培養基中，每瓶放一株外植體。蓋緊瓶蓋，用保鮮袋封好瓶口。2)組培①培養基配製以MS為基本培養基，根據組培目的，附加不同濃度的植物激素 (如Naphthalene acetc acid,6-benzyladenine, kinetin, Indole-3-butyric acid, Indole-3-actic acid, adenine)蔗糖 10 30g/L、瓊脂粉 6. 0-8. 0g/L、PH 值=5. 6—6. 4， 生根培養基中加入活性炭lg/L。配製過程按照常規方法，培養瓶為玻璃瓶或透明塑料瓶。 滅菌採用121°C滅菌30分鐘高壓溼熱滅菌。
②組培條件組培室溫度25°C、置於光照培養箱中，在溫度為25V 士2，光照時間 為12小時，光照強度為1000 2000 μ M m_2 s—1條件下培養。本發明的有益效果優選多糖含量高的優質植株為外植體進行單株組培，可確保種苗品質的一致性， 確保鐵皮石斛中藥材優質種源。誘導出的原球莖分化率為100%，增殖係數為6-10倍以上， 有效縮短生長周期，降低了生產成本。原球莖分化小苗和繼代培養將原球莖分化小苗，轉 接到壯苗、生根培養基中培養，生根達3-5釐米。逐步開蓋煉苗5-7天後，大田種植的適應 性強，成活率達95%以上，解決了組培試管苗增殖係數低、繁殖時間長、生產成本高的技術 難題。用鐵皮石斛種子進行有性繁殖種苗，容易出現退化變異，而且品種雜、質量不穩 定。利用多糖含量高的鐵皮石斛優質植株為外植體進行單株組培，在一年內即可培育三批 組培試管苗，確保了種苗品質。此發明創造技術與現有其他技術相比，具有生長周期短、生 產成本低、品質好、可規模化生產種苗的特點。有利於鐵皮石斛物種資源可持續利用和發展。
具體實施例方式實施例1 外植體培養健壯的鐵皮石斛休眠芽，經酒精、升汞消毒後，接種到含有生長素、細胞分裂素和 200ml/L椰汁、3%活性炭的MS蔗糖瓊脂培養基上，在光照培養室中培養2 3周後大部分都 能萌髮長出新芽，在NAAO. 5mg/L+6-BA 1. 0-2. Omg/L的培養基中都有較高的萌發率和良好 的生長，2個月後，苗高達1.5cm-3. Ocm0實施例2 原球莖誘導及其培養利用已經建立了無菌體系的組培苗，把莖切成小段繼續誘導分化原球莖，在 0. 2-0. 5mg/L NAA和1. 0-2. Omg/L 6-BA激素範圍，添加100ml/L椰汁的MS蔗糖瓊脂培養基 上，置於光照培養室中培養1個月後，從母體周圍長出原球莖，分化頻率為100%，增殖係數 為10倍以上。按此方法每1個月繼代培養，每個芽的年增殖係數理論上為1. OXIOki以上。實施例3 側芽分化及其繼代培養將上述小苗剪成廣2cm長短的帶葉莖段，接種在含生長素0. 2-0. 8mg/L NAA、細胞 分裂素1. 0-2. 5mg/L BAU00ml/L椰汁的MS蔗糖瓊脂培養基上，在光照培養箱中培養1個 半月後，從莖段葉腋處長出腋芽，分化頻率為100%，增殖係數為2倍以上。按此方法每1個 半月繼代培養，每個芽的年增殖係數理論上為1.9X104以上。 實施例4 不定根誘導及煉苗 選取生長良好的無根苗，轉接到含0.5-1. 0mg/L ΙΑΑ、0. 5-1. 0mg/L NAA、活性炭0. 3%的生根培養基上，在光照培養室中培養約1個月後，小苗基部或緊靠培養基的莖上長 出3-5條的不定根，生根誘導頻率為98%左右，將生根苗移栽到細樹皮碎磚塊基質中煉苗， 約4周後即可定植，幾乎所有苗都能移栽成活，良好生長。
權利要求
雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法，其特徵是包括材料選擇採自生長在雲南的野生鐵皮石斛優質成株，外植體為生長健壯的休眠芽和成熟的果實。主要試劑大量元素和微量元素以及鐵鹽、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各種維生素、植物激素。組培條件在溫度為25℃±2，光照時間為12小時，光照強度為1000～2000μM m-2s-1條件下培養；
2.雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法，其特徵為步驟如下1. 2. 1培養基配製基礎培養基組分為MS (Murashige和Skoog，1962)培養基，碳源為廣3%蔗糖，支撐物 為0. 6-0. 8%瓊脂，pH為5. Γ5. 6，生根培養基中加入活性炭lg/L，根據不同的培養目的加 入不同種類、不同的外源植物激素。配製過程按照常規方法，培養瓶為玻璃瓶或透明塑料瓶。滅菌採用121°C滅菌30分鐘 高壓溼熱滅菌。1. 2. 2外植體培養取健壯鐵皮石斛休眠芽，用75%的乙醇表面消毒1-3分鐘，再用0. 的升汞消毒 10-15分鐘，滅菌蒸餾水洗三次，每次10分鐘。然後，將消毒的外植體接種萌發培養基上，置 於光照培養箱中，在溫度為25°C 士2，光照時間為12小時，光照強度為90μΜ m^s"1條件下 培養。1. 2. 3側芽分化及繼代將萌發的小苗剪成廣2cm長短的帶葉莖段，接種在不定芽分化和繼代培養基中，在溫 度為25°C 士2，光照時間為14小時，光照強度為ΙΟΟμΜ πΓ、—1條件下培養。1. 2. 4原球莖誘導把無菌莖段切成小塊，接種在誘導分化原球莖的培養基上，在溫度為25°C 士2，光照時 間為14小時，光照強度為ΙΟΟμΜ HT2s-1條件下培養。1. 2. 5不定根誘導選取生長健壯、高度為1. 5-3. Ocm的無根苗，轉接到生根培養基中，置於光照培養箱 中，在溫度為25°C 士2，光照時間為10小時，光照強度為ΙΙΟμΜ、—1條件下培養。
3.雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法，其特徵為具體煉苗方法將獲得的再生小苗在自然光照、溫度條件下放置5-8天後，從生根培養基中取出再生 小苗，用自來水洗去培養基。然後，將小苗移栽至樹皮和磚塊(按4 1混合)基質上，並 將其轉移至溫室中煉苗，前3飛天根據天氣、溫度、基質溼度情況，制定合適的澆水方案，保 持溫室的光照強度為200 μ Mm 2^T1,氣溫為20-28°C，相對溼度為70-100%。
全文摘要
本發明涉及雲南鐵皮石斛的一種組織培育方法，選擇採自生長在雲南的野生鐵皮石斛優質成株，外植體為生長健壯的休眠芽和成熟的果實。主要試劑用大量元素和微量元素以及鐵鹽、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各種維生素、植物激素。在溫度為25℃±2，光照時間為12小時，光照強度為1000～2000μM m-2s-1條件下培養。打破了常規育苗受繁殖材料、季節、場地等的限制。本發明的方法可確保種苗品質的一致性，確保鐵皮石斛中藥材優質種源。解決了鐵皮石斛原球莖分化率低、增殖低，試管苗長勢弱的瓶頸難題。具有生長周期短、生產成本低、品質好、可規模化生產種苗的特點。
文檔編號A01H4/00GK101822211SQ200910094930
公開日2010年9月8日 申請日期2009年9月3日 優先權日2009年9月3日
發明者侯軍, 劉楊超, 吳超, 張抱瓊, 張豔, 熊雲昆, 陳昌祥, 黃曦 申請人:昆明優利豐園科技開發有限公司