修飾pcr擴增引物，其應用及其試劑盒的製作方法
2023-09-23 00:08:25
專利名稱：修飾pcr擴增引物，其應用及其試劑盒的製作方法
發明領域
本發明主要涉及PCR擴增；尤其是PCR擴增產物的檢測及其商品化的工具
背景技術：
PCR(Polymerase Chain Reaction)是聚合酶鏈反應技術的英文縮寫，是基因擴增技術的一次重大飛躍，該技術1985年由美國PE公司遺傳部的Kary B Mullis教授發明。PCR技術首先應用於人β-珠蛋白DNA擴增及鐮刀狀紅細胞貧血症的產前診斷。由於此項技術可將極微量地靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測到單分子或每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分的樣品，因而，此技術在短短的幾年內就廣泛的應用於分子生物學、醫學、微生物學、遺傳學等領域。
PCR技術實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴於DNA聚合酶(如Tag酶等)的酶促合成反應。PCR技術的特異性取決於引物和模板DNA結合的特異性。反應分三步①變性(denaturation)通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。②退火(annealling)當溫度突然降低時由於模板分子結構較引物要複雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多於模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補復性的機會較少。③延伸(extension)在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。以上3步為一個循環，每一循環的產物可以作為下一個循環的模板，數小時之後，介於兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量複製。決定PCR擴增特異性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反應的最初階段，原來的DNA起著起始模板的作用，隨著循環次數的遞增，由引物介異延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。因此，絕大多數擴增產物將受到所加引物5′末端的限制，最終擴增產物是介於兩種引物5′端之間的DNA片段。對於擴增產物的分析通常採用瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據擴增產物的片段大小來判斷擴增結果，也有其它分析擴增結果的方法。有關PCR技術及其應用可參閱以下文獻①《聚合酶鏈反應》；(美)穆裡斯(K B Mullis)等著，陳受宜等譯。北京科學出版社，1997；②丁振若、蘇明權主編《臨床PCR基因診斷技術》，世界圖書出版西安公司，1998。
但在目前的PCR方法中，從樣品的擴增到PCR產物的分析檢測，每個樣品都必須分別獨立進行。這種模式使得PCR擴增產物的檢測效率低、操作繁鎖。
發明目的
本發明的目的在於提供實現在同一檢測系統中對多樣品中多目標片段的PCR擴增產物進行檢測的方法和工具。
技術發案
本發明目的是通過以下方案達到的。
本發明提供一種修飾的PCR擴增引物，引物對至少其一的5′末端增加了一段標示序列；該標示序列呈線性，長度為5-50個鹼基，以15-25個為佳。
本發明還提供了一種PCR擴增產物檢測方法，該方法包括
1)製備m對本發明所述的修飾引物，其中所述標示序列的數量為m×n，其中m為靶片段數量，n為樣品份數；各標示序列彼此不同，且不相互雜交，各標示序列與待擴增片段既不相同也不雜交。
2)用該修飾引物進行PCR擴增；
3)分離去除游離引物；
4)混合擴增產物；
5)檢測標示序列。
本發明還提供了用於實施以上方法的試劑盒，其中包括
分裝於合適容器內的本發明所述修飾引物；
固定於固相支持物上的識別探針陣列，所述的識別探針可與所述標示序列或其互補序列特異性雜交；
以及說明書，其中說明，通過用所述引物所得靶片段擴增產物與所述識別探針陣列雜交來檢測擴增片段。
本發明的修飾引物包括基本引物和加於5′末端的修飾部分即標示序列，基本引物根據模板DNA的序列，按通用的引物設計原則來設計(可參閱專著《聚合酶鏈反應》；(美)穆裡斯(K B Mullis)等著，陳受宜等譯。北京科學出版社，1997；)，也可以利用商業軟體或從Internet網上下載專用的軟體(如primerpremier4.0)來設計引物對。本發明所述的修飾在於其中至少一條基本引物的5′端加有一段前文所述的標示序列。本發明引物的合成完全按照常規方法進行。
在如本發明所述檢測多樣品中多片段擴增產物時，本發明的標示序列是用來標記各份樣品中各目標核酸片段的一段獨特核苷酸序列。即在同一次分析中，對於某份樣品中的某一特定目標核酸，只有唯一的標示序列與之對應。為了保證PCR擴增的如常進行，各標示序列彼此不雜交，且不與待擴增片段雜交。此外，為了避免假陽性，以上獨特標示序列與任一靶片段的序列不相同。根據樣品數量、每個樣品中目標核酸片段的數目、序列、需要獲取的信息類型就可以確定所需獨特標示序列的數量。而由於4種核苷酸與不同序列長度排列組合的無窮性，很容易實現所述數量的獨特性要求。例如，有n份不同來源的樣品，各有m種不同靶序列，則需要m×n種獨特標示序列。本發明所述的多份樣品可以是來自不同來源和/或代表不同的反應體系。
由於本發明的標示序列對於PCR擴增反應本身沒有影響，因此，本發明的PCR過程完全參照常規進行。
為了避免游離引物造成假陽性，需要將擴增產物與游離的過量引物分離。本發明已知的多種方法均可採用。例如電泳法(參加《現代分子生物學實驗技術》，盧聖東主編；《第四屆全國毛細管電泳及相關微分離學術報告會論文集》等)，層析法(參加《分子克隆實驗指南》等)，以及利用配體親和力進行的分離。例如，可利用生物素和鏈親和素的親和作用設計固定化的捕獲探針，將擴增產物捕獲分離。具體方法如下設計併合成一段序列與靶序列所在鏈互補的捕獲探針，並用生物素標記，將其加入含鏈親合素包裹磁珠的溶液中反應一定時間，形成捕獲體。將各樣品擴增產物變性並混合後加入含捕獲體的雜交緩衝液中，在適當溫度下保溫一定時間，然後用磁分離器分離磁珠即可獲得含靶序列的擴增產物混合物，小心吸淨管中溶液，然後用3倍體積的適宜緩衝液(如3×SSC緩衝液)清洗磁珠三次。最後向管中加入適宜體積的純水或預雜交緩衝液，在高於雜交體解鏈溫度(Tm)10℃的溫度下保溫5分鐘，以釋放含靶序列的各擴增產物。也可以用鏈親和素包壁的微量離心管代替鏈親和素包裹的微磁珠來實現上述目的。還可以利用抗原和抗體之間，以及其它受體與配體之間的親和作用代替生物素和鏈親合素實施以上分離。
採用適當的方法分析擴增產物的標示序列，就可以將各樣品的擴增產物混合後，在同一檢測系統中測知各個樣品中各種目標核酸片段的存在情況。可用的分析方法有例如質譜法(參見O』Donnell M.J.，Tang K，等，Analytical Chemistry，1997，692438-2443)，SPR(參見Threil A.J.等，Analytical Chemistry，1997，694948-4956)以及固相雜交法。其中較好的分析方法是用固相雜交方法同時分析全部被測樣品中目標核酸擴增產物的標示序列，包括以下步驟
製備識別探針，並有序固定在固相支持物上形成陣列；
標記所述擴增產物；
所述擴增產物與識別探針固相雜交；
檢測所述標記的位置和/或強度。
識別探針含有一段與標示序列或其互補序列基本互補或可特異性雜交的核酸序列。為了簡化過程，實現在統一的雜交系統中完成來自多份樣品的多種核酸擴增產物與各自識別探針的固相雜交，同時提高檢測的準確性，不同識別探針與其互補序列形成的雜交體在方法選定的雜交條件下應具有相同或相近的解鏈溫度。由於一定長度核酸序列中四種鹼基的排列組合方式非常多，這使得本發明的擴增引物中標示序列的設計有非常大的選擇餘地，本領域技術人員根據現有技術不難做成這樣的選擇。
識別探針的製備方法與擴增引物相同。實施本發明時需要將識別探針有序固定在某種固相支持物上。所說固相支持物包括但不限於各種尼侖膜、硝酸纖維素膜、濾紙、經修飾的玻璃或矽片、雲母片等。固定支持物和方法均為本領域的公知技術。
如果採用固相雜交法進行檢測，需要先將擴增產物變性。變性PCR擴增產物也是本領域的常規技術。例如，通常可以將擴增產物加熱至94～98℃，並保溫2-15min，然後迅速置冰上。也可用鹼變性然後中和的方法。
在如本發明所述對於多樣品或多來源多目標分析時，各份樣品的擴增產物可以先混合，然後一起變性，也可以先各自變性，然後再混合。
為了進行本發明的分析，可用本領域已知的各種標記技術對擴增產物進行標記。可以在本發明所述引物的5′端連接標記基因，所述標記基因包括但不限於地高辛分子(DIG)，生物素分子(Bio)，螢光基因(如Cy3 Cy5等)，鹼性磷酸酶(AP)，辣根過氧化物酶(HRP)。這些標記及其標記方法都已是本領域眾所周知的常規技術。也可以在目標核酸的擴增過程中標記擴增產物。例如可以採用引物標記法，也可以採用摻入法等，可參閱文獻(王申五主編《基因診斷技術-非放射性操作手冊》一書)。所述的標記包括但不限於同位素標記，以及螢光物質(如Cy3，Cy5，螢光素等)、地高辛、鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶等非放射性物質標記。
將分離出來的含標示序列的擴增產物混合物加至一定體積的預雜交緩衝液中，作為固相雜交緩衝液。固相雜交時，可先將識別探針組成的陣列與預雜交緩衝液在一定溫度下進行一定時間的預雜交，當然也可以根據情況不預雜交；然後在一定溫度下與固相雜交緩衝液進行一次一定時間的固相雜交操作。然後，根據標記信號在固相支持物上的位置、強度等信息獲取多份被測樣品中的多種目標核酸片段有關序列、含量、來源等信息。
本發明所用的固相雜交操作都是本領域的經典方法，本領域一般技術人員依據經驗很容易確定有關緩衝液、探針和樣品濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。或者，也可參照，王申五主編《基因診斷技術-非放射性操作手冊》一書。
發明效果
本發明用含一段標示序列的擴增引物，代替常規的擴增引物來區別標記待測的各種目標核酸片段。這樣，通過一次PCR擴增和一次固相雜交，使用一種檢測標記，就可以實現一次性檢測多樣品中的多目標核酸擴增產物，同時獲取核酸片段序列、來源、多態性，和含量等多方面信息。此外，本發明的試劑盒極大地方便了方法的使用者。因此，本發明推動PCR擴增方法在多樣品多目標核酸分析中的應用。尤其適合生物晶片的開發與應用。
圖1是實施例一的檢測結果。
圖2是實施例二的檢測結果。
優選實施方式
以下實施例是對本發明更詳細的說明，而不是對本發明範圍的限定。
實施例一
三個樣品中同一目標核酸片段的擴增分析
在本實施例中，前文所述的樣品份數n等於3，靶片段數量m等於1。＿＿材料
購自pGEM 4Z質粒 上海生工生物工程公司dNTP(N＝A，T，C，G) 上海生工生物工程公司Tag酶(包括10×buffer) 上海生工生物工程公司MgCl2(25mM) 上海生工生物工程公司DIG-dUTP Roche Inc鏈親合素包裹的磁珠Roche IncDIG核酸檢測試劑盒(包括抗DIG-AP複合物，封閉劑，NBT/BCIP) Roche IncEasyHyb雜交液 Roche Inc尼龍膜Roche IncBio-Rad真空點樣系統 Bio-Rad Laboratories Inc
自配20×SSC 88.2g/L檸檬酸鈉，175.3g/L NaCl，pH 7.0(20℃)洗膜緩衝液I 2×SSC，0.1％SDS洗膜緩衝液II 0.1×SSC，0.1％SDS顯色緩衝液I 0.1M順丁烯二酸，1M NaCl，pH 7.5(20℃)顯色緩衝液II 含1％封閉劑的顯色緩衝液I顯色緩衝液III 100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，
pH9.5(20℃)顯色緩衝液IV 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0(20℃)磁珠結合緩衝液100mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH 7.5磁珠洗滌緩衝液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH 7.51.樣品的製備
取pGEM 4Z(1μg/μl)質粒5μl置0.2ml微量離心管中，依次加入BamH I內切酶的10×緩衝液5μl，乙醯化BSA5μl，H2O 34μl和BamH I內切酶1μl混勻，37℃保溫2.5小時；然後將酶切產物中加5μl NaAc溶液(3mol/L，pH5.2)混勻，加入-20℃乙醇110μl混勻，-20℃放置1小時。12000g離心5min，棄去上清，晾乾，加入H2O 100μl，得線性pGEM 4Z溶液。本實施例以此線性化的pGEM4Z質粒作為有待檢測的靶序列片段。
取三支微量離心管分別記為Y1(即樣品1)，Y2和Y3。其中的組成分別為樣品號 組成Y1 1μl片段線性pGEM 4Z溶液+9μlH2OY2 10μlH2OY3 0.8μl線性pGEM4Z溶液+9.2μlH2O2.引物的沒計和製備
以前文所述線性化pGEM4Z質粒為模板，按照常規設計基本擴增引物。然後，如本發明前文所述，為每份樣品中的目標核酸片段設計獨特的標示序列。將該標示序列置於基本引物之一(P1)的5′端，構成完整的本發明擴增引物。其中，下標表示用於不同的樣品，序列中帶下劃線的是標示序列
引物1(P1)
P115′ATATAGGTATGGATTAGGATGTAGTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′
P125′AATTGGAATTGAGTATAGGGGATTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′
P135′AGGTATAGGTATAGGTATAGGTATTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA 3′
引物2(P2)
P2 5』GATGCTGAAGATCAGTTGGGTGC 3』
將以上設計的引物用DNA合成儀分別合成1OD，向每種引物中加入100μlH2O，振搖使溶解，加適量水，調整引物溶度為2.5μM。3.捕獲探針的設計和製備
按要求為靶序列片段的擴增產物設計捕獲探針
5′Bio-TTTTTTTTTGGTTACATCGAACTGGATCTC 3′
將設計好的捕獲探針用DNA合成儀合成1OD，並加適量水溶液使終濃度為2.5μM。4.識別探針的設計和製備
根據引物P11，P12，P13中所含標示序列設計可與之雜交的識別探針如下
T15′CTACATCCTAATCCATACCTATAT 3』
T25′AATCCCCTATACTCAATTCCAATT 3』
T35′ATACCTATACCTATACCTATACCT 3』
將設計好的識別探針分別用DNA合成儀合成1OD，並加適量水溶解，使終濃度為250μM。5.靶序列的擴增
取三支0.2ml薄壁微量離心管，各試管中加入
然後向三支試管中加入相同的PCR擴增系統，組成如下dATP(2mM)5μl，dCTP(2mM)5μl，dGTP(2mM)5μl，dTTP(2mM)4.8μl，DIG-dUTP(1mM)0.2μl，10×buffer(pH 8.6-8.7)5μl，MgCl2(25mM)5μl，Tag酶(2.5U)0.5μl，加水至50μl混勻，按下述程序在Bio-Rad的Therm CycleTM擴增儀上擴增94℃，5min；(94℃，45S；55℃，45S；72℃，1min)×35；72℃，5min。
將各擴增管溶液混合，置98℃變性10min，迅速置冰上，備用。6.磁珠捕獲擴增產物，
吸取鏈親合素包裹的磁珠(1mg/ml)10μl，置0.2ml離心管中，用磁分離器分離，棄去上清液，用200μl結合緩衝液洗磁珠三次。將磁珠懸浮於190μl結合緩衝液中，加入捕獲探針(2.4μM)30μl，混勻，室溫靜置30min，分離磁珠，棄上清，用40μl洗滌液洗磁珠3次，5×SSC 40μl洗1次，分離磁珠，棄上清，然後向磁珠管中加入5×SSC 50μl和15μl混合變性擴增產物，室溫雜交捕獲30min分離磁珠，用40μl洗滌緩衝液洗三次，40μl H2O洗一次，然後將磁珠懸浮於10μl H2O中，98℃保溫10min，取出迅速分離磁珠，吸取上清液加入50μl EasyHyb溶液中，混勻備用。7.識別探針的點樣。
將尼龍膜在雙蒸水中浸溼。
將溼的尼龍膜置於真空點樣器上，擰緊緊固螺絲，確保各樣品孔間不會產生交叉滲漏。
在每一點樣孔中加入0.5mlTE緩衝液，真空抽盡溶液後關閉真空泵。
分別吸取每種識別探針溶液1μl分置於3支0.5ml微量離心管中，各加入0.4mol/L NaOH，10mmol/L EDTA溶液至終體積為100μl。然後，如圖1所示，分別將上述溶液全部加入相應的點樣孔，形成3×4的矩陣，每種識別探針點1排，每排為代表4次平行實驗的4點。打開真空泵至溶液剛好抽乾關閉泵。
每孔再加0.2ml 0.4mol/L NaOH，10mmol/L EDTA溶液，真空抽乾後關閉泵。
使系統連通大氣後，拆下點樣器，取出膜在2×SSC緩衝液中浸一下，在空氣中涼幹，然後置80℃烘烤1小時，備用。8.固相雜交
將固定有各識別探針的尼龍膜置於大小適當的塑膠袋中。
向袋中加入1ml EasyHyb緩衝液，然後35℃水浴保溫5min。
將袋剪去一角，傾出預雜交液。
向袋中加入捕獲分離的擴增產物的EasyHyb溶液。
將袋置35℃水浴中保溫1小時。
取出袋，剪去一角，傾出探針溶液。
向袋中加入等量適量的洗膜緩衝液I，室溫洗膜30min。
傾出洗膜緩衝液I，再向袋中加入等量適量的洗膜緩衝液II，洗膜30min。9.顯色
將袋剪開，取出膜作上標記，按以下步驟顯色
在適量顯色緩衝液I中洗膜1min。
在適量顯色緩衝液II中室溫放置30min。
用顯色緩衝液II以1∶5000比例稀釋Anti-DIG-AP複合物溶液(取0.5μl抗DIG-AP複合物+2.5ml顯色緩衝液II)。
將膜置上述溶液中室溫放置30min。
將膜置適量顯色緩衝液I中洗2次，每次15min。
將膜置適量顯色緩衝液III中平衡2min。
取20μl NBT/BCIP貯備液加至1ml顯色緩衝液III中，混勻。
將膜置於上述新鮮配製的1ml顯色液中暗處放置至顯出斑點為止，勿振搖。
將膜取出，置適量顯色緩衝液IV中1min以終止反應。
將膜拍照，涼幹保存。10.結果
如附圖1所示，其中，第一排為識別探針T1，識別加入樣品Y1的引物P11。此排雜交陽性，說明樣品Y1擴增後產物陽性。第二排為識別探針T2，識別加入樣品Y2的引物P12。此排雜交陰性，說明樣品Y2未發生可測擴增。第三排為識別探針T3，識別加入樣品Y3的引物P13。此排雜交陽性，說明樣品Y3擴增後產物陽性。以上試驗結果與已知情況完全吻合。
實施例二
二個樣品中B肝病毒DNA P區基因片段和Pre C區基因片段的同時檢測
在本實施例中，前文所述的樣品份數n等於2，靶片段數量m等於2。材料
同實施例一，但還需以下試劑
1.裂解液(K蛋白酶10mg/ml，10mM Tris-HCl(pH7.8)，10mM EDTA，2％SDS)
2.酚/氯仿/異戊醇(體積比25∶24∶1)
3.預冷100％乙醇
4.預冷75％乙醇
1.樣品的製備
分別取100μlB肝病人血清兩份，記為Y1和Y2，加300μl裂解液，60℃保溫2小時；加入400μl酚/氯仿/異戊醇，充分震蕩混勻，13000轉/秒離心10分鐘，取上清液300μl加800μl預冷100％乙醇，混勻後於-70℃靜置40分鐘。13000轉/秒離心15分鐘後棄去上清，用200μl預冷75％乙醇清洗沉澱，然後離心棄去上清，沉澱風乾後用20μl無菌水溶解，備用。
2.引物的設計和製備
如實施例1所述，為兩個樣品中B肝病毒(HBV)DNA的P區基因片段和Pre C區基因片段設計如下擴增引物，其中的下標數字代表樣品來源即樣品編號，下標字母表示該引物對應的模板
引物1(P1)編號序列
Y1中的P區
P11P 5′-ATGGATTAGGATGTAGCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′
Y1中的Pre C區
P11PC5 ′-TTGAGTATAGGGGATTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′
Y2中的P區
P12P5′-GTATAGGTATAGGTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′
Y2中的Pre C區
P12PC 5′-TGGTAATGGTAATGGTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′
引物2(P2) 序列
P區的P2P 5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′
Pre C區的P2PC5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′
以上，下劃線表示標示序列所在，共16個核苷酸。將以上設計的引物用DNA合成儀分別合成1OD，向每種核酸探針中加入適量水振搖使溶解，調整引物溶度為10pmol/μl。
3.捕獲探針的設計和製備
如實施例1所述，分別為B肝病毒DNA的P區和Pre C區基因片段的擴增產物設計捕獲探針(D1和D2)
P區-D1 Bio-5′-TTTTTTTTTGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGA-3′
Pre C區-D2 Bio-5′-TTTTTTTTTGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACT-3′
將設計好的二個捕獲探針用DNA合成儀各合成1OD，並加適量水溶液使終濃度為2.5μM。
4.識別探針的設計和製備
根據引物P11P，P11PC，P12P，P12PC中所含標示序列設計可與之雜交的識別探針如下
T1P5′-CTACATCCTAATCCAT-3′
T1PC 5′-AATCCCCTATACTCAA-3′
T2P 5′-ATACCTATACCTATAC-3′
T2PC 5′-ACCATTACCATTACCA-3′
將設計好的識別探針分別用DNA合成儀合成1OD，並加適量水溶解，使終濃度為500μM，然後加等體積的6×SSC緩衝液。
5.靶核酸的擴增
取兩支0.2ml薄壁微量離心管，各試管中加入
然後向三支試管中加入相同的PCR擴增系統，組成如下dATP(2.5mM)3μl，dCTP(2.5mM)3μl，dGTP(2.5mM)3μl，dTTP(2.5mM)2.8μl，DIG-dUTP(1mM)0.2μl，10×緩衝液(pH8.6-8.7)3μl，MgCl2(25mM)3μl，Tag酶(2.5U)1μl，加水至30μl混勻，按下述程序在Bio-Rad的Therm Cycle TM擴增儀上擴增94℃，5min；(94℃，30s；45℃，30s；72℃，30s)×35；72℃，5min。
將各擴增管溶液混合，置98℃變性10min，迅速置冰上，備用。
6.磁珠捕獲擴增產物，
吸取鏈親合素包裹的磁珠(1mg/ml)10μl，置0.2ml離心管中，用磁分離器分離，棄去上清液，用200μl結合緩衝液洗磁珠三次。將磁珠懸浮於180μl結合緩衝液中，加入兩種捕獲探針D1和D2(2.5μM)各20μl，混勻，室溫靜置30min，分離磁珠，棄上清，用40μl洗滌緩衝液洗磁珠3次，5×SSC 40μl洗1次，分離磁珠，棄上清，然後向磁珠管中加入5×SSC 50μl和15μl混合變性擴增產物，室溫雜交捕獲30min，分離磁珠，用40μl洗滌緩衝液洗三次，40μl H2O洗一次，然後將磁珠懸浮於10μl H2O中，98℃保溫10min，取出迅速分離磁珠，吸取上清液加入40μl 6.2×SSC溶液中，混勻備用。
7.識別探針的點樣。
用排針蘸取各識別探針溶液點在預先洗乾淨的載玻片上，每種探針重複4次。將點好的載玻片用8W紫外燈(最好是將載玻片倒扣在紫外分析儀的窗口上)照射30分鐘，然後置沸水中浸15秒，取出晾乾。
8.固相雜交
1)向90μl變性的混合擴增產物溶液中加入30μl 20×SSC緩衝溶液混勻，取20μl加至識別探針微陣列上，小心蓋上蓋玻片，不要有氣泡，在溼盒中25℃雜交1小時。取出載玻片，用2×SSC，0.1％ SDS緩衝液衝掉蓋玻片，然後將載玻片迅速置於2×SSC，0.1％SDS緩衝液中室溫洗10min，然後再置於0.1×SSC緩衝液中洗5min，取出，晾乾。
9.顯色
1)用顯色緩衝液II以1∶5000比例稀釋Anti-DIG-AP複合物溶液(取0.5μ1抗DIG-AP複合物+2.5ml顯色緩衝液II)。
2)取20μl上述溶液加至識別探針微陣列上，小心蓋上蓋玻片，不要有氣泡，室溫放置30min。
3)將載玻片用適量顯色緩衝液I洗2次，每次1min。
4)將載玻片用適量顯色緩衝液III平衡2min。
5)取20μl NBT/BCIP貯備液加至1ml顯色緩衝液III中，混勻。
6)取一塊面積略大於微陣列的尼龍膜置於上述新鮮配製的1ml顯色液中浸透，取出漓幹，然後將載玻片上的微陣列反扣在膜上暗處放置至顯出斑點為止。
7)將膜置適量顯色緩衝液IV中1min以終止反應。
8)將膜拍照，涼幹保存。
10.結果
如圖2所示，第一排為探針T1p，識別標示序列引物P11p；第二排為探針T1pc，識別標示序列引物P11pc；第三排為探針T2p，識別標示序列引物P12p；第四排為探針T2pc，識別標示序列引物P12pc。結果顯示雜交均呈陽性，由此判斷樣品Y1和Y2都同時含有HBV DNA的P區基因片段和Pre C區基因片段。而且，一式四份平行試驗具有良好的重複性。表明檢測結果與已知的實際情況完全吻合。
實施例三
二個樣品中B肝病毒DNA P區基因片段和Pre C區基因片段的同時檢測
本實施例與實施例二不同之處在於修飾引物5』端的標示序列長度為6個核苷酸
1.引物的設計和製備引物1(P1)編號 序列Y1中的P區P11P5′-ATGTAGCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′Y1中的Pre C區P11PC 5′-GGGATTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′Y2中的P區P12P5′-AGGTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3′Y2中的Pre C區P12PC 5′-AATGGTAGGAGTTGGGGGAGGAGATT-3′引物2(P2) 序列P區的P2P5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′Pre C區的P2PC 5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′
將以上設計的引物用DNA合成儀分別合成1OD，向每種核酸探針中加入適量水振搖使溶解，調整引物溶度為10pmol/μl。
2.識別探針的設計和製備
根據引物P11P，P11PC，P12P，P12PC中所含標示序列設計可與之雜交的識別探針如下
T1P 5′-ACCTTGCTACAT-3′
T1PC 5′-ACTCCTAATCCC-3′
T2P 5′-ACCTTGATACCT-3′
T2PC 5′-ACTCCTACCATT-3′
將設計好的識別探針分別用DNA合成儀合成1OD，並加適量水溶解，使終濃度為500μM，然後加等體積的6×SSC緩衝液。
由於識別探針較短，固相雜交的溫度應調整為20℃，其他操作、條件、樣品、材料等均與實施例二相同。所得結果與實施例二類似。
實施例四
二個樣品中B肝病毒DNA P區基因片段和Pre C區基因片段的同時檢測
本實施例與實施例二不同之處在於修飾引物5』端的標示序列為50mer。
1.引物的設計和製備引物1(P1)編號序列Y1中的P區 5′-P11P AAGCTACGTACGGAACTTAACTTGATGTCTCTAAGCACGTTATCGATACTCAAGGTATGTTGC
CCGTTTGTCC-3′Y1中的Pre C區 5′-P11PCCCAATAGAGCACCCGGTGAACAAATAAATCAACGGCAAAACATCTGTATAAGGAGTTGGGGGA
GGAGATT-3′Y2中的P區 5′-P12P TTCTGCTGCCTCTACTCGCCATCATTTGTTTCCACAGTATTAATACAAGACAAGGTATGTTGC
CCGTTTGTCC-3′Y2中的Pre C區 5′-P12PCCACCGTTTCAGGTTACATTAAAGATCTATTGCGATATGATTGCGGTTAGCAGGAGTTGGGGGA
GGAGATT-3′引物2(P2) 序列P區的P2P 5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′Pre C區的P2PC5′-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3′
將以上設計的引物用DNA合成儀分別合成1OD，向每種核酸探針中加入適量水振搖使溶解，調整引物溶度為10pmol/μl。
4.識別探針的設計和製備
根據引物P11P，P11PC，P12P，P12PC中所含標示序列設計可與之雜交的識別探針如下T1P 5』-AGTATCGATAACGTGCTTAGAGACATCAAGTTAAGTTCCGTACGTAGCTT-3』T1PC 5′-TATACAGATGTTTTGCCGTTGATTTATTTGTTCACCGGGTGCTCTATTGG-3′T2P 5′-TCTTGTATTAATACTGTGGAAACAAATGATGGCGAGTAGAGGCAGCAGAA-3′T2PC 5′-GCTAACCGCAATCATATCGCAATAGATCTTTAATGTAACCTGAAACGGTG-3′
將設計好的識別探針分別用DNA合成儀合成1OD，並加適量水溶解，使終濃度為500μM，然後加等體積的6×SSC緩衝液。
由於識別探針較長，固相雜交的溫度應調整為50℃，其他操作、條件、樣品、材料等均與實施例二相同。所得結果與實施例二類似。
實施例五
試劑盒
本試劑盒是用於擴增檢測12個水溶液樣品中是否會含有pGEM 4Z的。本試劑盒應貯存於4℃。
本試劑盒的組成
1.14支擴增管
取14支擴增管，分別編號。其中，1-12號管為樣品擴增管，第13號為陽性對照擴增管，第14號為陰性對照擴增管。每管分別含有引物P11-14和引物P2以及10×緩衝液，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP-Cy5，Mg2+，Tag酶，H2O等組成的擴增系統。
2.陽性對照管
含5μl 1ng/μl的線性pGEM 4Z質粒。
3.含捕獲探針的磁珠溶液.
含10μl 1mg/ml結合有生物素標記捕獲探針的鏈親合素包壁磁珠。
4.洗滌緩衝液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH 7.5
5.雜交緩衝液5×SSC，20mM磷酸緩衝液，5×Denhardt氏溶液，10％硫酸葡聚糖，100ug/ml變性的鮭魚精DNA片段。
6.識別探針陣列
在載玻片上由十二個識別探針和1個陽性對照識別探針1個陰性識別探針組成的2×7的微陣列。
7.試劑盒使用說明書
使用本試劑盒時，還需要使用者自備以下材料
30×SSC132.3g/L檸檬酸鈉，263.0g/L NaCl，pH 7.0(20℃)；
10％SDS；
蓋玻片。
1.樣品中目標核酸的擴增
取12份樣品分別標為1號，2號……12號，每支管吸取5μl分別加至對應管號的擴增管中，混勻。另取陽性對照5μl加至13號管中，再加5μl H2O至14號管中作為陰性對照，按以下程序擴增94℃，5min；(94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min)×35；72℃，5min。
2.擴增產物的捕獲
將各擴增產物混合後98℃保溫10min，迅速置冰上，吸取70μl加至含磁珠溶液的管中，加30×SSC緩衝液10μl，輕輕搖勻，室溫放置30min，然後用磁珠分離器分離磁珠，棄上清，並用120μl洗滌緩衝液洗3次，120μl H2O洗1次，最後將磁珠懸浮於30μlH2O中，98℃保溫10min，迅速分離磁珠。小心吸取全部上清液加入10μl 20×SSC雜交緩衝液中。
3.固相雜交
將上述雜交溶液加至識別探針微陣列上，小心蓋上蓋玻片，不要有氣泡，在溼盒中35℃雜交1小時。取出載玻片，用2×SSC，0.1％SDS緩衝液衝掉蓋玻片，然後將載玻片迅速置於2×SSC，0.1％ SDS緩衝液中室溫洗10min，然後再置於0.1×SSC緩衝液中洗5min，取出，晾乾。
4.檢測
將載玻片置於雷射共聚焦掃描儀的平臺上，在合適的條件下檢測雜交產生的螢光信號。根據陽性信號和陰性信號是否正常判定檢測的可信度，根據螢光信號的位置來判定1號-12號樣品中所含pGEM 4Z質粒的情況。
權利要求
1.一種修飾的PCR擴增引物，所述的修飾在於引物對中至少其一的5′末端增加一段標示序列；該標示序列呈線性，長度為5-50個鹼基。
2.根據權利要求1所述的引物，所述標示序列的長度為15-25個鹼基。
3.一種檢測PCR擴增產物的方法，該方法包括
1)製備m對權利要求1所述的引物，其中所述標示序列的數量為m×n，其中m為靶片段數量，n為樣品份數；各標示序列彼此不同，且不相互雜交，各標示序列與待擴增片段既不相同也不雜交。
2)用所述引物進行PCR擴增；
3)分離去除游離引物；
4)混合擴增產物；
5)檢測標示序列。
4.根據權利要求3所述的方法，該方法還包括製備識別探針，並有序固定在固相支持物上形成陣列，所述識別探針含有一段與標示序列或其互補序列基本互補的核酸序列；標記所述擴增產物；變性擴增產物；並通過固相雜交法檢測標示序列。
5.一種試劑盒，其中包括
分裝於容器內的權利要求1所述引物；
固定於固相支持物上的識別探針陣列，所述的識別探針含有與所述標示序列或其互補序列基本互補的核酸序列；
以及說明書，其中說明，通過用所述引物所得靶片段擴增產物與所述識別探針陣列雜交來檢測擴增片段。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中還包括固定有捕獲探針的磁珠溶液，所述捕獲探針與目標擴增片段特異性雜交。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，所述的磁珠為結合有生物素標記捕獲探針的鏈親合素包壁磁珠。
全文摘要
本發明提供一種修飾的PCR擴增引物，引物對至少其一的5′末端增加了一段獨特標示序列。本發明還提供了一種PCR擴增產物檢測方法，該方法包括製備m對本發明所述的引物，其中所述獨特標示序列的數量為m×n，其中m為靶片段數量，n為樣品份數；從而可在同一檢測系統中根據標示序列檢測不同樣品中的不同擴增產物。本發明還提供了用於實施以上方法的試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1410543SQ0112692
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月29日 優先權日2001年9月29日
發明者邢軍芬 申請人:上海百傲科技有限公司