Hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用的製作方法
2023-07-23 22:34:46
Hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用。MTT法、流式細胞術和Transwell實驗顯示hsa-miR-503可以有效降低膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，並且增加膠質瘤細胞的凋亡；qPCR檢測顯示hsa-miR-503在膠質瘤組織或細胞系中呈低表達。這些結果表明hsa-miR-503可用於製備治療膠質瘤藥物，其表達水平可作為膠質瘤診斷的指標。一種治療膠質瘤的藥物包含hsa-miR-503和/或其前體。一種hsa-miR-503的檢測試劑盒，包括實時螢光定量PCR試劑、miR-503和內參的正向引物和反向引物。本發明為膠質瘤的診斷與治療提供了新的方向。
【專利說明】Hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於生物醫學材料【技術領域】，具體涉及hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0003]神經膠質瘤簡稱膠質瘤，是發生於神經外胚層的腫瘤，為最常見的顱內腫瘤，約佔45%。膠質瘤的分類方法很多，以星形細胞瘤最多見。目前我國膠質瘤發病率正逐年上升，但常規的手術治療及放化療的療效並不理想，且患者隨著病理級別增高病程縮短、死亡率增高。另外，膠質瘤不容易早期發現，自出現症狀至就診時間一般多為數月甚至數年。
[0004]MicroRNA簡稱miRNA，是一類長度在18-22個鹼基的核苷酸序列，具有調控靶基因轉錄後翻譯的作用。miRNA在動物、植物和酵母等生物中普遍存在，是一類在進化上高度保守的小分子單鏈RNA。它通過與mRNA的剪切或者對其翻譯的抑制，從而下調靶基因的表達。目前，科學家已證實miRNA在腫瘤細胞增殖、凋亡、分化及促進血管生成等方面均具有重要的調控作用。有研究表明，miRNA在膠質瘤的發病過程中也發揮了重要作用。Gabriely等發現在膠質瘤中過表達miR-21可通過抑制Reck和Timp3的表達而激活MMP (matrixmetallopeptidase),從而增強腫瘤的侵襲能力(Gabriely G, Wurdinger T, Kesari S,etal.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinaseregulators.Mol Cell Biol.2008; 28 (17): 5369-80.XGillies 等發現miR-221/miR_222可通過細胞周期調控細胞的增殖過程。Kefas等發現了 miR-7可以降低IRS-1 (insulinreceptor substrate I)和IRS-2等蛋白的表達，從而抑制AKT和ERK1/2的信號(GilliesJK, Lorimer IA.Regulation of p27Kipl by miRNA 221/222 in glioblastoma.CellCycle.2007 Aug 15; 6 (16):2005-9.)?經鑑定，miRNA在多種腫瘤包括膠質瘤中的表達譜發生變化，這為診斷和治療膠質瘤提供新的基因靶點和分子標記。
[0005]根據高通量的miRNA基因晶片和qPCR的定量分析，(Bisheng Zhou, RuihuaMab, Wenxia Si, et al.MicroRNA-503 targets FGF2 and VEGFA and inhibits tumorangiogenesis and growth.Cancer Lett 2013; 333: 159-69.Xu YY, Wu HJ, Ma HD etal.MicroRNA-503 suppresses proliferation and cell-cycle progression ofendometrioid endometrial cancer by negatively regulating cyclin Dl.FEBS J 2013;280: 3768-79.)的研究顯示，在多種腫瘤組織中hsa-miR-503的表達譜與正常組織或癌旁組織對比均發生明顯的變化。而目前尚無關於hsa-miR-503與膠質瘤診斷和治療的報導。
[0006]綜上所述，目前迫切需要診斷和治療膠質瘤的有效方法，而miRNA (hsa-miR-503)的發現和研究使其有望成為新一代診斷和治療惡性膠質瘤的小分子靶標。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用。
[0008]本發明的目的還在於提供一種治療膠質瘤的藥物。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:
MTT法、流式細胞術和Transwell實驗顯示hsa-miR-503可以顯著抑制人膠質瘤細胞系U87MG的生長，促進U87MG的凋亡，抑制U87MG的遷移和侵襲。這些結果表明hsa-miR-503可以有效降低膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，並且增加膠質瘤細胞的凋亡。因此hsa-miR-503可用於膠質瘤患者的輔助治療，用於製備治療膠質瘤藥物。
[0010]一種治療膠質瘤藥，包含hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體；其中，hsa-miR-503 序列為:UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG ；
hsa-miR-503 前體序列為:UGCCCUAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAGUGAGCGAUCG ⑶GCUCUGGG⑶ AU腳UUCCGCUGCCAGG⑶ A。
[0011]一種能表達hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體的載體。
[0012]qPCR (實時螢光定量PCR)檢測結果顯示hsa_miR-503在膠質瘤組織或細胞系中呈低表達，表明hsa-miR-503可能對膠質瘤起到抑癌作用，並且hsa-miR-503表達水平可以作為膠質瘤診斷的指標。
[0013]一種hsa-miR-503的檢測試劑盒:包括實時螢光定量PCR試劑、miR-503和內參的正向引物和反向引物；所述的內參優選為U6。該試劑盒可用於診斷膠質瘤。
[0014]本發明相對於 現有技術具有如下優點和效果:
(I)本發明發現了 hsa-miR-503可以降低膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，並且增加膠質瘤細胞的凋亡。
[0015](2)Hsa-miR-503為內源性RNA，目前在動物體內miRNA的生物合成過程已經得到了較為詳盡的詮釋，具有無刺激、可以將hsa-miR-503的前體序列構建到某種載體，今後作為新型藥物用於抗膠質瘤的臨床治療。
[0016](3)本發明發現hsa-miR-503的表達水平可以作為膠質瘤診斷的指標，根據hsa-miR-503的表達水平為臨床提供診斷和治療提供依據。
[0017](4) miRNA對腫瘤診斷的準確性要遠遠高於mRNA,而miRNA比mRNA更有優勢的是miRNA可用於常規福馬林固定，石蠟包埋的標本。
[0018](5)本發明為膠質瘤的診斷與治療提供了新的方向。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是qPCR檢測hsa-miR-503在人腦細胞、人膠質瘤細胞以及U87MG中的相對表達水平圖。
[0020]圖2是MTT法檢測hsa-miR-503對U87MG增殖影響的結果圖。
[0021]圖3是流式檢測hsa-miR-503對U87MG凋亡影響的結果圖，其中，*表示P值小於
0.05，**表示P值小於0.01。
[0022]圖4是Transwell實驗檢測hsa-miR-503對膠質瘤細胞遷移和侵襲影響的結果圖。【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0024]實施例1 qPCR分析hsaiiR-503表達
Cl)細胞系:U87MG和U251人惡性膠質瘤細胞系；兩種細胞系均來源於ATCC。
[0025]樣本準備:3例正常腦組織來自武漢大學人民醫院腦外科的腦挫傷患者；7例惡性膠質瘤組織為經臨床病理分析為IV級膠質瘤患者的手術標本，由武漢大學人民醫院腦外科提供且經過病人知情和同意。-80°C凍存，液氮運輸。
[0026](2)總RNA的提取=Trizol試劑提取細胞和組織的總RNA，Trizol試劑購自Invitrogen公司，具體步驟如下:
O向細胞培養皿中加入ImL Trizol，冰上放置lOmin，用槍頭反覆吹打混勻，轉移到RNase-free的1.5mL Ep管中；或在通風櫃中取新鮮組織0.1~0.2g置於勻漿器中，加入預冷的ImL Trizol，在冰浴中迅速勻漿30秒，以充分研碎組織，然後將細胞懸浮液吸入另一 RNase-free 的 1.5mL Ep 管中，冰上靜置 lOmin。
[0027]2)加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩30s後，室溫靜置lOmin。
[0028]3)4°C, 12000rpm離心 15min,將上層無色液體吸入至另一 RNase-free 的 1.5mL Ep管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置lOmin。
[0029]4) 4°C, 12000rpm 離心 lOmin。
[0030]5)棄上清,用ImL 75% (v/v)乙醇洗漆沉澱。
[0031]6) 4°C, 12000rpm 離心 5min。
[0032]7)棄上清，室溫乾燥lOmin，向Ep管中加入200 μ L DEPC水溶解沉澱物，於_80°C保存備用。
[0033]8)另取2 μ L RNA溶於98 μ L水中，分別測RNA的濃度和純度。
[0034]9)取5 μ L RNA進行瓊脂糖凝膠電泳(2% Agarose，I X TBE),檢測RNA質量。
[0035](3)逆轉錄:採用廣州市銳博生物科技有限公司的miR-503逆轉錄引物和Thermo的第一鏈合成試劑盒。反應體系及條件=RNA模板2 μ g,miR-503逆轉錄引物I μ L7DEPC水補齊至12μ?;每管分別混勻，65°C水浴5min，冰浴2min，然後再加入IOmM dNTP Mix 2 μ L，Reaction Buffer 4 μ L, Ribolock RT I μ L, Rever Aid RT I μ L ;混勻後 42°C, 60min ;70°C，5min，置於冰上。
[0036](4)qPCR:運用 GeneCopoeia 公司 All-1n-OneTM qPCR mix進行 qPCR,米用 Bio-Rad公司 iCycler thermal cycler PCR 儀。
[0037]反應體系:2XqPCR Mix 10 μ L，正向引物2 μ L，反向引物2 μ L，cDNA模板2 μ L，ddH20 4 μ Lo內參為U6 (qPCR試劑盒、miR-503與內參的正向引物和反向引物採購於廣州市銳博生物科技有限公司)。qPCR反應程序為:95°C預變性5分鐘，95°C變性10秒，60°C退火20秒，70°C延伸10秒，其中變性、退火、延伸為40個循環。
[0038]qPCR結果如圖1所示:與正常腦組織相比，惡性膠質瘤組織或細胞系中的hsa-miR-503表達水平明顯降低,表明hsa-miR-503可能對膠質瘤起到潛在的抑癌作用，並且hsa-miR-503表達水平可以作為膠質瘤診斷的指標。
[0039]實施例2 hsa-miR-503對膠質瘤細胞增殖的影響採用MTT法檢測細胞增殖能力，選擇人膠質瘤細胞系U87MG。以轉染隨機序列miR-NC(Negative Control, NC)為對照組，以轉染 hsa-miR-503 mimics (hsa-miR-503 模擬物)為實驗組。hsa-miR-503模擬物和隨機序列均由廣州銳博生物技術公司設計併合成(hsa-miR-503 mimics 序列為 「UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG」)。
[0040](I)接種細胞:將對數生長期的U87MG細胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養基配成單個細胞懸液，以每孔6000個細胞接種到96孔細胞培養板中，每孔體積100 μ L0
[0041](2)培養細胞和轉染:待12h後細胞貼壁，轉染50nmol hsa-miR-503 mimics或NC，每組重複6個孔，370C >5% CO2培養1-3天。
[0042]細胞轉染具體步驟如下:接種細胞12h後，待細胞融合度達到80%左右時進行轉染。將miRNA用opt1-DMEM稀釋於1.5mL Ep中，輕敲管壁混勻；將適量的Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)稀釋於另一 1.5mL Ep管中，輕敲管壁混勻；室溫靜置10分鐘，將兩管輕柔混合均勻，室溫靜置25分鐘。同時將細胞用PBS (0.01M, pH 7.4)洗三次，再加入上述混合液並補充一定量opt1-DMEM，培養箱培養6h後，用PBS衝洗細胞三遍，換用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養基培養。
[0043](3)呈色:分別培養24小時、48小時，72小時後，每孔加20 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄培養孔內上清；每孔加150 μ L DMSO,振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。
[0044](4)比色:選擇570nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度，記錄結果。
[0045]MTT結果如圖2所示:與對照組相比，轉染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細胞增殖能力明顯降低，表明hsa-miR-503可以抑制膠質瘤細胞的生長。
[0046]實施例3流式檢測hsa-miR-503對U87MG凋亡的影響
(I)在U87MG細胞中分別轉染50nmol hsa-miR-503 mimics和NC (轉染方法同實施例2),6小時後換液。
[0047](2)轉染48小時後對細胞用胰酶進行消化，並用冰上預冷的PBS (0.01M,pH 7.4)重懸，各加入 5μ L Annexin V-FITC 和 10 μ L propidium iodide(PI),冰上避光靜置 10 分鐘。
[0048](3)用流式細胞儀檢測凋亡並分析結果。
[0049]結果如圖3所示:與對照組相比，轉染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細胞凋亡水平明顯增加,表明hsa-miR-503可以促進膠質瘤細胞的凋亡。
[0050]實施例4 hsa-miR-503對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響
(O做遷移實驗不需要在transwell小室中預先加入基質膠，而做侵襲實驗需要提前12小時加入100 μ L 200mg/mL的基質膠(基質膠為BD公司生產)。
[0051](2)向24孔板中加入2mL，含20% (v/v)胎牛血清的DMEM，然後將transwell小室放入24孔板中。
[0052](3)向孔徑為8 μ m的transwell小室中分別加入3X IO4的U87MG細胞，用無血清的DMEM於37°C、5% CO2分別培養12小時(檢測遷移)和24小時(檢測侵襲)。
[0053](4)用甲醇漂洗transwell小室10分鐘，常溫放幹。
[0054](5)用0.5% (質量分數)結晶紫染色，然後用PBS (0.01M, pH 7.4)漂洗3次。
[0055](6)在200倍顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照，比較統計結果。[0056]結果如圖4所示:與對照組相比，轉染了 hsa-miR-503 mimics的U87MG細胞遷移和侵襲的細胞數目明顯減少，表明hsa-miR-503可以抑制膠質瘤細胞的遷移力和侵襲力。
[0057]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內 。
【權利要求】
1.hsa-miR-503在製備治療膠質瘤藥物中的應用。
2.一種治療膠質瘤的藥物，其特徵在於:包含hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體。
3.一種能表達hsa-miR-503和/或hsa-miR-503前體的載體。
4.一種hsa-miR-503的檢測試劑盒，其特徵在於:包括實時螢光定量PCR試劑、miR-503和內參的正向引物和反向引物。
5.根據權利 要求4所述的hsa-miR-503的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的內參為U6。
【文檔編號】A61P35/00GK103480004SQ201310456035
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】劉萬紅, 何小華, 陳雄, 彭碧文, 張瑩瑩 申請人:武漢大學