Ir-a和ir-b的定量用於腫瘤分類的製作方法

2023-09-23 00:59:05 4

專利名稱：Ir-a和ir-b的定量用於腫瘤分類的製作方法
IR-A和IR-B的定量用於腫瘤分類相關申請案的交叉引用本申請要求2009年10月12日提交的美國臨時申請No. 61/250，780的優先權，其全部內容通過引用整體併入序列表本申請含有以ASCII格式通過EFS-Web提交並且全部內容通過弓I用整體併入的序列表。2010年9月8日創建的所述ASCII拷貝命名為MED540. PCT. txt並且大小為48，948位元組。I.背景公開領域不受限制地，本公開涉及用於檢測和定量樣本(例如組織樣本)中胰島素受體亞型A(IR-A)和/或胰島素受體亞型B (IR-B)的表達的組合物和方法。本公開還涉及至少部分基於檢測和定量樣本(例如組織樣本)中胰島素受體亞型A (IR-A)和/或胰島素受體亞型B (IR-B)的表達的診斷和分類方法。基於這種分類治療受試者的方法在本文提出的公開的另外方面中。相關技術的描述胰島素受體(INSR)是能量代謝調節中牽涉的跨膜酪氨酸激酶受體。INSR包含由單個INSR基因表達的2個亞單位α和β。2種稱為IR-A和IR-B的亞型是選擇性mRNA剪接的結果。通過選擇性剪接由INSR基因轉錄的mRNA以去除IR-B的mRNA中包含的外顯子11產生IR-A(圖1A-1B)。因此，IR-A與IR-B不同，因為IR-A在INSRa亞單位的羧基末端缺乏一段胺基酸殘基。IR-A和IR-B高於99%相同(圖2)。雖然2種亞型的表達譜不同，但是亞型在細胞中共同表達。通過發育階段和組織特異性因子調節IR-A和IR-B的相對豐度。例如，IR-A主要在胎兒細胞和癌細胞中表達，而IR-B主要在分化的胰島素靶細胞中表達。IR-A對胰島素表現出高親和力，對IGF-II表現出中間親和力並且對IGF-I表現出低親和力。IGF-II以相似親和力與IGF I型受體(IGF-IR)和IR-A結合。IR-B是胰島素的高度特異性受體。目前，缺乏有效且精確的檢測方法妨礙了測定患者樣本中IR-A和IR-B水平的方法。至今，Sciacca 等(Oncogene 21(54) :8240-50 ;2002 年 11 月 28 日)描述了具體測量IR-A表達的唯一可用方法。這種方法基於PCR和凝膠分離，然後定性測量所得的帶。這種方法十分耗力且並非定量準確，這限制了這種方法用於高通量或臨床環境下。簡述需要可根據確定患者的組織是否表達藥物的分子靶來預測患者對藥物的反應的改進診斷試驗。需要一種精確檢測和/或定量IR-A和IR-B的表達的方法。能夠檢測和定量患者樣本中每種亞型表達的能力對於為患者提供個人化治療方案是有用的。這種個人化治療方案為患者提供了最大化治療益處的可能，同時將(例如)可能與替代性和低效治療方案有關的副作用最小化。
本文公開了用於檢測和/或定量生物材料樣本是否含有表達IR-A和/或IR-B (包括人IR-A和/或IR-B)的細胞的方法和用於這種方法的試劑盒。所述方法部分基於特定寡核苷酸可用於測量組織樣本中IR-A和/或IR-B的表達的發現。這些寡核苷酸可用於快速地和定量地區別樣本中IR-A和/或IR-B表達的水平以致所述方法可用於高通量和臨床環境下。這些組合物和方法可用於分類組織樣本(例如腫瘤組織樣本)的方法。這種方法的結果可用作分類腫瘤或癌症患者的因子，作為患者將如何對藥物，例如INSR、IGFlR或IGF的拮抗劑或激動劑反應的指示。這些方法和所得的分類可用於選擇候選者進行治療的方法和治療癌症患者的方法。有用的寡核苷酸可包括可用於選擇性擴增IR-A和/或IR-B的合成核酸。這種有用的寡核苷酸可包含含有10-30個連續核苷酸的合成核酸序列，其中公開了所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20個連續核苷酸(i) SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列；(ii) SEQ ID NO :4、與之 互補的序列(SEQ ID NO :21)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列或其變體；(iii) SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:5或其互補序列雜交的序列；或(iv) SEQ ID NO :6、與之互補的序列(SEQ ID NO :22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。合成核酸序列可基本上由以下任一核酸序列組成(i)SEQ ID NO :3(TGAGGATTACCTGCACAACG)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列或其變體；(ii) SEQ ID NO4(GATGTTGGGAATGTGACGGT)、與之互補的序列(SEQ ID NO 21)或在嚴格條件下能夠與SEQID NO :4或其互補序列雜交的序列；(iii) SEQ ID NO :5 (TTGAGGATTACCTGCACMCGT)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列或其變體；或(iv)SEQ ID NO :6(AAACGCAGGTCCCTTGGC)、與之互補的序列(SEQ ID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 6或其互補序列雜交的序列或其變體。有用的合成核酸序列可為SEQ ID NO :7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列或其變體，或SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列或其變體。另一有用的合成核酸序列可基本上由SEQ ID NO :7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列或其變體，或SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQID NO :8或其互補序列雜交的序列或其變體組成。包含上述任何合成核酸序列的組合物也可用。本文還公開了一種用於確定生物樣本中靶人IR-A核酸序列存在或不存在的引物組，其中所述引物組包含選自包含以下至少一個的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列的至少一個合成核酸序列(a) INSR基因外顯子10的最後50個鹼基(SEQ ID NO 1)或其互補核酸序列；和(b) INSR基因外顯子12的前60個鹼基(SEQ ID NO :2)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列。合成核酸序列可能具有選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:3或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO :4、與之互補的序列(SEQ ID NO 21)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列；和SEQ ID NO :6、與之互補的序列(SEQID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。本文還公開了一種用於確定生物樣本中靶IR-A核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本與如上述的引物組接觸；和(b)檢測和/或定量擴增的靶IR-A核酸序列。例如，生物樣本可為組織樣本(例如腫瘤樣本)或包含源自組織或細胞樣本的核酸的樣本。引物組可包括SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 3或其互補序列雜交的序列JPSEQ ID NO :4、與之互補的序列(SEQ ID NO 21)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列。在另一實例中，引物組可包括SEQ IDNO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :6、與之互補的序列(SEQ ID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。在一個實例中，基於聚合酶的擴增為定量聚合酶鏈式反應(q-PCR)。引物和探針組可包括SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQID NO :3或其互補序列雜交的序列或其變體；SEQ ID NO 4(SEQ ID NO :21)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列或其變體；和SEQ ID NO:7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列或其變體，其中所述序列還可包含可檢測標記並且可進一步包含猝滅劑。在另一實例中，引物和探針組可包括SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列或其變體；SEQ ID NO :6、與之互補的序列(SEQ ID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列或其變體；和SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列或其變體，其中所述序列還可包括可檢測標記並且可進一步包括猝滅劑。通常，擴增產物小於100個鹼基。有用的合成核酸序列可包含10-30個連續核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20個連續核苷酸SEQ ID NO: 11、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 11或其互補序列雜交的序列或其變體；或SEQ ID N0:12、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列或其變體。在一個實例中，核酸序列基本上由SEQ ID NO :11、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:11或其互補序列雜交的序列或其變體；或SEQ ID NO :12、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO : 12或其互補序列雜交的序列或其變體；SEQ ID NO :13、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 13或其互補序列雜交的序列或其變體；SEQ ID NO14、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 14或其互補序列雜交的序列或其變體或SEQ ID NO :15、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:15或其互補序列雜交的序列或其變體。包含以上任一或多個合成核酸序列的組合物也可用。用於確定生物樣本中IR-B存在或不存在的引物組可包含含有以下至少一個的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列(a) INSR基因外顯子10的最後50個鹼基(SEQ IDNO 1)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO : I或其互補序列雜交的序列，和INSR基因外顯子11的鹼基(SEQ ID NO :9)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQID NO 9或其互補序列雜交的序列或其互補序列，或橋接INSR基因的外顯子10和外顯子11的序列、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與所述序列或其互補序列雜交的序列；和(b) INSR基因外顯子12的前50個鹼基(SEQ ID NO 10)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :10或其互補序列雜交的序列或與之互補的序列。引物組可包括至少一個具有選自以下的核苷酸序列的合成核酸序列SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 11或其互補序列雜交的序列JPSEQ ID NO :12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列。用於確定生物樣本中靶IR-B核酸序列存在或不存在的方法可包括以下步驟(C)在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本與以上的引物組接觸；和(d)檢測和/或定量擴增的靶IR-B核酸序列。例如，生物樣本可為包含來自組織樣本(例如腫瘤樣本)的核酸的樣本。在另一實例中，基於聚合酶的擴增可通過定量聚合酶鏈式反應。引物和探針組可包括SEQ ID NO: 11、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:11或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO: 12、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:12或其互補序列雜交的序列；和SEQ ID NO :13、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ IDNO 13或其互補序列雜交的序列，所述序列還可能包括可檢測標記且可能進一步包括猝滅齊U。在另一實例中，引物和探針組可包括SEQ ID NO : 11、與之互補的序列、或在嚴格條件下 能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO :12、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 12或其互補序列雜交的序列JPSEQ ID N0:14、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 14或其互補序列雜交的序列。在另一實例中，引物組可包括SEQ ID NO :11、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO :12、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 12或其互補序列雜交的序列；並且進一步包含SEQ ID NO :15、與之互補的序列、或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 15或其互補序列雜交的序列，所述序列還可能包括可檢測標記且可能進一步包括猝滅劑。通常擴增產物小於100個鹼基。用於確定生物樣本中靶IR-A和IR-B核酸存在或不存在的方法可包括以下步驟在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本與上述的IR-A引物組接觸；在適於通過聚合酶反應擴增的條件下使生物樣本與上述的IR-B引物組接觸；和檢測和/或定量擴增的靶IR-A和IR-B核酸序列。所述方法可進一步包括計算IR-A和IR-B的相對表達水平。用於確定生物樣本中IR-A存在或不存在的試劑盒可包含至少一個上述的合成核酸序列和進行本文所述一種或多種方法的說明。在這種試劑盒中，所述至少一個合成核酸序列可具有選自本文公開的IR-A引物和探針或其任何組的核苷酸序列。試劑盒還可包括適合的PCR試劑；並且任選地，用於確定IR-A存在或不存在的陽性和/或陰性對照。用於確定生物樣本中IR-B存在或不存在的試劑盒可包含至少一個上述的合成核酸序列和進行本文所述一種或多種方法的說明。在這種試劑盒中的合成核酸序列可具有選自IR-B核酸的核苷酸序列。試劑盒還可包括適合的PCR試劑；並且任選地，用於確定IR-B存在或不存在的陽性和/或陰性對照。用於選擇對IGFI/II配體、INSR或IGFRl受體拮抗劑或激動劑反應的患者的方法可包括從患有或懷疑患有癌症的受試者獲得生物樣本；和檢測和/或定量樣本中IR-A的存在。IR-A的存在或不存在為關於是否應向受試者施用IGFI/II配體、INSR或IGFRl受體拮抗劑或激動劑的指標。因此，治療患者的方法可包括檢測和/或定量已從患者獲得的患者中IR-A的存在和向患者施用IGFI/II配體、INSR或IGFRl受體拮抗劑或激動劑。例如，IGFI和II配體、INSR或IGFRl受體拮抗劑可為抗體。
可根據IR-A和/或IR-B的表達或按照IR-A和IR-B的相對量為腫瘤分類。用這種方式為腫瘤分類提供了鑑定具有過表達的IR-A和/或IR-B或改變了 IR-A相對於IR-B的量或反之亦然的腫瘤的能力。為腫瘤分類的方法可包括定量腫瘤組織樣本中IR-A和/或IR-B的表達或IR-A相對於IR-B的量或反之亦然，和根據定量指定分類。治療患有腫瘤的患者的方法可包括通過定量腫瘤組織樣本中IR-A和/或IR-B的表達或IR-A相對於IR-B的量或反之亦然為腫瘤分類；根據定量IR-A和/或IR-B的表達或IR-A相對於IR-B的量或反之亦然指定分類；和根據分類向患者施用IGFI/II配體或IGFRl受體拮抗劑或激動劑。

圖1A-1B說明了 IR-A和IR-B。圖IA示出了 IR-A和IR-B的基因組結構。圖IB呈現了 INSR同型二聚體的α和β亞單位的示意圖，左側示出外顯子位置，且右側示出功能結構域。圖2 示出了人 IR-A (SEQ ID NO 16)和 IR-B (SEQ ID NO 17)的序列比對，證明除 了從IR-A去除了外顯子11夕卜，序列相同。圖3示出了 IGF-1R/IR受體的示意圖，說明了強弱配體相互作用。圖4示出了用於實例IR-A檢測的引物和探針位置的示意圖。圖5示出了用於實例IR-A檢測的引物和探針位置的示意圖。圖6示出了用於實例IR-B檢測的引物和探針位置的示意圖。圖7示出了用連續稀釋約IO7的10個拷貝的IR-A、IR-B質粒DNA或空載體對照進行的IR-A或IR-B qRT-PCR檢測的結果。Y軸代表循環閾值(Ct)而X軸代表DNA拷貝數的對數。IR-A檢測的標準稀釋曲線的斜率和相關係數(r2值)分別為-3. 259和O. 9992。IR-B檢測的標準稀釋曲線的斜率和相關係數(r2值)分別為-3. 155和O. 9989。圖8示出了與正常乳腺組織相比，原發性乳腺癌中胰島素受體及其亞型的相對mRNA表達水平。TaqMan基因表達檢測確定了正常(η = 19)和腫瘤(η = 42)乳腺組織樣本之間INSR (總)、IR-A和IR-B的相對量(RQ)差異(Iog2-基本比率)。平均正常Λ Ct值用於計算每種樣本的倍數變化差異。雙尾韋爾奇t檢驗分析(two-tailed Welch' s t_testanalysis)鑑定了對於INSR和IR-B而言正常和腫瘤樣本之間的顯著性差異(P < O. 001)，而對於IR-A而言未觀察到差異(P = O. 45)。條形代表特定基因靶和組織類型組合中的中值 Iog2 RQ0圖9示出了匹配的正常乳腺和乳腺癌樣本中IR-A表達的比例。通過2(_Λω計算確定樣本中胰島素受體亞型-A(IR-A)相對於總胰島素受體組合物(即，IR-A+IR-B)的比例。成對樣本t檢驗分析表明在匹配的正常和腫瘤樣本之間的計算IR-A比例存在顯著性差異(P < O. 001)。黑色條形代表正常(46. 60±4· 74，平均％ ±95% Cl)和腫瘤(75. 24±5· 03，平均％ ±95% Cl)組織中的中值IR-A比例)。圖10示出了原發性乳腺癌中IR-A IR-B比值增加。計算正常(η = 19)和腫瘤(η = 42)乳腺樣本中胰島素受體亞型IR-A和IR-B的ACt差異。為了歸一化，利用樣本內參考基因組(平均Ct)為所有樣本計算Λ Ct差異(IR-A Δ Ct-IR-B ACt)值。雙尾韋爾奇t檢驗分析鑑定了與觀察到的IR-A IR-B Λ Ct差異相關的正常和腫瘤樣本之間有顯著性差異(P < O. 001)。黑色條形代表特定組織類型中的IR-A IR-B ACt中值差異。
圖11示出了來自qPCR cDNA陣列的乳腺癌樣本中IR-A IR-B比值增加。計算正常(η = 15 ;來自10個獨立供體的樣本)、乳腺癌cDNA組(η = 165)和來自這些cDNA組的雌激素受體(ER)過表達> 2倍的乳腺腫瘤(η = 83)中胰島素受體亞型IR-A和IR-B (Y軸)的ACt差異。為了歸一化，利用樣本內參考基因組(平均Ct)為所有樣本計算ACt差異(IR-A Δ Ct-IR-B ACt)值。雙尾韋爾奇t檢驗分析鑑定了與觀察到的IR-A IR-BACt差異相關的正常和腫瘤樣本之間有顯著性差異(P <0.001)。條形代表特定組織類型中的IR-A IR-B ACt平均差異。圖12示出了 IR-A IR-B Λ Ct差異與增殖基因表達的相關性。計算的 IR-A IR-B Λ Ct 差異(Y 軸)和增殖標記物(AURKA、BIRC5、CCNB1、ΚΙ67 和 MYBL2)的混合組(X軸)之間相關性的線性回歸分析。通過取所有標記物的平均Λ Ct為特定樣本計算增殖組匯總值。呈現了正常和腫瘤樣本的匯總結果。線性回歸分析結果表明了兩個匯總值之間的正相關性(調節R2 = O. 595)。圖13 (Α和B)示出了 ER+乳腺癌的亞型的IR-A IR-B Δ Ct差異。通過基於縮小重心分類的方法(A)和雙樣本韋爾奇t檢驗分析(B)確定關於樣本亞型(正常、管狀A型或管狀B型)分類的IR-A IR-B ACt計算差異的散點示意圖。所有亞型成對比較顯示顯著性差異(雙樣本t檢驗，P < 0.001)。條形代表特定樣本亞型中的IR-A IR-B ACt
中值差異。發明詳述本文提及以下引物和探針序列。SEQ ID NO I (TTTAGGAAGA CGTTTGAGGA TTACCTGCAC AACGTGGTTT TCGTCCCCAG)INSR外顯子IOC端SEQ ID NO 2 (GCCATCTCGG AAACGCAGGT CCCTTGGCGA TGTTGGGAAT GTGACGGTGGCCGTGCCCAC) INSR 外顯子 12N 端SEQ ID NO :3 (TGAGGATTACCTGCACAACG) IR-A 引物SEQ ID NO 4 (GATGTTGGGA ATGTGACGGT) IR-A 引物(反向互補序列 SEQ ID NO 21)SEQ ID NO 5 (TTGAGGATTA CCTGCACAACGT) IR-A 引物SEQ ID NO 6 (AAACGCAGGTCCCTTGGC) IR-A 引物(反向互補序列 SEQ ID NO 22)SEQ ID NO 7 (TCCCCAGGCCATCT) IR-A 探針SEQ ID NO 8 (TTTTCGTCCCCAGGCCA) IR-A 探針SEQ ID NO 9 (AAAAACCTCT TCAGGCACTG GTGCCCAGGA CCCTAG) INSR 外顯子 11SEQ ID NO 10 (GCCATCTCGG AAACGCAGGT CCCTTGGCGA TGTTGGGAAT GTGACGGTGG)INSR外顯子12N端SEQ ID NO : 11 (CGTCCCCAGAAAAACCTCTTC) IR-B 引物SEQ ID NO : 12 (GGACCTGCGTTTCCGAGAT) IR-B 引物SEQ ID NO 13 (ACTGGTGCCGAGGAC) IR-B 特異性探針SEQ ID NO : 14 (CCGAGGACCCTAGGC) IR-B 特異性探針SEQ ID NO 15 (TGCCGAGGACCCTAG) IR-B 特異性探針更多引物和探針序列包括表3和4中的序列。技術人員將能夠從本文公開的引物中選擇能夠在PCR反應中擴增核酸序列(例如，與相反鏈退火併朝正確方向引發DNA合成)的引物對。技術人員將理解這種引物的互補序列可用作(例如)陰性對照。儘管IR-A和IR-B之間具有高度序列同一性，但是這些核酸序列和本文所述的相關序列可用於檢測以檢測和定量樣本中人IR-A和人IR-B的表達。因此，已經首次發現了確定樣本中IR-A和/或IR-B的表達的快速且靈敏方法。使用這些序列的所述方法在定量上精確，允許將其用於高通量和臨床環境下。可用於鑑定試樣中IR-A和/或IR-B的表達的合成核酸序列或寡核苷酸可為DNA、RNA、其嵌合混合物或衍生物或可在鹼基部分、糖部分或骨架被修飾的修飾形式，並且可包括其它附加基團、標記或猝滅劑，只要它們仍然能夠在所需反應中起作用。合成核酸序列可包含至少一個修飾的磷酸酯骨架-例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯及其formacetal或類似物。(iv) IR-A核酸序列
適合的IR-A合成核酸序列包括表3和4中出現的序列。包含在INSR基因外顯子10的最後50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO:I)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :1或其互補序列雜交的序列，和INSR基因外顯子12的前60、55、50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO 2)或在嚴格條件下能夠與SEQID NO 2或其互補序列雜交的序列中出現的IR-A核酸序列的合成核酸可用於基於聚合酶的擴增和檢測，例如定量聚合酶鏈式反應(qPCR)(也稱為實時PCR或動力學PCR)以確定樣本中IR-A的表達水平。包含IR-A 序列的合成核酸可包括 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個連續核苷酸(iv) SEQ ID NO 3 (TGAGGATTAC CTGCACAACG)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列；(ii)SEQ ID NO 4(GATGTTGGGA ATGTGACGGT)、與之互補的序列(SEQ ID NO 21)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 4或其互補序列雜交的序列；(iii) SEQ ID NO 5 (TTGAGGATTA CCTGCACAAC GT)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 5或其互補序列雜交的序列；或(iv) SEQ ID NO :6 (AAACGCAGGT CCCTTGGC)、與之互補的序列(SEQ ID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。在一個實例中，用於確定生物樣本中靶IR-A核酸序列存在或不存在的引物組可包含可能選自含以下至少一個的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列的至少一個合成核酸序列(8)1吧1 基因外顯子10的最後50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO :1)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :1或其互補序列雜交的序列；和(b)INSR基因外顯子12的前60、55、50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO :2)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :2或其互補序列雜交的序列。引物組可包括(i)SEQID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列和SEQ ID NO :4、與之互補的序列(SEQ ID NO 21)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列或(ii)SEQ ID NO :5或其互補序列和SEQ ID NO :6、與之互補的序列(SEQ ID NO 22)或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。通常引物組用於PCR中以產生約50-150bp的產物。探針可包含SEQ ID NO :7或8或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或8或其互補序列雜交的序列，並且還可能包含適當的標記和猝滅劑組合。例如，可用於定量聚合酶鏈式反應(qPCR)的引物組包括SEQ ID NO 3或與之互補的核酸序列；
SEQ ID NO :4或與之互補的核酸序列(SEQ ID NO 21);和具有也可能包括猝滅劑的可檢測標記的另外的合成核酸或探針。在一個實例中，另外的核酸為10-50個核苷酸之間的單鏈核酸序列並且設計為特異性結合SEQ ID NO :3和4的兩個PCR引物之間的IR-AcDNA的DNA序列或其互補序列。另外的核酸通常具有在5』和3』末端共價連接的螢光報告子或螢光團(例如6-羧基螢光素(FAM)或四氯螢光素(TET))和猝滅劑(例如四甲基若丹明(TAMRA))。在該實例中，僅特異性PCR產物產生螢光信號。在該實例中，另外的核酸可為10-50個鹼基並且包括SEQ ID NO :7或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列的至少5-14個鹼基。在另一實例中，引物組包含SEQ ID NO 5或與之互補的核酸序列；SEQ ID NO :6或與之互補的核酸序列(SEQ ID NO 22);和具有也可能包括猝滅劑的可檢測標記的另外的核酸。另外的核酸可為10-32個核苷酸之間的單鏈核酸序列並且設計為僅結合SEQ ID NO :5和6的兩個PCR引物之間的IR-A cDNA的DNA序列或其互補序列。在該實例中，另外的核酸可為10-32個鹼基並且包括SEQ ID NO :8或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 8或其互補序列雜交的序列的至少5-14個鹼基。B. IR-B核酸序列
適合的IR-B合成核酸序列包括表3和4中出現的序列。在(a)外顯子10的最後50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO: I)或其互補序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :1或其互補序列雜交的序列，和INSR基因外顯子IKSEQ ID NO 9)或與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :9或其互補序列雜交的序列，或橋接外顯子10和11的序列或在嚴格條件下能夠與橋接外顯子10和11的區域或其互補序列雜交的序列；和(b) INSR基因外顯子12的前50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO :2)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列中出現的IR-B核酸序列可用於本文公開的方法(特別是基於PCR的方法)以確定IR-B的表達水平。在一個實例中，包含IR-B序列的合成核酸可包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續核苷酸(ii)SEQ ID NO : 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:11或其互補序列雜交的序列；或(ii)SEQ ID NO :12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:12或其互補序列雜交的序列。在另一個實例中，用於確定生物樣本中靶IR-B核酸序列存在或不存在的引物組可包含可能選自含以下至少一個的10-27個連續核苷酸的合成核酸序列的至少一個合成核酸序列(a) INSR基因外顯子10的最後50個鹼基(SEQ ID NO 1)和外顯子11的最後50個鹼基(SEQ ID NO 9)中50、45、40、35、30、25或20個鹼基或與之互補的序列;和(b) INSR基因外顯子12的前50、45、40、35、30、25或20個鹼基(SEQ ID NO 10)或與之互補的序列。引物組可包括選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO 11或與之互補的合成核酸序列；和SEQID NO 12或與之互補的合成核酸序列。
當引物組用於PCR(例如qPCR)時，引物組可包括SEQ ID NO :11或與之互補的合成核酸序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 11或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO12或與之互補的合成核酸序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 12或其互補序列雜交的序列；和包含也可能包括猝滅劑的可檢測標記的另外的核酸。另外的核酸可為10-27個核苷酸之間的單鏈核酸序列並且設計為特異性結合SEQ ID NO 11和12的兩個PCR引物之間的IR-B cDNA的DNA序列或其互補序列，或在嚴格條件下能夠與該區域或其互補序列雜交的序列。例如，另外的核酸可為10-27個鹼基並且包括SEQ ID NO : 13的或其互補序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :13或其互補序列雜交的序列的至少5-14個鹼基。另外的核酸可為10-30個鹼基並且包括SEQ ID NO 14的或其互補序列或在嚴格條件下能夠與SEQID NO :14或其互補序列雜交的序列的至少5-14個鹼基。在又一實例中，另外的核酸可為10-30個鹼基並且包括SEQ ID NO : 15的或其互補序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:15或其互補序列雜交的序列的至少5-14個鹼基。另外的核酸通常具有在5』和3』末端共價連接的螢光報告子或螢光團(例如6-羧基螢光素(FAM)或四氯螢光素(TET))和猝滅劑(例如四甲基若丹明(TAMRA))。有用的合成核酸序列還包括上述公開序列的變體或與本文公開的核酸大體上相似的序列。變體包括由一個或多個鹼基，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個鹼基改變，但是仍然可與目標IR-A靶序列上的特異性位置退火的序列。當涉及退火或雜交使用時，術語「大體上相似」指合成核酸序列(例如引物)應充分互補以在嚴格條件下與各自的核酸雜交或退火。合成核酸序列不必反映其各自核酸的準確序列，並且事實上可為「簡併序列」。非互補鹼基或其它序列可散布於合成核酸序列中，條件是合成核酸序列與所述序列有充分互補性以允許雜交。因此，舉例而言，可選擇用於PCR擴增的引物與待擴增的特異性序列「大體上」互補。如本文所使用的術語「雜交」指核酸鏈與互補鏈通過鹼基配對連接的過程以及例如在PCR技術中進行的擴增過程。能夠與指定核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列通常在功能上相當並且為了本文所述方法的目的可取代為該核苷酸序列。因此，雖然本公開鑑定了已經發現特別靈敏且具特異性的特異性引物和探針，但是本領域的技術人員應了解有用的引物包括在與本文公開的示例性引物大約相同位置上可引發聚合酶反應的任何引物。即，引發INSR基因外顯子10和外顯子12的聚合反應的引物可用於擴增診斷序列。跨越IR-B序列中外顯子10-外顯子11的引物可用於特異性擴增IR-B序列。類似地，可合成區別IR-A和IR-B的另外的探針以特異性結合擴增的IR-A或IR-B靶序列。通常，包含更多互補殘基的較長序列可含有更大變異。「嚴格雜交條件」可為任何低嚴格性條件、中等嚴格條件和高度嚴格條件。通常，「低嚴格性條件」為(例如):在321下在包含5「5(、5奶的1^代溶液、0.5% (w/v) SDS和50% (w/v)甲醯胺的溶液中雜交。「中等嚴格條件」為(例如)在42°C下在包含5xSSC、5xDenhart溶液、O. 5% (w/v) SDS和50% (w/v)甲醯胺的溶液中雜交。「高度嚴格條件」為(例如):在 50°C下在包含 5xSSC、5xDenhart 溶液、O. 5% (w/v)SDS 和 50% (w/v)甲醯胺的溶液中雜交。雜交嚴格性受若干因素影響，例如溫度、核酸濃度、核酸長度、離子強度、時間和鹽濃度。這些只是將產生不同嚴格性水平的示例性條件。本領域的技術人員將能夠通過適當調節雜交條件，包括在PCR反應中將這種條件調節為所需嚴格性而實現相似嚴格性。可通過使用非特異性核酸裂解化學製品或酶或位點特異性限制性內切酶裂解較大核酸片段；或通過本領域中已知的標準方法，例如通過使用市售的自動化DNA合成器和 標準的亞磷醯胺化學法合成來得到合成核酸序列。US 4，458，066中描述了一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法。一旦合成了所需的合成核酸，就可通過本領域中已知的方法從合成和處理核酸的固體支持物上裂解合成核酸，以去除存在的任何保護基。然後可通過本領域中已知的任何方法純化合成核酸，包括提取和凝膠純化。可通過(例如)用HPLC檢查丙烯醯胺凝膠上的寡核苷酸，或通過在260nm下用分光光度計測量光密度確定寡核苷酸的濃度和純度。本發明的合成核酸序列可用於用以確定IR-A和IR-B的表達的存在的任何檢測中。在一個實例中，例如本文公開的分離核酸可用於擴增過程。擴增指增加體內核酸鏈的過程。示例性技術為以指數方式擴增核酸分子的PCR。US 4，683，195和US 4，683，202中描述了 PCR。PCR廣泛用於特異性檢測和定量靶核酸序列多核苷酸並且是一種分子生物學的標準方法。PCR可用於確定試樣中IR-A和/或IR-B的表達。所述方法使用與IR-A或IR-B分子上的特定位置特異性退火的一對分離核酸序列「引物」。使IR-A或IR-B DNA熱變性並且使位於待擴增DNA相反鏈上的靶序列兩側的兩個寡核苷酸雜交。這些寡核苷酸成為與DNA聚合酶一起使用的引物。通過引物延伸複製DNA以產生兩條鏈的第二個拷貝。通過重複熱變性、引物雜交和延伸的循環，在約2至4h內可擴增靶IR-A或IR-B DNA百萬倍或更多。PCR是必須連同檢測技術一起使用以確定擴增結果的分子生物學工具。PCR的優點在於通過在約4h內擴增靶DNA的量一百萬倍至十億倍而提高了靈敏性。如以下討論和實例中說明，使用IR-A引物和探針的有用方法為定量PCR。定量PCR指PCR反應與螢光化學法組合以使得能夠使用螢光信號的檢測實時監控擴增反應的方法。在一個實例中，所述方法使用序列非特異性螢光報告子染料，例如SYBR綠(Wittwer CT等，Biotechniques. 1997年I月；22(1) : 176-81)。在另一實例中，所述方法使用序列特異性螢光報告子,例如 TAQMAN探針(Heid C A等，Genome Res. 1996 年 10 月；6(10) :986-94)。PCR循環程序執行期間，使用光源激發樣本。在每個反應孔中使用光電探測器或CCD/CM0S相機監控指示生成的PCR擴增產物的量的螢光信號。通過在反應期間監控樣本中的螢光，可進行精確的定量測量。基於探針的PCR方法被認為比SYBR綠方法更精確。通常在塑料96或384孔微量滴定板中進行PCR或qPCR，每次反應的體積依次為5_50μ I。然而，可在非常小(nl)的體積下進行PCR。如本文所使用的術語「引物」或「引物對」指用在PCR中以引發聚合反應的短的寡核苷酸(通常為10-30bp)。特異性引物可用於通過引發靶序列中特定位置處的聚合選擇待擴增的IR-A或IR-B DNA序列。本文所述方法提供了一種可重現且強效擴增少量含有IR-A和/或IR-B的DNA的方法。使用本文所述的核酸引物進行qPCR可特異性檢測來自O. Ipg DNA(1000個拷貝)或35個DNA拷貝的IR-A或IR-B。生物樣本可包含在所述方法的一些實施中首先轉錄為cDNA的RNA。可使用總細胞RNA、細胞質RNA或聚(A)+RNA。製備總RNA和聚(A)+RNA的方法眾所周知並且通常在Sambrook 等(1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第 2 版)，第 1-3 卷，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)和 Ausubel 等編(1994, CurrentProtocols in Molecular Biology,第 2 卷，Current Protocols Publishing, New York)中有描述。優選地，通過 Chirgwin 等(1987)、Chomczynski & Sacchi (1987)、Sambrook 等(1989)或Farrell Jr. (1993)所述的技術製備總RNA,並且許多優質商業試劑盒也可用。更優選地，使用Chirgwin等(1987)的硫氰酸胍法製備總RNA。可使用本領域中已知的各種方法檢查總RNA的完整性。舉例而言，可使用RNA凝膠電泳(例如甲醛/瓊脂糖凝膠)或Agilent LabChip分析RNA。對於哺乳動物總RNA而言，兩條約4. 5和I. 9kb的條帶應可見；這些條帶分別代表28S和18S核糖體RNA，並且這些條帶強度的比值通常應為I. 5-2. 5 I。可從許多商業供應商(例如Absolutely RNA Nanoprep, Stratagene ；PicoPureTM, Arcturus ;Rneasy , Qiagen ；RNAqueousTM Microkit, Ambion)購買用於微量RNA製備的RNA純化試劑盒。在溫度為約60°C和90°C之間，優選約70°C溫度下於適合緩衝液中使用於第一條cDNA鏈合成的cDNA合成寡核苷酸與RNA雜交約5min，然後在加入逆轉錄酶之前冷卻至約40C。cDNA合成寡核苷酸與RNA雜交後，合成第一條cDNA鏈。優選通過逆轉錄的過程生成cDNA的第一條鏈，其中按照本領域的技術人員熟知的方法利用逆轉錄酶由RNA產生DNA。任何逆轉錄酶均可用於將RNA轉錄為DNA，只要酶將脫氧核糖核苷酸加至延伸後的3』端(Varmus, Science 240:1427-1435(1988))並且酶缺乏核糖核酸酶H活性。優選地，逆轉錄酶缺乏核糖核酸酶H活性但是保持了野生型聚合酶活性，以致可合成較長cDNA。逆轉錄酶可為莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶或其突變體。逆轉錄酶可為PowerScript 逆轉錄酶(BD Biosciences Clontech)。逆轉錄酶可為 SuperScript III 。正如本領域的技術人員所了解，採用的逆轉錄酶的量可變化。通過在適當溫度下用逆轉錄酶孵育(例如)約Ih進行逆轉錄，所述適當溫度必須在逆轉錄酶保持酶活性的溫度範圍內。可在37°C和55°C之間，優選在37°C和42°C之間進行反應。最優選地，在最佳酶活性，例如約42°C下進行反應。可通過將反應混合物加熱至95°C保持約5min以使酶失活，任選地然後於冰上冷卻來終止逆轉錄反應。[C. IGF拮抗劑/激動劑本文所使用的IGF試劑指影響IGF-1R/IR信號轉導途徑的任何成員的表達或活性的試劑並且包括IGF-1R、IR、INSR或IGFI/II拮抗劑或激動劑。IGF-1R、IR、INSR 或IGFI/II拮抗劑或激動劑可為擬肽類、蛋白質、肽、核酸、小分子、抗體或其它候選藥物。IGF-Rl拮抗劑的實例在本領域中眾所周知並且包括拮抗IGF-IR的反義和核酸，例如在 Wraight 等，Nat. Biotech.，18 :521-526 (2000);美國專利 No. 5，643，788 ;美國專利 No. 6，340，674 ；US 2003/0031658 ;美國專利 No. 6，340，674 ;美國專利 No. 5，456，612 ；美國專利 No. 5，643，788 ;美國專利 No. 6，071，891 ；W0 2002/101002 ；W0 1999/23259 ；WO 2003/100059 ；US 2004/127446；US 2004/142895 ；US 2004/110296 ；US 2004/006035 ；US 2003/206887 ；US 2003/190635 ；US 2003/170891 ；US 2003/096769 ;美國專利No. 5，929，040 ;美國專利 No. 6，284，741 ；US 2006/0234239 和美國專利 No. 5，872，241 中已描述。進一步地，US 2005/0255493公開了通過使用短的雙鏈RNA進行RNA幹擾來減少IGF-IR表達。另外，已產生靶向IGF-IR在體外和體內具有抗增殖活性的抑制肽(Pietrzkowsk 等，Cancer Res. ,52 :6447-6451 (1992) ； Hay I or 等，J. Am. Soc. Nephrol.，11 :2027-2035(2000))。已證實IGF-IR的C端肽誘導細胞凋亡並且顯著地抑制腫瘤生長(Reiss 等，J. Cell. Phys.，181 :124-135 (1999))。同樣，IGF-IR 的可溶性形式抑制體內腫瘤生長(D' Ambrosio 等，Cancer Res. ,56 :4013-4020 (1996))。例如，在 Garcia-Echeverria等，Cancer Cell, 5 :231-239 (2004) ；Mitsiades 等，Cancer Cell, 5 :221-230 (2004) ；和Carboni 等，Cancer Res，65 :3781-3787 (2005)中描述了 IGF-1R 的小分子抑制劑。關於小分子抑制劑的公開的更多實例包括WO 2002/102804 ;W0 2002/102805 ;W02004/55022 ;美國專利 No. 6，037，332 ；W0 2003/48133 ；US 2004/053931 ；US 2003/125370 ；美國專利 No. 6，599，902 ;美國專利 No. 6，117，880 ；W0 2003/35619 ；W0 2003/35614 ；W02003/35616 ；W0 2003/35615 ；W0 1998/48831 ;美國專利 No. 6，337，338 ；US 2003/0064482 ；美國專利 No. 6，475，486 ;美國專利 No. 6，610，299 ;美國專利 No. 5，561，119 ；W02006/080450 ；W0 2006/094600 和 WO 2004/093781。同樣參見 WO 2007/099171 (雙環吡唑抑制劑)和WO 2007/099166(吡唑並吡啶衍生物抑制劑)。同樣參見關於Abbott Corporation的分子 A-928605 (Hubbard 等，AACR-NCI-E0RTC Int Conf Mol Targets Cancer Ther (10 月22-26 日，San Francisco) 2007, Abst A227)。IGF試劑的實例包括IGF-I/II激動劑或拮抗劑。特異性IGF-II拮抗劑也在本領域中已知並且包括結合IGF-I和/或IGF-II的抗體。WO 2007022172和EP 492552中公開了這種拮抗劑。結合IGF-I和IGF-II的抗體的實例包括W02007070432、W005/18671、W003/093317, WO 05/027970 和 WO 05/028515 中公開的抗體。用作IGF拮抗劑的抗體的特定實例包括表I和2中列出的那些重鏈和輕鏈組分。通過引用整體併入本文的W02007070432中公開了這些抗體。特定抗體包括稱為7. 159. I、7. 158. I和7. 34. I的抗體。以上公開的試劑和抗體整體併入本申請。表I :抗IGF Ι/II抗體重鏈分析
權利要求
1.一種包含10-30個連續核苷酸的合成核酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20個連續核苷酸 (i)SEQID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列； (ii)SEQID NO :4、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列； (iii)SEQID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列；或 (iv)SEQID NO :6、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。
2.一種合成核酸序列,所述合成核酸序列基本上由以下任一核酸序列組成 (i)SEQID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列； (ii)SEQID NO :4、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :4或其互補序列雜交的序列； (iii)SEQID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列；或 (iv)SEQ ID NO :6、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :6或其互補序列雜交的序列。
3.一種合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO :7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列組成。
4.一種合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列組成。
5.—種組合物,所述組合物包含根據權利要求1-4中任一項所述的合成核酸序列。
6.一種用於檢測和/或定量生物樣本中IR-A核酸序列的引物組，其中所述引物組包含 (a)包含INSR基因外顯子10的最後50個鹼基(SEQID NO 1)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: I或其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列；和 (b)包含INSR基因外顯子12的前60個鹼基(SEQID NO 2)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :2或其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列。
7.根據權利要求6所述的引物組，其中至少一個合成核酸序列具有選自以下的核苷酸序列 SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :21、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :21或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列；和SEQ ID NO :22、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :22或其互補序列雜交的序列。
8.一種用於檢測和/或定量生物樣本中IR-A核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟 (a)在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸與根據權利要求6所述的引物組接觸；和 (b)檢測和/或定量擴增的靶IR-A核酸序列。
9.根據權利要求8所述的方法，其中由腫瘤樣本製備所述生物樣本。
10.根據權利要求8-9中任一項所述的方法，其中所述引物組包含SEQID NO:3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列，和SEQ ID NO21、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :21或其互補序列雜交的序列。
11.根據權利要求8所述的方法，其中所述引物組包含SEQID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列，和SEQ ID NO :22、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :22或其互補序列雜交的序列。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述基於聚合酶的擴增為定量聚合酶鏈式反應。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :21、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :21或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :22、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :22或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
15.根據權利要求8所述的方法，其中所述擴增產物小於100個鹼基。
16.一種包含10-30個連續核苷酸的合成核酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20個連續核苷酸 (i)SEQID NO: 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列；或 (ii)SEQID NO :12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:12或其互補序列雜交的序列。
17.一種合成核酸序列,所述合成核酸序列基本上由以下任一核酸序列組成 (i)SEQ ID NO: 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:ll或其互補序列雜交的序列；或(ii)SEQ ID NO :12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:12或其互補序列雜交的序列。
18.一種合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO :13、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 13或其互補序列雜交的序列組成。
19.一種合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO :14、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 14或其互補序列雜交的序列組成。
20.一種合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO :15、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: 15或其互補序列雜交的序列組成。
21.一種組合物，所述組合物包含根據權利要求16-20中任一項所述的合成核酸序列。
22.一種用於檢測和/或定量生物樣本中IR-B核酸序列的引物組，其中所述引物組包含 (a)⑴包含INSR基因外顯子10的最後50個鹼基(SEQ ID NO 1)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO: I或其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列； (a) (ii)包含INSR基因外顯子11 (SEQ ID NO :9)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 9或其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列； (a)(iii)包含鹼基橋接外顯子10和11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與之雜交或與其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列；和 (b)包含INSR基因外顯子12的前50個鹼基(SEQID NO : 10)、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO 10或其互補序列雜交的序列的10-30個連續核苷酸的合成核酸序列或與之互補的序列。
23.根據權利要求22所述的引物組，其中至少一個合成核酸序列具有選自以下的核苷酸序列 SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列。
24.一種用於檢測和/或定量生物樣本中IR-B核酸的方法，所述方法包括以下步驟 (a)在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸與根據權利要求22所述的引物組接觸；和 (b)檢測和/或定量擴增的靶IR-B核酸序列。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述生物樣本是腫瘤樣本。. 24.根據權利要求24所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列。.25.根據權利要求24所述的方法，其中所述基於聚合酶的擴增為定量聚合酶鏈式反應(q-PCR)。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO: 13、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :13或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
27.根據權利要求24所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO: 14、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO : 14或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
28.根據權利要求24所述的方法，其中所述引物組包含 SEQ ID NO :11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；並且進一步包含 SEQ ID NO: 15、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :15或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
29.根據權利要求24所述的方法，其中所述擴增產物小於100個鹼基。
30.一種用於確定生物樣本中靶IR-A核酸序列和/或靶IR-B核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括 在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸樣本與用於檢測/或定量生物樣本中的IR-A核酸序列的引物組接觸，其中所述引物組包括根據權利要求6所述的引物組，和/或在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸樣本與用於檢測/或定量生物樣本中的IR-B核酸序列的引物組接觸，其中所述引物組包括根據權利要求22所述的引物組。
和 檢測和/或定量擴增的靶IR-A或IR-B核酸序列。
31.一種用於確定生物樣本中IR-A存在或不存在的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個根據權利要求I所述的合成核酸序列和使用說明。
32.根據權利要求31所述的試劑盒，其中所述至少一個合成核酸序列具有選自SEQIDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6的核苷酸序列、與所述序列之一互補的序列或在嚴格條件下能夠與所述序列之一或其互補序列雜交的序列。
33.根據權利要求31所述的試劑盒，其中所述合成核酸序列選自以下引物組 (I)SEQ ID NO :3、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :3或其互補序列雜交的序列；SEQ ID NO :21、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :21或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :7、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :7或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記；或 (2)SEQ ID NO :5、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :5或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :22、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :22或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :8、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :8或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
34.根據權利要求31所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包含適合的PCR試劑；並且任選地，用於確定IR-A存在或不存在的陽性和/或陰性對照。
35.一種用於確定生物樣本中IR-B存在或不存在的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個根據權利要求16所述的合成核酸序列和使用說明。
36.根據權利要求35所述的試劑盒，其中所述合成核酸序列具有選自SEQID NO :11、SEQ ID NO :12的核苷酸序列、與任何所述序列互補的序列或在嚴格條件下能夠與任何所述序列或其互補序列雜交的序列。
37.根據權利要求35所述的試劑盒，其中所述合成核酸序列選自以下引物組 (1)SEQID NO: 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO :12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO :13、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :13或其互補序列雜交的序列，所述序列具有可檢測標記；或 (2)SEQ ID NO: 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；和 具有可檢測標記的SEQ ID NO 14 ;或 (3)SEQ ID NO: 11、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID N0:11或其互補序列雜交的序列； SEQ ID NO: 12、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :12或其互補序列雜交的序列；和 SEQ ID NO: 15、與之互補的序列或在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO :15或其互補序列雜交的序列，所述序列還具有可檢測標記。
38.根據權利要求35所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包含適合的PCR試劑；並且任選地，用於確定IR-B存在或不存在的陽性和/或陰性對照。
39.一種用於選擇對IGFI/II配體或IGFRl受體拮抗劑反應的患者的方法，所述方法包括根據權利要求8檢測和/或定量樣本中的IR-A表達 根據權利要求24檢測和/或定量樣本中的IR-B表達；和 其中所述IR-A和IR-B的表達表明了是否應向受試者施用IGFI/II配體或IGFlR受體拮抗劑。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述IGFI/II配體或IGFRl受體拮抗劑為抗體。
41.根據權利要求40所述的方法，其中所述抗體包含表I和表2中所列的序列組分。
42.一種用於確定生物樣本中靶IR-A核酸序列和靶IR-B核酸序列的相對存在或不存在的方法，所述方法包括 在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸與根據權利要求6所述的引物組接觸， 在適於基於聚合酶擴增的條件下使生物樣本或由生物樣本製備的核酸與根據權利要求22所述的引物組接觸； 定量擴增的IR-A和IR-B核酸序列；並且 從而確定生物樣本中IR-A與IR-B的相對表達。
43.一種為腫瘤分類的方法，所述方法包括 通過權利要求42所述的方法確定腫瘤樣本中IR-A與IR-B的相對表達， 按照包括IR-A和IR-B的相對表達的標準為腫瘤分類。
44.一種選擇患者用IGF拮抗劑進行治療的方法，所述方法包括 通過權利要求42所述的方法確定患者組織中IR-A與IR-B的相對表達， 按照包括IR-A和IR-B的相對表達的標準為患者分類，從而預測患者對IGF拮抗劑的相對反應性。
45.根據權利要求44所述的方法，其中IR-A相對於IR-B表達增加。
46.一種使用IGF拮抗劑治療患者的方法，所述方法包括 通過權利要求42所述的方法確定組織樣本中IR-A與IR-B的相對表達， 按照包括IR-A和IR-B的相對表達的標準為患者分類；和 根據分類施用IGF拮抗劑。
47.根據權利要求46所述的方法，其中IR-A相對於IR-B表達增加。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述IGF拮抗劑為抗體。
49.根據權利要求48所述的方法，其中所述抗體包含含有SEQID NO 45和53的胺基酸序列的胺基酸序列。
50.根據權利要求48所述的方法，其中所述抗體包含如表I和2所示的SEQID NO 45和53的⑶R序列。
51.根據權利要求48所述的方法，其中所述抗體包含3個來自SEQID NO:45的⑶R和輕鏈。
52.根據權利要求48所述的方法，其中所述抗體包含3個來自SEQID NO:53的⑶R和重鏈。
53.根據權利要求45和47中任一項所述的方法，其中IR-A相對總胰島素受體的百分比聞於46. 6% o
54.根據權利要求45和47中任一項所述的方法，其中IRA IR-B A A Ct低於約0. 2。
55.根據權利要求45和47中任一項所述的方法，其中對於IR-A的log2_基本比率的平均相對量差異為約_ 07±0. 29，對於IR-B為約-2. 08±0. 25。
56.一種分類乳腺癌腫瘤亞型的方法，所述方法包括通過權利要求42所述的方法確定乳腺癌腫瘤樣本中IR-A與IR-B的相對表達；並且，如果IR-A IR-B比例低於閾值將乳腺癌亞型分類為管狀B型。
57.根據權利要求56所述的方法，所述方法進一步包括計算IR-A IR-B AACt，其中閾值為設定在約-I. I至約-2. 4之間的範圍內的IR-A IR-B A ACt值。
58.根據權利要求54所述的方法，其中閾值在約-I.4至-2. I之間的範圍內。
59.根據權利要求57所述的方法，其中確定IR-A IR-B A A Ct可與確定亞型分類中的其它表達譜組合。
60.一種確定腫瘤的增殖評分的方法，所述方法包括通過權利要求42所述的方法確定腫瘤樣本中IR-A與IR-B的相對表達，和將較高的IR-A IR-B比例視為指示較高增殖評分的因子。
61.根據權利要求60所述的方法，所述方法進一步包括計算IR-A IR-B A A Ct和將較低的IR-A IR-B A A Ct值視為指示較高增殖評分的因子。
全文摘要
不受限制地，本公開涉及用於檢測和定量組織樣本中胰島素受體亞型A(IR-A)和/或胰島素受體亞型B(IR-B)的表達的組合物和方法。本公開還涉及至少部分基於檢測和定量組織樣本中胰島素受體亞型A(IR-A)和/或胰島素受體亞型B(IR-B)的表達的診斷和分類方法。基於這種分類治療受試者的方法在本文提出的公開的另外方面中。
文檔編號C12Q1/68GK102639711SQ201080045893
公開日2012年8月15日 申請日期2010年10月11日 優先權日2009年10月12日
發明者B·W·西格斯, C·莫爾豪斯, K·斯特雷徹, T·拉瓦爾, 姚意弘, 黃家琪 申請人:醫學免疫有限責任公司