抗addl單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-09-23 02:47:20 2

專利名稱：：抗addl單克隆抗體及其應用的製作方法抗ADDL單克隆抗體及其應用介紹本申請是2005年10月21日提交的PCT申請No.PCT/US2005/0038125的部分延續。
背景技術：
：阿茨海默氏病是一種進行性和退化性的痴呆(Terry,等(1991)Ann.Neurol.30:572-580;Coyle(1987)《神經科學全編》(EncyclopediaofNeuroscience)，Adelman主編，Birkhauser,Boston-Basel-Stuttgart,pp29-31)。在其早期階段，阿茨海默氏病主要表現為形成新記憶的深度不能(Selkoe(2002)Science298:789-791)，據報導這是由於來自澱粉樣肽(5(A(3)的神經毒素。A(3是兩親性的肽，其豐度通過與阿茨海默氏病有關的突變和風險因子而增加。從形成的纖絲構成了澱粉樣斑塊的核心，這是阿茨海默氏病腦的標誌。體外產生的類似的纖絲對於培養的腦神經元是致命的。這些發現表明記憶的喪失是由纖維狀A(3引起的神經元死亡的後果。儘管對於纖維狀A卩和記憶喪失的有力實驗支持，但在痴呆和澱粉樣斑塊負荷之間存在的關聯性差(Katzman(1988)A皿.Neurol.23:138-144)。此外，發展出年齡依賴性澱粉樣斑塊、以及最重要的是年齡依賴性記憶機能障礙的轉基因hAPP小鼠(Dodart,等(2002)Nat.Neurosci.5:452-457;Kotilinek，等(2002)丄Neurosci.22:6331-6335)，顯示出在接種抗Ap單克隆抗體後24小時內，記憶喪失可以被逆轉，而斑塊的水平不變。這種發現與記憶喪失取決於澱粉樣纖絲引起的神經元死亡的機制不相符合。此外，已經提出了A卩自身組裝形成的祌經活性分子。這些分子包括可溶性A(3寡聚體，也被稱為A(3衍生的可擴散配體或ADDL。寡聚體是亞穩定的，在低濃度AP1-42下形成(Lambert,等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6448-6453)。A(3寡聚體快速抑制長期增強(LTP)，這是記憶和突觸可塑性的經典實驗範例。這樣，記憶喪失源自神經元死亡之前的突觸故障，而突觸故障由A(3寡聚體引起，而不是纖絲(Hardy&Selkoe(2002)Science297:353-356)。在腦組織中已經發現了可溶性寡聚體，它在阿茨海默氏病中(Kayed,等(2003)Science300:486-489;Gong，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:10417-10422)禾口hAPP轉基因小鼠阿茨海默氏病模型中(Kotilinek,等(2002)J.Neurosci.22:6331-6335;Chang，等(2003)J.Mol.Neurosci.20:305-313)升高得驚人。已經建議了多種阿茨海默氏病治療選擇。疫苗臨床試驗已經揭示，對疫苗具有強烈免疫反應的人表現出了認知益處(Hock，等(2003)Neuron38:547-554);但是CNS炎症的頻發導致了部分試驗的早期終止(Birmingham&Frantz(2002)Nat.Med.8:199-200)。作為疫苗的一種替代方法，已經建議了針對ADDL而不結合單體或纖絲的治療性抗體(Klein(2002)Neurochem.Int.41:345-352)。ADDL具有高度抗原性，在大約50ng/mL的濃度下在兔中產生寡聚體選擇性的多克隆抗體(Lambert,等(2001)J.Neurochem.79:595-605)。從轉基因小鼠模型獲得的結果也表明抗體可以成功地逆轉記憶衰退(Dodart,等(2002)Nat.Neurosci.5:452隱457;美國專利申請序號No.11/194,989)。因此，在本
技術領域：
內存在著對用於預防和治療阿茨海默氏病的ADDL選擇性治療抗體的需求。本發明滿足了這種需求。發明簡述本發明是一種分離的抗體或其片段，能夠差異性識別一種或多種A(3衍生的可擴散配體的多維構象。具體來說，本發明的抗體具有的互補決定區(CDR)為Arg-Xaa廣Leu-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5國Xaa6-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQIDNO:9)，其中Xaa!是Gin或Ala，Xaa2是Ser或Gly，Xaa3是Pro、Ala、Lys、Arg或Thr，Xaa4是Lys或Arg，Xaa5是Gly、Ser或Lys，Xaae是Val、Thr，lie或Arg。在具體實施方案中，本發明的抗體與可藥用的載體相混合。在其它實施方案中，本發明的抗體在試劑盒中。在另外的實施方案中，包含了具有SEQIDNO:108和SEQIDNO:112中所顯示的重鏈和輕鏈可變區序列的抗體。也提供了具有SEQIDNO:138和SEQIDNO:140中所顯示的重鏈和輕鏈序列的抗體。還提供了利用與一種或多種A(3衍生的可擴散配體的多維構象結合的抗體或抗體片段，防止A卩衍生的可擴散配體與神經元結合以及抑制A卩衍生的可擴散配體的組裝的方法。本發明還包括了使用本發明的抗體，預防性或治療性治療與A(3衍生的可擴散配體有關的疾病的方法。施用本發明的抗體可以阻止A卩衍生的可擴散配體與神經元的結合，從而防止或治療與A(3衍生的可擴散配體有關的疾病。本發明也是鑑別阻止A(5衍生的可擴散配體與神經元結合的治療劑的方法。本發明的該方法包括在存在藥劑的情況下，將神經元與Ap衍生的可擴散的配體相接觸，以及在存在藥劑的情況下，使用本發明的抗體確定A卩衍生的可擴散配體與神經元的結合。本發明還包括了在樣品中檢測AP衍生的可擴散配體的方法以及與A(J衍生的可擴散配體有關的疾病的診斷方法。這樣的方法包括將樣品與本發明的抗體相接觸，以便可以檢測A卩衍生的可擴散配體，並可以診斷與A(3衍生的可擴散配體有關的疾病。附圖簡述圖1顯示了鼠抗ADDL抗體20C2的重鏈(圖IA)和輕鏈(圖IB)可變區的核酸序列。小寫字母表示抗體的前導序列，大寫字母表示抗體可變區序列。為編碼互補決定區(CDR)的核苷酸有下劃線。圖2顯示了鼠抗體20C2以及人源化抗體Hu20C2(CDR嫁接)和Hu20C2A3(嵌飾，veneered)的重鏈(圖2A)和輕鏈(圖2B)可變區胺基酸序列的比較。序列被顯示為20C2小鼠序列、最同源的人類基因組序列和人源化序列之間的比較。鼠20C2和人源化Hu20C2A3之間在框架區中的序列差異為粗體。人源化Hu20C2A3和鼠20C2之間在下劃線的CDR區中的序列差別顯示為粗體，並用*表示。CDR有下劃線。圖3顯示了人源化抗ADDL抗體Hu20C2(CDR嫁接)的重鏈(圖3A禾B3B)和輕鏈(圖3C)可變區(分別為HCVR和LCVR)的核酸序列。產生了兩個Hu20C2重鏈的人源化版本(HCVRA和HCVRB)，它們在24位上有一個胺基酸的差別。在Hu20C2HCVRA中使用了人類的胺基酸，而在Hu20C2HCVRB中使用了小鼠的胺基酸。可變區序列被克隆到完整重鏈和輕鏈抗體表達載體中。圖4顯示了在Fab噬菌體展示載體pFab4中標註的Hu20C2人源化抗體的胺基酸序列和核苷酸序列。如圖所示，在Fab噬菌體展示載體pFab4中，Hu20C2人源化抗體的重鏈A版本(圖4A)、重鏈B版本(圖4B)和輕鏈(圖4C)的胺基酸序列位於斜體和下劃線的區域中。pFab4載體中與Hu20C2的輕鏈融合的重鏈A版本的核苷酸序列顯示在圖4D-4E中，其中編碼Hu20C2抗體序列的序列顯示為小寫字母。圖5描繪了在分別用於產生親和性成熟的Hu20C2輕鏈和重鏈CDR3的兩個輕鏈CDR3文庫，艮卩LC3-1和LC3-2(圖5A)，以及3個重鏈CDR3文庫，S卩20C2B-39HCrl、20C2B-39HC3-2以及20C2B-39HC3-3(圖5B)的製備中使用的設計和引物。用於克隆的限制性內切酶識別位點用斜體表示。大寫字母表示編碼抗體可變區序列的核酸。編碼CDR的核酸被下劃線。指出了生物素標記的引物。圖6顯示了人類抗體恆定區的胺基酸序列與IgG2m4的序列的比較。星號表示Asn297位的糖基化位點。FcRn結合的區域被指出。IgG2m4與IgG2不同的序列被下劃線。圖7顯示了抗ADDL抗體Hu20C2A3的全長IgG2m4人源化重鏈(圖7A和7B)和人源化k輕鏈(圖7C和7D)的胺基酸(圖7A和7C)和核苷酸(圖7B和7D)序列。下劃線表示的是可變區序列。剩餘的序列是恆定區序列。圖8顯示了用ELISA測定的AP40單體或ADDL與兩種不同系統CHO(圖8A)或畢赤氏酵母(Pichia)(圖8B)產生的Hu20C2A3的相互作用。圖9顯示了Hu20C2A3對bADDL與初級海馬神經元結合的抑制。圖10顯示了Hu20C2A3的螢光熱熔分析。圖11顯示了APP-YAC小鼠在靜脈注射Hu20C2A3、無關的對照或介質之後，血漿的Apx-40水平(pM)。Hu20C2A3通過CHO細胞或畢赤氏酵母(Pichia)的穩定轉染製備。Apx-40使用4G8/G2-10ELISA測定。***，通過Tukey-KramerHSDpost-hoc檢驗，p<0.001。誤差棒=SEM;N-6/組。發明詳述差異性識別A(3衍生的可擴散配體(即ADDL)的多維構象的單克隆抗體現在已經產生。本發明的抗體衍生自鼠單克隆抗體20C2。本領域中已知鼠20C2表現出以下特徵。鼠20C2是一種IgGl抗體，能夠與結合在培養的海馬細胞上的合成的和內源的ADDL結合。此外，該抗體可以阻斷內源的和合成的ADDL與培養細胞的結合、降低生物素化的ADDL(bADDL)與神經元的結合、以及阻止t憐酸化。20C2的核心線性表位是Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser(SEQIDN0:1)，對應於A(51-42的3-8位胺基酸殘基，具有依賴於Ap的17-42位殘基中的元件的構象表位，但是只有在組裝時才具有。本抗體被人源化，並且在某些實施方案中是鼠20C2的親和性成熟的衍生物。與鼠20C2抗體相似，本文公開的抗體表現出對於ADDL的多維構象的高度選擇性，對單體A卩肽具有最小的檢測能力。有利的是，本抗體能夠鑑別阿茨海默氏病腦切片中的內源性寡聚體並抑制bADDL與神經元的結合。此外，本抗體顯著並強有力地增加了血漿A，x-40的水平，這種增加已知與腦中A(i的遠程降低有關。因此，本發明的抗體在阻止ADDL與神經元的結合和ADDL的組裝、以及與ADDL有關的疾病包括阿茨海默氏病的治療中發現應用。因此，本發明是差異性識別ADDL的一種或多種多維構象的分離的抗體。本發明的抗體，當它基本上沒有其它同樣類型的生物大分子存在時，被說成是分離的。因此，"分離的抗體"是指基本上不含其它抗體的抗體；但是，分子可以包括一些額外的不會有害影響抗體基本性質(例如結合特異性、中和活性等)的試劑或實體。能夠特異性結合ADDL的一種或多種多維構象的抗體，結合從Ap1-42的寡聚化得到的特定ADDL，但是象鼠20C2—樣，不與其它的A(i肽，即Ap1-12、A卩1-28、A(31-40和Ap12-28交叉反應，正如通過western印跡分析所確定的那樣；並且傾向於結合溶液中的ADDL。兩個實體之間的特異性結合一般是指至少106、107、108、109或10ieM—1的親和性。大於10SM"的親和性預期是實現特異性結合所需的。在特定的實施方案中，能夠特異性結合一種或多種ADDL的多維構象的抗體也是針對ADDL的多維構象產生的(即用其免疫動物)。在其它實施方案中，能夠特異性結合一種或多種ADDL的多維構象的抗體是針對低的n元形成(n-mer-forming)肽例如A(31-42[Nle35-Dpro37]而產生的。術語"表位"是指與B和/或T細胞反應的抗原上的位點，或者抗體將針對其產生和/或抗體將與其結合的分子上的位點。例如，表位可以被規定該表位的抗體所識別。線性表位是其中胺基酸的一級序列包含了被識別的表位的表位。線性表位典型包括至少3個、更通常至少5個、例如大約6個到大約IO個獨特序列的胺基酸。與線性表位相反，構象表位是其中包含表位的胺基酸的一級序列不是被識別的表位的唯一決定成分的表位(例如其中胺基酸的一級序列不必需被規定表位的抗體所識別的表位)。典型情況下，相對於線性表位來說，構象表位包括了更大數量的胺基酸。至於構象表位的識別，抗體識別肽或蛋白的三維結構。例如，當蛋白分子摺疊形成三維結構時，形成構象表位的某些胺基酸和/或多肽骨架變得並置在一起，使得抗體能夠識別表位。確定表位的構象的方法包括但不限於例如X-射線晶體學、二維核磁共振光譜學和位置定向自旋標記以及電子順磁共振光譜學。參見例如Morris主編的《分子生物學方法》(1996年)第66巻(MethodsinMolecularBiology(1996)vol.66)中的《表位作圖規禾呈》(EpitopeMappingProtocols)。A(3衍生的可擴散的配體或ADDL是指澱粉樣肽(51-42的可溶性寡聚物，預期由少於8個或9個澱粉樣肽(31-42的聚集物構成，被發現與阿茨海默氏病有關。它與高分子聚集的中間體相反，後者形成導致纖絲形成的膠束刺毛。正如本文所例舉的那樣，本抗體結合或識別ADDL的至少一種多維構象。在特定的實施方案中，本抗體結合ADDL的至少2種、至少3種或至少4種多維構象。ADDL的多維構象旨在包含二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體、十聚體等，正如通過SDS-PAGE分析所確定的那樣。由於三聚體、四聚體等的名稱能夠隨著所使用的分析方法而不同(參見例如Bitan,等(2005)Amyloid12:88-95)，本文中使用的三聚體、四聚體等的定義是按照SDS-PAGE分析做出的。因而，本發明的抗體具有寡聚體特異性的性質。在特定的實施方案中，ADDL的多維構象與特定的多肽結構相關，所述多肽結構產生被本發明的抗體識別的構象表位。在其它實施方案中，本發明的抗體特異性結合大小範圍大約為三聚體或四聚體、分子量超過50kDa的多維構象ADDL。10在某些實施方案中，除了與多維構象結合之外，本抗體還與澱粉樣肽P1-42的選定的線性表位結合。ADDL的線性表位意指位於澱粉樣肽(3l-42的N-末端10、11、12、15或20個胺基酸殘基中的4、5、6或更多個胺基酸殘基肽。在特定的實施方案中，本發明的抗體與澱粉樣肽(31-42的1-10、1-8、3-10或3-8位殘基內的線性表位特異性結合。被本發明的人源化抗體結合的示例性澱粉樣肽(31-42的線性表位是胺基酸殘基Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser(SEQIDNO:1)。儘管本發明的抗體可能具有相似的線性表位，但這些線性表位並不能完全指示本發明抗體的結合性質(即阻斷ADDL與神經元結合、防止t磷酸化和抑制ADDL組裝的能力)，這是因為正如本領域的專業技術人員所熟知的那樣，線性表位可能僅僅相當於抗原表位的一部分(參見例如Breitling和Dubel(1999)《重組抗體》(RecombinantAntibodies)，JohnWiley&Sons,Inc.,NY，115頁)。例如，鼠20C2已知結合電荷反轉的、截短的AP7-42肽的組裝體，該組裝體缺少20C2的線性表位(即3-8位的胺基酸殘基)，並含有非常不同的對應於AP的7-16位殘基的序列。因此，20C2及其人源化衍生物，與依賴於來自AP的17-42位殘基內元件的構象表位結合，但是只是在多維構象中時才結合。本發明的抗體與現有工藝中的抗體的區別在於能夠差異識別多維ADDL，因此能夠差異阻斷ADDL與神經元的結合、差異阻止t磷酸化和差異抑制ADDL組裝。合乎本發明使用的抗體包括但不限於單克隆抗體、及其嵌合、人類(例如從B細胞中分離)、人源化、中和、雙特異性或單鏈抗體。在一個實施方案中，本發明的抗體是單克隆抗體。為了生產抗體，可以通過用合成的或天然的ADDL注射來免疫各種宿主，包括山羊、兔、雞、大鼠、小鼠、人類等。生產抗體的方法在本領域中是眾所周知的。參見例如Kohler禾卩Milstein((1975)Nature256:495-497)禾PIHarlow和Lane的(《抗體實驗室手冊》Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(1988))。根據宿主的種類，可以使用各種佐劑來增強免疫應答。合乎本發明使用的佐劑應該增強對ADDL的內在應答，而不在免疫原中引起影響應答的定性形式的構象變化。特別適合的佐劑包括3-脫氧醯化的單磷醯脂A(MPLTM;RIBIImmunoChemResearchInc.,Hamilton,MT;參見GB2220211)和水包油乳液，例如鯊烯或花生油，任選與免疫刺激劑組合，例如單磷醯脂A(參見Stoute,等(1997)N.Engl.J.Med.336:86-91)、胞壁醯基肽(例如，N-乙醯胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯-去甲胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)、>1-乙醯胞壁醯丄-丙氨醯-0-異穀氨醯胺基丄-丙氨酸-2-(r-2，-二棕櫚醯-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(E-PE)、N-乙醯葡萄糖胺基-N-乙醯胞壁醯-L-丙氨酸-D-異穀氨醯胺-L-丙氨酸-二棕櫚醯氧基丙胺(DTP-DPP))，或其它細菌細胞壁組分。水包油乳液的具體例子包括MF59(WO90/14837)，含有5%鯊烯、0.5%TWEEN80和0.5%SPAN85(任選包含不同量的MTP-PE)，使用微射流納米均質機(microfluidizer)例如110Y型微射流納米均質機(Microfluidics,Newton,MA)配製成亞微米顆粒；SAF，含有10%鯊烯、0.4%TWEEN80、5。/。PLURONIC⑧阻斷的聚合物L121和thr-MDP，或者微射流納米均質成亞微米乳液或渦旋振蕩產生較大粒度的乳液；以及RIBlTM佐劑系統(RAS)(RibiImmunoChem,Hamilton,MT)，含有2%鯊烯、0.2%TWEEN80以及一種或多種細菌細胞壁組分，例如單磷醯脂A、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)以及細胞壁骨架(CWS)。另一類佐劑是皂苷佐劑，包括ISCOM(免疫刺激複合物)和ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville，Australia)。其它適合的佐劑包括弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、礦物凝膠例如氫氧化鋁、以及表面活性物質例如溶血卵磷脂、PLURONK^多元醇、聚陰離子、肽、CpG(WO98/40100)、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚和細胞因子例如白介素(IL-I、IL-2和IL-12)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF)。在用於人類的佐劑中，BCG(卡介苗)和短12小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)是特別適合的。針對多維構象ADDL的抗體是通過用ADDL免疫動物來產生的。一般來說，ADDL可以合成產生，或通過重組體片段表達和純化來產生。合成的ADDL可以按照本文公開的或依照美國專利No.6,218,506或共同待決的申請美國序號60/621,776、60/652,538、60/695,528和60/695,526中公開的方法來製備。此外，ADDL可以與另一個蛋白例如匙孔血藍蛋白融合，以產生針對嵌合分子的抗體。ADDL可以在構象上受約束，以形成本文描述的有用的表位，此外可以與表面相連，例如物理連接或化學鍵合於表面，其方式使得允許產生被本發明的抗體識別的構象。針對ADDL的多維構象的單克隆抗體，可以使用提供用來通過培養的連續細胞系生產抗體分子的任何技術來製備。這些技術包括但不限於雜交瘤技術、人類B-細胞雜交瘤技術和EBV-雜交瘤技術(Kohler,等(1975)Nature256:495-497;Kozbor,等(1985)J.Immunol.Methods81:31-42;Cote,等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030;Cole,等(1984)Mol.CellBiol.62:109-120)。在特定的實施方案中，本發明的抗體被人源化。人源化的或嵌合的抗體可以通過將小鼠的抗體基因與人類抗體基因進行剪接、以獲得具有適合的抗原特異性和生物學活性的分子來生產(參見Morrison,等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855;Neuberger,等(1984)Nature312:604-608;Takeda,等(1985)Nature314:452-454;Queen,等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033;WO90/07861)。例如，小鼠的抗體在噬菌體選擇載體中被表達為Fv或Fab片段。輕鏈的基因(在平行實驗中用重鏈的基因)與人類抗體基因的文庫進行交換。然後鑑定出仍然結合抗原的噬菌體抗體。這種方法，通常被稱為鏈改組，提供了人源化的抗體，該抗體將與它所起源的小鼠抗體一樣，結合同樣的表位(Jespers，等(1994)BiotechnologyNY12:899-903)。作為一種替代，鏈改組可以在蛋白質水平上進行(參見Figini，等(1994)J.Mol.Biol.239:68-78)。人類抗體也可以使用噬菌體展示方法來獲得。參見例如W091/17271和WO92/01047。在這些方法中，噬菌體文庫產生，其中的成員在它們的外表面上展示不同的抗體。抗體通常被展示為Fv或Fab片段。具有所需特異性的噬菌體展示抗體通過對ADDL的親和性富集來篩選。針對ADDL的人類抗體也可以從非人類的轉基因動物來生產，該動物具有編碼人類免疫球蛋白基因座的至少一個片段和失活的內源免疫球蛋白基因座的轉基因。參見例如WO93/12227和WO91/10741。人類抗體可以通過競爭性結合實驗或者其它方式來篩選，以具有與特定的小鼠抗體相同的表位特異性。這樣的抗體一般保留了小鼠抗體的有用的功能性質。也可以提供血清形式的人類多克隆抗體，來自用免疫原性劑免疫的人類。任選，這樣的多克隆抗體可以通過親和純化，使用ADDL作為親和試劑，進行濃縮。正如本文所例舉，人源化的抗體也可以通過對鼠抗體進行嵌飾或表面重建來產生。嵌飾包括只將小鼠重鏈和輕鏈可變區中的表面固定區胺基酸用同源人類抗體序列的相應區域中的胺基酸替代。小鼠表面胺基酸用來自同源人類序列同樣位置中的人類殘基來替換，已經顯示出降低了小鼠抗體的免疫原性，同時保持了其配體結合。替換外部的殘基一般對內部結構域或結構域間的接觸僅有很小的影響或沒有影響。(參見例如美國專利No.6,797,492)。人類或人源化抗體可以被設計為具有IgG、IgD、IgA、IgM或IgE恆定區，和任何同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在特定的實施方案中，本發明的抗體是IgG或IgM或其組合。本發明的其它實施方案包含了通過將人類IgG4序列選擇性整合到標準的人類IgG2恆定區中而形成的恆定區。示例的突變體IgG2Fc是IgG2m4，在本文中顯示為SEQIDNO:140。抗體可以被表達為含有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體、分離的重鏈和輕鏈、或其中的重鏈和輕鏈可變結構域通過間隔區連接的單鏈抗體。生產單鏈抗體的技術在本領域中是眾所周知的。示例的鼠20C2單克隆抗體的人源化抗體衍生物在本文中通過CDR嫁接和嵌飾來提供。IgG2M4重鏈可變區、以及通過嵌飾產生的人源化20C2(即Hu20C2A3)的k輕鏈可變區的胺基酸序列顯示在圖7A和7C中，在本文中顯示為SEQIDNO:141禾qSEQIDNO:143。也考慮到了雙抗體。雙抗體是指工程化的抗體構建體，通過分離結合抗體的結合結構域(重鏈和輕鏈的)、並提供連接基團以連接或操作地連接同一條多肽鏈上的重鏈和輕鏈從而保留了結合功能來製備(參見Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444;Poljak(1994)Structure2:1121-1123)。這在本質上來說形成了徹底簡化的抗體，僅僅具有結合抗原所必需的可變結構域。通過使用短得不允許同樣鏈上的兩個結構域之間配對的接頭，迫使結構域與另一條鏈上的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。這些二聚體抗體片段、或雙抗體，是雙價的和雙特異性的。專業技術人員將會認識到可以使用任何產生雙抗體的方法。適合的方法由Holliger等(1993)(同上)、Poljak(1994)(同上)、Zhu等(1996)Biotechnology14:192-196和美國專利No.6,492,123描述，在此合併引為參考。本發明的分離的抗體的片段也明確地被本發明所包含。片段意指包含Fab片段、F(ab')2片段、F(ab')片段、雙特異性scFv片段、Fd片段和通過Fab表達文庫產生的片段、以及肽適配體。例如F(ab')2片段是通過用胃蛋白酶消化本發明的抗體分子而產生的，而Fab片段是通過還原F(ab')2片段的二硫橋而產生的。或者，可以構建Fab表達文庫，以允許按照快速而容易地鑑定具有所需特異性的單克隆Fab片段(參見Huse等(1989)Science254:1275-1281)。在特定的實施方案中，本發明的抗體片段是保留了其可變區結合位點的中和抗體的片段。例子有F(ab')2片段、F(ab，)片段和Fab片段。總的來說參見《免疫學基本方法》(Immunology:BasicProcesses)(1985)(第二版)，J.Bellanti主編，95-97頁。差異識別ADDL的多維構象的肽適配體可以在適配體文庫(例如AptanomicsSA，Lyon，France所提供的)中被合理地設計或篩選。一般來說，肽適配體是根據抗體結構設計的合成的識別分子。肽適配體由可變的肽環構成，所述肽環在兩端與蛋白支架相連。這種雙重結構約束將肽適配體的結合親和性極大地提高到了可以與抗體相比的水平(納摩爾範圍)。為用於生產本發明的抗體和抗體片段的重鏈和輕鏈可變區編碼的示例性核酸序列在本文中分別公開在圖7B和7D中(即SEQIDNO:142和144)。正如專業技術人員所體會的那樣，本文公開的重鏈可變區可以與任何一個本文公開的輕鏈可變區相結合，以產生具有修改的親和性、解離常數、表位等的抗體。本發明的抗體或抗體片段可以具有與其連接的其它基團。例如，如美國專利No.4,493,825所述，微球或微粒可以連接到抗體或抗體片段上，該專利的公開內容在此合併引為參考。此外，特定的實施方案包括了抗體或抗體片段，其為了增加的抗原親和性、中和活性(即阻斷ADDL與神經元細胞結合的能力或阻斷ADDL組裝的能力)、或改變的解離常數進行突變並篩選。大腸桿菌(E.coli)突變菌株(Low,等(1996)J.Mol.Biol.260:359-368)、鏈改組(Figini，等(1994)同上)和PCR突變發生是已確定的用於編碼抗體的核酸分子突變的方法。作為說明，可以通過將大量噬菌體抗體與少量生物素化抗原相接觸以便抗體競爭結合，從而篩選增加的親和性。在這種情況下，抗原分子的數量應超過噬菌體抗體的數量，但是抗原的濃度應該稍微低於解離常數。因此，主要的親和性增加的突變噬菌體抗體與生物素化抗原結合，而較大部分的弱親和性噬菌體抗體保持不結合。然後鏈親和素能夠幫助從混合物中富集具有較高親和性的突變噬菌體抗體(Schier,等(1996)J.Mol.Biol.255:28-43)。示例性親和成熟的輕鏈CDR3胺基酸序列在本文中公開(參見表6和7)，在特定的實施方案中包含輕鏈CDR3胺基酸序列Xaa廣Gln-Xaa2-Thr陽Arg-Val-Pro-Leu陽Thr(SEQIDNO:2)，其中Xaa!是Phe或Leu，Xaa2是Ala或Thr。本文中也提供了親和成熟的重鏈CDR3胺基酸序列。示例性重鏈CDR3胺基酸序列在本文中顯示為Arg-Gln-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Thr-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQIDNO:3)。本發明還包含了這種CDR3的衍生物，例如Arg陽Ala-Leu-Ser-Pro-Arg-Ser-Ile-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQIDNO:4)、Arg-Gln-Leu-Glv-Ala-Arg-Lvs-Thr陽Asp-Ala-Met-Asp陽Tyr(SEQIDNO:5)、Arg-Gln-Leu-Glv-Pro-Arg-Lvs-Arg-Asp-Ala-Met-Asp-Tvr(SEQIDNO:6)、Arg誦Gln-Leu-Glv-Lvs-Leu-Lvs-Thr-Asp-Ala-Met-Asp-Tvr(SEOIDNO:7)或Arg隱Gln-Leu-Gly-Arg-Arg陽Ser-Val-Asp-Ala-Met陽Asp-Tvr(SEQIDNO:8)，其中與Hu20C2A3重鏈CDR3的差別被下劃線。就此，本發明特別包含了抗ADDL抗體，它具有CDR3胺基酸序列Arg-Xaa廣Leu-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQIDNO:9)，其中Xaa,是Gin或Ala，Xaa2是Ser或Gly，Xaa3是Pro、Ala、Lys、Arg或Thr，Xaa4是Lys或Arg，Xaa5是Gly、Ser或Lys，Xaa6是Val、Thr、lie或Arg。其它涵蓋在本發明範圍內的抗體衍生物包括任何除了在輕鏈框架區中具有一個胺基酸殘基的差異之外與Hu20C2A3的可變區完全相同的人源化抗體(例如Leu-Pro-Val-Thr陽Pro-Glv-Glu-Pro-Ala-Ser,SEQIDNO:IO)。對於某些治療應用來說，可能希望降低抗體從抗原上的解離。為了達到這種目的，將噬菌體抗體結合到生物素化抗原上，並加入過量的未生物素化抗原。經過一段時間之後，可以用鏈親和素主要收集具有較低解離常數的噬菌體抗體(Hawkins,等(1992)J.Mol.Biol.226:889-96)。可以使用各種免疫分析方法，包括在本文中公開的方法，來篩選以鑑定對ADDL的多維構象具有所需特異性的抗體或其片段。使用多克隆或單克隆抗體或其片段，進行競爭性結合(例如ELISA)、乳膠凝集分析、免疫放射分析、動力學(例如BIACORETm分析)的眾多方案在本領域中是公知的。這樣的免疫分析典型地包括測定特定抗體與其關聯抗原之間的複合物的形成。利用與兩個互不幹擾的表位進行反應的單克隆抗體進行的雙位點、基於單克隆抗體的免疫分析方法是適合的，但是競爭性結合分析也可以使用。這樣的分析也可以用於檢測樣品中ADDL的多維構象。抗體或抗體片段也可以經歷其它的生物活性分析，例如ADDL與神經元或培養的海馬細胞結合的置換或阻斷ADDL的組裝，以便評估其中和或藥理活性及其作為預防性或治療性藥劑的潛在效能。這樣的分析在本文中描述，並且在本領域內是眾所周知的。抗體和抗體片段可以以雜交瘤生產和維持，或者在任何成熟的表達系統中通過重組生產，這些表達系統包括但不限於大腸桿菌、酵母(例如酵母菌和畢赤氏酵母菌)、杆狀病毒、哺乳動物細胞(例如骨髓瘤、CHO、COS)、植物、或轉基因動物(Breitling和Dubel(1999)《重組抗體》，RecombinantAntibodies,JohnWiley&Sons,Inc.,NY，119-132頁)。抗體和抗體片段可以使用任何適合的方法來分離，包括但不限於親和層析、免疫球蛋白結合分子(例如蛋白A、L、G或H)、與抗體或抗體片段可操作地連接的標籤(例如His-標籤、？1^^3@-標籤、Strep標籤、c-myc標籤)等。參見Breitling和Dubel(1999)，同上。本發明的抗體和抗體片段具有各種用途，包括診斷與ADDL蓄積有關的疾病、阻斷或抑制ADDL與神經元細胞的結合、阻斷ADDL的組裝、預防性或治療性治療與ADDL有關的疾病、鑑定阻止ADDL與神經元結合的治療劑、和阻止t蛋白在Ser202/Thr205的磷酸化。本發明的抗體和抗體片段也可用於阻斷或抑制ADDL與神經元細胞結合的方法中。本發明的這種方法是通過在體外或體內將神經元與本發明的抗體或抗體片段相結合、使得ADDL與神經元的結合被阻斷來進行的。在特定的實施方案中，本發明的抗體或抗體片段使ADDL的結合與不存在抗體或抗體片段的情況下ADDL的結合相比，降低了至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或97%。抗體可以阻斷ADDL與神經元結合的程度可以依照本文公開的方法來確定，即免疫細胞化學或基於細胞的鹼性磷酸酶分析或任何其它適合的分析。對於降低ADDL與神經元細胞的結合特別有用的抗體包括具有SEQIDNO:9中描述的CDR3胺基酸序列的抗ADDL抗體，及其衍生物和片段。本發明的抗體和抗體片段還可用於阻斷或抑制ADDL組裝的方法中。該方法包括將含有澱粉樣(3l-42肽的樣品與本發明的抗體或抗體片段相接觸，使得ADDL的組裝被抑制。抗體能夠阻斷ADDL組裝的程度可以依照本文公開的方法來確定，即FRET或螢光偏振或任何其它適合的分析。對於阻斷ADDL的組裝特別有用的抗體包括具有SEQIDNO:9中描述的CDR3胺基酸序列的抗ADDL抗體，及其衍生物和片段。本文公開的抗體也可用於阻止t蛋白在Ser202/Thr205位磷酸化的方法中。該方法包括將含有t蛋白的樣品與本發明的抗體或抗體片段相接觸，使得ADDL與神經元的結合被阻斷，從而阻止t蛋白的磷酸化。抗體可以阻止t蛋白在Ser202/Thr205位磷酸化的程度可以按照本文公開的方法或任何其它適合的分析來確定。阻斷或降低ADDL與神經元的結合、抑制ADDL的組裝、以及阻止t蛋白在Ser202/Thr205位上的磷酸化，都在預防性或治療性治療與ADDL的蓄積相關的疾病的方法中發現了應用。因此，本發明也包含了本發明的抗體或抗體片段預防或治療與ADDL蓄積有關的疾病的應用(例如阿茨海默氏病或類似的與記憶有關的病症)。本領域中的證據表明，A卩水平升高、而不必是聚集的斑塊，是與阿茨海默氏病有關的痴呆和隨後的t異常的原因。A(j衍生的可擴散配體直接涉及了與阿茨海默氏病有關的神經毒性。本領域指出，在轉基因小鼠和阿茨海默氏病患者中，ADDL升高了，並在動物模型中調節了與記憶過程有關的功能活性。因此，除去這種形式的A(3可以減輕與阿茨海默氏病有關的神經毒性。同樣地，使用降低中樞神經系統ADDL負荷的本發明抗體進行治療，可以被證明對於阿茨海默氏病的治療是有效的。順應治療的患者包括具有疾病的風險但是沒有表現出症狀的個體，以及目前已經表現出症狀的患者。在阿茨海默氏病的情況下，如果他或她活得足夠長的話，實際上任何人都處於罹患阿茨海默氏病的風險之中。因此，本發明的抗體或抗體片段可以給普通人群進行預防性給藥，而不需要對目標患者的任何風險評估。本方法對於已知具有阿茨海默氏病遺傳風險的個體來說是特別有用的。這樣的個體包括那些有親屬已經被診斷出疾病的個體，以及其風險通過遺傳或生物化學標記物分析被確定的個體。阿茨海默氏病風險的遺傳標記物包括APP基因中的突變，特別是717位以及670和671位的突變，它們分別被稱為Hardy突變和Swedish突變。其它的風險標記物是早老蛋白基因PS1和PS2以及ApoE4中的突變，阿茨海默氏病家族史，高膽固醇血症或動脈粥樣硬化。目前罹患阿茨海默氏病的個體可以從特徵性痴呆以及存在上述風險因素來識別。此外，已經有多種診斷檢驗可用於鑑定患有阿茨海默氏病的個體。這些包括測量CSFT和AP1-42的水平。罹患阿茨海默氏病的個體也可以通過ADRDA標準或本文公開的方法來診斷。在無症狀的患者中，治療可以在任何年齡時開始(例如IO、20、30歲)。但是，通常在病人達到40、50、60或70歲之前，不一定開始治療。治療一般需要在一段時間內使用多個劑量。治療可以通過分析ADDL隨時間的存在來監測。在治療性應用中，含有本發明的抗體或抗體片段的藥物組合物或藥物，施用於懷疑、或已經罹患這樣的與ADDL蓄積有關的疾病的患者，其量足夠治癒或至少部分阻止疾病的症狀(生物化學、組織學和/或行為)，包括其在疾病發展過程中的併發症和中間病理表現型。在預防性應用中，含有本發明的抗體或抗體片段的藥物組合物或藥物，施用於易感與ADDL蓄積有關的疾病或者處於其風險下的患者，其量足夠在患者中實現被動免疫，從而消除或降低疾病的風險、減輕疾病的嚴重性、或延遲疾病的發作，包括疾病的生物化學、組織學和/或行為症狀，疾病發展過程中出現的其併發症和中間病理表現型。在某些方法中，藥劑的施用降低或消除了還沒有發展出特徵性阿茨海默氏病病理的患者的記憶認知(myocognitive)損傷。在特定的實施方案中，本發明的抗體或抗體片段的有效量，是在患者中實現ADDL與神經元的結合與不治療情況下ADDL的結合相比，降低了至少15%、20%、30%、40°/。、50%、60%、70%、80%、90%、95%或97%的量。同樣地，對長期增強/記憶形成的損傷也被降低了。用於治療上述病症的本發明組合物的有效劑量依賴許多不同的因素而變化，包括給藥方式、患者的生理狀態、患者是人類還是動物、施用的其它藥物、以及治療是預防性的還是治療性的。通常下，患者是人類，但是非人類的哺乳動物例如狗或轉基因哺乳動物也可以治療。治療劑量一般被漸增到最優安全性和效能。對於使用抗體或抗體片段的被動免疫來說，適合的劑量範圍是從大約0.0001到100mg/kg宿主體重，更通常為0.01到5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg範圍內。在某些方法中，同時施用兩種或多種具有不同結合特異性的本發明的抗體，在這種情況下，每種施用的抗體的劑量處於所指示的範圍內。抗體通常需要多次施用，單劑之間的時間間隔可以以周、月或年計。示例的治療方案需要兩周或每月皮下用藥一次。有利的是，已經發現皮下用藥減少了與靜脈輸注有關的類似流感的症狀(Lundin，等(2002)Blood100:768-773)。時間間隔也可以是不規則的，按照測量患者血液中針對ADDL的抗體水平的指示。在某些方法中，劑量被調整到使血漿抗體濃度達到1-1000ng/mL，在某些方法中為25-30Qpg/mL。或者，抗體或抗體片段可以作為緩釋製劑給藥，在這種情況下，需要的給藥頻率較少。劑量和頻率根據患者中抗體的半衰期而變化。一般來說，人類或人源化抗體比嵌合抗體和非人類抗體具有更長的半衰期。正如上面指明的那樣，用藥的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，可以在長時期中以相對不頻繁的時間間隔施用相對低的劑量。某些患者在他們的餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的時間間隔使用相對高的劑量，直到疾病的發展被減緩或終止，並優選直到患者顯示出疾病症狀的部分或完全緩解。然後，患者可以按照預防性方案用藥。本發明的抗體和抗體片段可以作為藥物組合物或藥物的成分給藥。藥物組合物或藥物一般含有活性治療劑和各種其它的可藥用的成分。參見的《雷氏藥物科學與實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)，AlfonsoR.Gennaro主編，第二十版，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia,PA,2000。其優選的形式依賴於目標給藥方式和治療應用。根據所需的製劑，藥物組合物可以包含可藥用的、無毒載體或稀釋劑，它們被定義為通常用於配製為動物或人類給藥的藥物組合物的介質。選擇稀釋劑使得不影響組合的生物學活性。這樣的稀釋劑的例子是蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer's溶液、右旋糖溶液和Hank's溶液。藥物組合物也可以含有大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白、多糖如殼聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如乳膠官能化的SEPHAROSETM、瓊脂糖、纖維素等)、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物和脂類聚集物(例如油滴或脂質體)。22本發明的藥物組合物或藥物的給藥可以通過各種途徑進行，包括但不限於口、局部、肺、直腸、皮下、真皮內、鼻內、顱內、肌肉內、眼內或關節內注射等。最典型的給藥途徑是靜脈內，然後是皮下，儘管其它途徑能夠同樣有效。也可以在臂或腿的肌肉內進行肌肉注射。在某些方法中，藥劑被直接注射到沉澱物蓄積的特定組織中，例如顱內注射。在某些實施方案中，抗體或抗體片段被直接注射到顱內。在其它的實施方案中，抗體或抗體片段作為緩釋組合物或裝置給藥，例如MEDIPADTm裝置。對於腸胃外給藥來說，本發明的抗體或抗體片段可以以可注射劑，該藥劑是物質在含有藥用載體的生理可接受的稀釋劑中的溶液或懸浮液，該藥用載體可以是無菌液體，例如水、油、鹽水、甘油或乙醇。或者，輔助性物質，例如增溼劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩衝物質等可以在組合物中存在。其它藥物組合物的成分是石油、動物、植物或合成來源的成分，例如花生油、大豆油和礦物油。一般來說，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇是適合的液體載體，特別是對可注射的溶液來說。抗體能夠以長效注射或植入製備物的形式給藥，它們配製的方式允許活性成分的持續釋放。示例性組合物包含配製成無菌透明液體的本抗體或抗體片段，濃度為至少10mg/ml，在等滲的緩衝鹽水中(10mM組氨酸，150mM氯化鈉，0.01%(w/v)POLYSORBATE80，pH6.0)。示例性的抗體製劑按單劑裝入，0.6ml的玻璃注射小瓶中，每瓶裝有3.3ml溶液。每個小瓶用塗有特氟隆的塞子塞住，並用鋁帽密封。通常，組合物被製備成注射劑，或是液體溶液或是懸浮液；也可以製備適合於在注射前溶解或懸浮在液體介質中的固體形式。製備物也可以被乳化或包囊在脂質體或微粒中，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中，以增強輸送。對於栓劑來說，粘合劑和載體包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；這樣的栓劑可以從含有範圍在0.5%到10%、更適宜1%-2%的活性成分的混合物來形成。口服製劑包括賦形劑，例如藥品級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物採取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或粉末的形式，含有10%-95%的活性成分，或更適合的是25%-70%。局部應用可以導致透皮或真皮內的輸送。局部應用可以通過將藥劑與霍亂毒素或其脫毒的衍生物或亞單位或其它類似的細菌毒素共同給藥來易化。(參見Glenn，等(1998)Nature391:851)。共同用藥可以通過使用成分作為混合物或作為通過化學交聯或表達為融合蛋白而獲得的連接分子來實現。或者，透皮輸送可以使用皮膚途徑或使用轉運體(transferosome)來實現(Paul,等(1995)Eur.J.Immunol.25:3521-24;Cevc,等(1998)Biochem.Biophys.Acta1368:201-15)。本發明的抗體或抗體片段可以任選與在治療促澱粉樣變疾病中至少部分有效的其它藥劑組合使用。例如，本抗體可以與現有的阿茨海默氏病的舒緩劑治療一起施用，例如乙醯膽鹼酯酶抑制劑如ARICEPTTM、EXELON禾卩REMINYL,以及NMDA拮抗劑，NAMENDATM。除了這些被批准的療法之外，本抗體可以用於為目前在治療阿茨海默氏病的開發中的幾種方法的任何一種提供協同的/附加的好處，這包括但不限於A卩生產和聚集抑制劑。本發明的抗體和抗體片段在鑑別阻止ADDL與神經元(例如海馬細胞)的結合、從而阻止由ADDL引起的下遊事件的治療劑中，也發24現了應用。這樣的分析是通過在藥劑的存在下將神經元與ADDL接觸、並使用本發明的抗體或抗體片段測定在藥劑的存在下ADDL與神經元的結合來進行的。正如本領域的專業技術人員所體會的那樣，阻斷ADDL與神經元結合的藥劑，與沒有接觸藥劑時的神經元相比，將減少與神經元結合的的ADDL的量；這種量在使用本發明的抗體或抗體片段的免疫分析中是可以檢測到的。適合用於檢測與神經元結合的ADDL的免疫分析在本文中被公開。可以使用本文提供的方法來篩選的藥劑包含了大量的化學類別，儘管它們通常為有機分子，優選為分子量大於100而小於大約2,500道爾頓的小有機化合物。藥劑包含了與蛋白發生結構相互作用所必需的官能團，特別是氫鍵，並通常包括至少胺、羰基、羥基或羧基基團，優選至少兩種官能化學基團。藥劑經常含有被一個或多個上述官能團取代的環狀碳或雜環結構和/或芳香或多芳香結構。藥劑也可以是生物分子，包括肽、抗體、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。藥劑從廣泛的各種來源獲得，包括天然的或合成的化合物文庫。各種其它的試劑例如鹽和中性蛋白可以被包含在篩選分析中。此外，可以提高分析效率的試劑例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等也可以以任何順序加入，提供必需的結合。通過本發明的篩選分析鑑定的藥劑對於促澱粉樣變的疾病和/或t蛋白病的治療將是有益的。此外，也考慮到了用於示範這些概念的實驗系統也代表了研究工具，用於評估、鑑定和篩選與t磷酸化的p澱粉樣肽誘導有關的新藥物靶。本發明還提供了使用本發明的抗體或抗體片段檢測ADDL和診斷與ADDL蓄積有關的疾病的方法。與ADDL蓄積有關的疾病旨在包括了其中ADDL蓄積導致長期增強/記憶形成的生理性損傷的任何疾病。這種類型的疾病包括但不限於阿茨海默氏病和類似的與記憶相關的病症。按照這些方法，將來自患者的樣品與本發明的抗體或抗體片段相接觸，抗體或抗體片段與樣品的結合表明了樣品中ADDL的存在。當在本發明的背景中使用時，樣品是指順應使用免疫分析進行的分析的任何體液或組織。可以按照本發明的方法進行分析的適合的樣品包括但不限於來自患者(例如哺乳動物，如人類)腦的活組織檢查樣品和流體樣品。對於體外目的來說(例如在監測寡聚物形成的分析中)，樣品可以是神經元細胞系或組織樣品。對於診斷目的來說，考慮樣品可以來自被懷疑患有與ADDL蓄積相關的疾病的個體，或來自處於患與ADDL蓄積相關的疾病風險下的個體，例如具有使個體易患與ADDL蓄積相關的疾病的家族史的個體。檢測抗體或抗體片段與樣品中ADDL的結合的可以使用任何標準的免疫分析(例如本文公開的)來進行，或者當抗體片段是例如肽適配體時，可以通過例如與適配體融合的可檢測的標記蛋白(例如p-半乳糖苷酶、GFP或螢光素酶)來直接檢測結合。然後，ADDL-抗體複合物的存在或不存在分別與樣品中ADDL的存在或不存在、進而分別和與ADDL蓄積相關的疾病的存在或不存在相關聯。考慮到了本發明的一種或多種抗體或抗體片段可以與當前基於免疫的無創成像技術結合使用，以極大地提高與ADDL蓄積有關的疾病的檢測和早期診斷。為了便於診斷，本發明也提供了含有本發明的抗體或抗體片段的試劑盒。試劑盒包括了容納一種或多種識別ADDL多維構象的抗體或抗體片段的容器，以及使用抗體用於結合ADDL以形成抗體-抗原複合物、並檢測抗體-抗原複合物的形成使得抗體-抗原複合物的存在或不存在與樣品中ADDL的存在或不存在相關聯的說明書。容器的例子包括允許同時檢測多個樣品中的ADDL的多孔板。在下面的非限制性的實施例中，本發明將得到更詳細的描述。實施例1:總體材料和方法ADDL製備物在F12培養基(Biosource，Camarillo，CA)中的ADDL按照已建立的方法(Lambert等(2001)，同上)從A|51-42製備。簡單來說，將A(31-42肽(AmericanPeptideCo"Sunnyvale,CA或CaliforniaPeptideResearch,Inc.,Napa，CA)稱重，並放置在能夠容納足夠量的HFIP(1,1，1，3,3，3-六氟陽2-丙醇)的玻璃小瓶中，使肽濃度達到10mg/mL。將HFIP加入到幹的肽中，將小瓶蓋上帽，輕輕地渦旋混合，將肽/HFIP溶液儲存在室溫至少1小時。將肽溶液的等分試樣(50或100pL，分別為0.5或l.Omg)分配到一系列1.5mL的錐形離心管中。將離心管放置在SPEEDVAC⑧中過夜以除去HFIP。將含有乾燥的肽膜的管蓋上蓋，在-7(TC儲存在有乾燥劑的密封容器。使用前，將APl-42肽膜從-7(TC儲存處取出，使其回暖至室溫。加入新鮮的DMSO(44i!L/mg肽膜；5mM)，將肽/DMSO混合物在振蕩混合器上以可能的最低速度孵育10分鐘。將F12培養基(2mL/mg肽)分配到每個DMSO/肽管中，將管蓋上蓋，顛倒混合。將100nM製備物在2-8'C儲存18到24小時。將樣品以14,000xg在2-8'C離心10分鐘。將上清液轉移到新的管中，儲存在2-8'C直到使用。生物素化ADDL製備物(bADDL)按照與上述用於ADDL製備物相同的方式進行製備，使用100%N-末端生物素化的(3澱粉樣肽(AmericanPeptideCompany,Sunnyvale,CA)。單體製備(3(1-40)澱粉樣肽肽(Apl-40)的HFIP乾燥製備物按照製備A(31-42肽的概述製備。將肽膜溶解在每毫克肽2mL25mM的硼酸鹽緩衝液中(pH8.5)，分成等份，在-7(TC冷凍直到使用。初級神經元從冷凍的、分離的新生大鼠海馬細胞(Cambrex，Corp.,EastRutherford,NJ)製備初級海馬細胞培養物，所述新生大鼠海馬細胞被化凍並以每孔20,000個細胞的濃度在96孔COSTAI^板鋪板。將細胞維持在不含L-穀氨醯胺的NEUROBASAL培養基中(GIBCO-BRL,Ga池ersburg，MD)，並補充兩個星期的B27(GIBCO-BRLTM，Gaithersburg，MD)，然後用於結合研究。免疫細胞化學免疫細胞化學按照已建立的方法進行(Lambert，等(2001)，同上)，只是將第二抗體與ALEXAFLUOR588(MolecularProbes，Eugene,OR)結合。將抗體和ADDL以抗體:ADDL為1:4的摩爾比率在室溫預孵育1小時，然後應用於21天的海馬細胞培養。對於內源ADDL來說，將人類腦蛋白(製備按照Lambert等(2001)，同上)與細胞孵育l小時，然後如上所述將細胞進行清洗、固定和可視化。將來自阿茨海默氏病和對照海馬的輕微固定的冷凍切片(4%多聚甲醛在4°。30小時，和在40pM蔗糖中低溫保護)與抗體(在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中1:1000)在fC孵育過夜。在除去抗體之後，將切片用PBS清洗3次，然後與第二抗體在室溫下孵育。然後用DAB(SIGMA,St.Louis,MO)令結合可視化。然後將切片用蘇木精復染、固定，在裝備有SPOTINSIGHT數字攝像機(v.3.2)的NIKONECLIPSEE600光學顯微鏡下成像。ELISA:將多克隆抗ADDLIgG(M90/l;BethylLaboratories,Inc.,Montgomery,TX)以0.25mg/孔室溫下鋪於IMMULON3REMOVAWELL條(DynatechLabs,Chantilly,VA)上2小時，用溶於TBS的2%BSA封閉孔。在孔中加入用含有1%BSA的F12稀釋的樣品，令在4°C結合2小時，用BSA/TBS在室溫清洗3次。將在BSA/TBS中稀釋的單克隆抗體在室溫孵育90分鐘，用針對小鼠IgG的VECTASTAINABC試劑盒檢測。HRP標記用BIO-RAD⑧過氧化物酶底物進行可視化，在DynexMRX-TC微孔板讀板器上於405nm讀數。實施例2:小鼠抗體可變區序列的分離使用特別設計的與小鼠恆定區5'-末端和V區上遊的鼠前導序列雜交的引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)克隆和測序了為20C2小鼠抗體的可變區結構域編碼的cDNA。這確保了所得的小鼠可變區序列是完整和準確的。簡而言之，使用QIAGEN⑧OLIGOTEX⑧直接mRNA小型試劑盒，從小鼠雜交瘤細胞系提取了mRNA，然後使用第一條鏈cDNA合成試劑盒轉化為cDNA。然後在PCR反應中使用cDNA作為模板，以獲得抗體可變區序列。為了獲得輕鏈可變區序列，使用11個輕鏈5'PCR引物(MKV-1到MKV-ll)中的每一個和3'PCR引物MKC-1(表1)，建立了11個獨立的PCR反應。表1tableseeoriginaldocumentpage29下劃線和斜體的序列分別表示XbaI和SacI限制性位點。W=A或T，M-A或C，K-G或T，Y-C或T,R-A或G。為了獲得重鏈可變區序列，使用12個重鏈5'PCR引物(MHV-1到MHV-12)中的每一個和適合的同種型特異3'引物(MHCG-l、MHCG-2A、MHCG-2B、MHCG-3)(表2)，建立了12個獨立的PCR反應。表2tableseeoriginaldocumentpage30下劃線和斜體的序列分別表示XbaI和SacI限制性位點。W=A或T，M-A或C，K-G或T，Y二C或T，R-A或G。每個輕鏈PCR反應含有46INVITROGENPLATINUMPCRSuper混合物、I.QiiL1005'引物(MKV-1到MKV-11)中的一種、l.PiaL100(iM3'引物(MKC-1)，以及2.Q|aL雜交瘤cDNA。使用類似的PCR反應以克隆小鼠重鏈可變區序列。將反應放置在DNA熱循環儀中，在經過97'C2分鐘的起始變性步驟後，進行30個下列的循環95°C30秒，55°C45秒，和72°C90秒。在最後一個循環之後，採用72'CIO分鐘的最後的延伸步驟。為了確定哪個PCR反應產生了產物，來自每個反應的5pL等分試樣在含有0.5pg/mL溴化乙錠的1.5。/。(wA0瓊脂糖/lXTAE緩衝液凝膠上分離。然後來自產生具有預期大小(420到500bp)的片段的反應中的PCR產物進行凝膠純化，用XbaI和SacI消化，連接到質粒pNEB193(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)的多克隆區中的XbaI和SacI位點中。或者，使用INVITROGEN丁八010>1^0@試劑盒，PCR產物直接連接到質粒pCI^2.1中。然後將連接產物轉化到XL-1細胞中，將轉化的大腸桿菌的等分試樣鋪於含有50pg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，並覆蓋40|iLX-Gal儲液(50mg/mL)禾B40|aLIPTG(lOOmM)溶液，以進行藍/白篩選。將平板在37'C孵育過夜，潛在的克隆作為白色菌落被鑑別。使用用於pNEB193禾BpCR82,1的通用正向和反向引物，對來自每個PCR產物的至少24個獨立克隆的DNA進行兩條鏈測序。然後將獲得的序列組裝成毗連序列群，以產生每個抗體輕鏈和重鏈可變區的契合序列。使用這種方法，對雜交瘤20C2的輕鏈和重鏈抗體可變區測定了序列(圖1A-1B)。在圖1A-1B中，形成了與抗原互補的結構的6個互補決定區(CDR)被下劃線。實施例3:小鼠抗ADDL抗體可變區序列的人源化使用CDR嫁接方法，對從小鼠雜交瘤細胞系20C2獲得的小鼠抗31體重鏈和輕鏈可變結構域核酸進行人源化。本領域的專業人員將會認識到，小鼠抗體序列的人源化可以通過提高其血漿半衰期和Fc效應器功能，從而降低抗球蛋白反應，來最大化抗體的治療效能。通過CDR嫁接的人源化是通過從NCBI蛋白資料庫中選擇與小鼠可變結構域最同源的人類輕鏈和重鏈可變區來進行的。使用蛋白-蛋白基本局部比對搜索工具(BLAST)，將小鼠可變區序列與資料庫中的所有人類可變區序列進行比較。然後，將小鼠的CDR連接到人類的框架區中，並分析初步的胺基酸序列。評估框架區中小鼠和人類序列之間的所有差別，特別是如果它們是環結構的典範序列的一部分、或是位於VL/VH界面處的殘基(O'Brien和Jones(2001)《抗體工程》(AntibodyEngineering)，IContermaim禾口Dubel主編，SpringerLaboratoryManuals)。還掃描框架區以尋找與人類亞類的契合序列相比不常見或稀有的胺基酸以及潛在的糖基化位點。其中在小鼠和人類框架區序列之間存在的胺基酸序列差異沒有被發現包含在典型序列中、或位於VL/VH界面時，則選擇在該位置上的人類殘基。其中在關鍵殘基上存在差別時，產生兩個版本的可變區序列以供評估。CDR嫁接策略使得對人類框架區的改變數量最小，致使達到良好的抗原結合，同時維持人類框架區與來自天然人類抗體的序列嚴密匹配。通過鼠20C2的CDR嫁接產生的獲得的人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列被分別顯示在圖2A和2B中。該抗體在本文中被命名為Hu20C2。還使用嵌飾策略設計了20C2的人源化序列(參見例如美國專利No.6,797,492)。人源化是通過從NCBI蛋白資料庫中選擇與小鼠可變結構域以及最接近的人類抗體種系家族具有最高同源性的人類輕鏈和重鏈可變區來進行的(參見Kabat等(1991)《免疫學重要的蛋白序列》，第五版，美國衛生與人類服務部(S叫uenceofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.，U.S.Dept.HealthandHumanServices),NIH，WashingtonDC)。使用蛋白-蛋白BLAST,將小鼠可變區序列與資料庫中的所有人類可變區序列進行比較。將鼠可變序列和它們最接近的人類同源物模擬成最接近的結晶的人類抗體，正如通過本領域中實施的計算機模擬所確定的那樣。根據鼠VH和VL序列的模型，構建了表面區圖譜，它標明了小鼠重鏈和輕鏈可變區中胺基酸的溶劑可及性。為了證實該模型，將這些暴露的殘基與已知的表面可及殘基(參見例如Padlan(1994)Mol.Immunol.31(3)-.169-211)逐個位置進行比較。按照已建立的方法(參見美國專利No.6,797,492，在此以其全文引為參考)，對序列中的每個殘基打分，將其指定為暴露、大部分暴露、部分包埋、大部分包埋和包埋。被打分為暴露的或大部分暴露並且與同源的人類序列不同的小鼠框架殘基，在該位置上被改變為人類殘基。被設計的嵌飾序列保留了小鼠的CDR、CDR附近的殘基、已知包括在典範序列中的殘基、位於VL/VH界面的殘基、以及在小鼠重鏈和輕鏈N-末端序列中的殘基。N-末端序列已知與CDR表面鄰接，並可能參與了配體結合。一旦嵌飾序列被完成，它們被重新模擬以尋找任何潛在的明顯的結構問題。在重鏈和輕鏈框架中分別改變了總共12個和9個胺基酸殘基。通過鼠20C2的嵌飾產生的獲得的人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列被分別顯示在圖2A和2B中。該抗體在本文中被命名為Hu20C2A3。與20C2相比，可以注意到產生Hu20C2A3的輕鏈取代而不是重鏈取代，與Hu20C2相同(圖2)。具體來說，重鏈可變區CDR3對於Hu20C2A3是獨有的。一旦人源化胺基酸序列被選定，將序列進行反向翻譯，以獲得相應的DNA序列。使用本領域已建立的方法(Lathe(1985)J.Mol.Biol.183(1):1-12)，對DNA序列進行密碼子優化，並在兩側設計了用於克隆到人類抗體表達載體中的限制性酶位點。為Hu20C2的輕鏈可變區和兩個版本的重鏈可變區編碼的核苷酸序列顯示在圖3A-3C中。兩個重鏈可變區版本在24位上有一個胺基酸取代的不同；Hu20C2版本A的重鏈可變區在24位上是Phe，而Hu20C2版本B的重鏈可變區在24位上是Leu。實施例4:親和性成熟在Hu20C2抗體上進行了親和性成熟。只編碼人源化Hu20C2版本A和B可變區重鏈、只編碼輕鏈或一起編碼重鏈版本A和輕鏈的核酸分子被克隆到Fab噬菌體展示載體pFab4中。核酸序列分析證實了pFab4中的序列和取向。在pFab4中標註的Hu20C2Fab序列被顯示在圖4A-4C中，在本文中重鏈版本A顯示為SEQIDNO:116，重鏈版本B為SEQIDNO:117，輕鏈為SEQIDNO:118。圖4D-4E中顯示了pFab4載體中重鏈版本A和輕鏈在一起的核苷酸序列。使用本
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已建立的噬菌體展示Fab文庫方法，這些構建體被用於Hu20C2的成熟程序中輕鏈成熟設計了兩個文庫以突變Hu20C2輕鏈(K)的CDR3的9個野生型胺基酸(即Phe-Gln-Gly-Ser-Leu-Val-Pro-Leu-Thr，SEQIDNO:39)。這些文庫被命名為LC3-1和LC3-2，分別代表輕鏈CDR3序歹UXaa陽Xaa-Xaa-Xaa墨Xaa-Val-Pro-Leu-Thr(SEQIDNO:40)和Phe陽Gln-Gly-Ser-Xaa-Xaa-Xaa陽Xaa-Xaa(SEQIDNO:41)。生物素化的反向引物20C2LC3-1(SEQIDNO:123)和20C2LC3-2(SEQIDNO:126)，與正向引物20C2LC3F(SEQIDNO:120)組合使用，用於產生LC3-1和LC3-2文庫(參見圖5A)。引物通過聚丙烯醯胺凝膠電泳純化，而載體DNA通過凝膠電泳和電洗脫純化。兩個輕鏈文庫被設計為隨機突變。三個10G5H6LC3文庫的最終多樣性分別為4.76x108和7.45x108(表3)。對來自文庫的大約IOO個克隆的序列分析顯示出，在設計的胺基酸位置上具有100%的突變克隆多樣性。34表3tableseeoriginaldocumentpage35*通過濃縮或噬菌體拯救(phagerescue)可以獲得更高的滴度。完成了兩個輕鏈文庫對高分子量bADDL的可溶淘選。簡單來說，使用生物素化的高分子量ADDL(bADDL)進行了四輪淘選。前三輪使用大約1.5pM的抗原濃度來進行(輸入=1x101到1x1011)。在第三輪完成之後，將兩個文庫的輸出合併，分成三個組，用10nM、100nM和大約1.5pM抗原進行分析以增加淘選的嚴謹性。這樣，總共58個輸出平板在噬菌體ELISA分析中被測試，gP，第一輪中每個文庫兩個平板(總共四個平板)，第二輪中每個文庫6個平板(總共12個平板)，第三輪中LC3-l文庫8個平板和LC3-2文庫IO個平板(總共18個平板)，第四輪中每個抗原濃度8個平板(總共24個平板)。淘選產生了1000個擊中(hit)，其中436個被測序(表4)。表4tableseeoriginaldocumentpage3620C2LC3-1對高分子量10%bADDL。b20C2LC3-2對高分子量10%bADDL。C20C2LC3-1+20C2LC3-2對高分子量10。/。bADDL。*每個菌落總數的擊中數。高度富集的克隆的序列和頻率顯示在表5中。表5tableseeoriginaldocumentpage37製備了根據富集頻率前10位的克隆的Fab片段，總共15個克隆被轉變為IgGl人源化A版本，2個克隆20C2-6和20C2-8被轉變為IgGl人源化B版本。使用生物素-Ap1-20(表6)和bADDL(表7)作為抗原，通過BIACORETM測量了這些克隆的KD值。與親代人源化20C2A和20C2B以及小鼠20C2抗體相比較，觀察到了親和性的急劇升高。具體來說，使用輕鏈CDR3序列Xaa廣Gln-Xaa2-Thr-Arg-Val-Pro國Leu-Thr(SEQIDNO:2)獲得了低納摩爾到亞皮摩爾的KD，其中Xaat是Phe或Leu，Xaa2是Ala或Thr。此外，使用生物素-A(31-20禾卩bADDL，通過BIACORETM獲得的KD值之間的比較，進一步證實了抗ADDL抗體例如Hu20C2優先結合ADDL的多維構象，而不是單體的A(J肽。表6tableseeoriginaldocumentpage38表7tableseeoriginaldocumentpage39重鏈成熟Hu20C2的重鏈也通過產生3個覆蓋重鏈CDR3(RQLGLRSIDAMDY;SEQIDNO:99)的文庫進行了優化。這些文庫被命名為20C2B-39HC3-1、20C2B-39HC3-2和20C2B-39HCr3，分別代表了重鏈CDR3序列XXXXXRSIDAMDY(SEQIDNO:100)和RQLGLRSIXXXXX(SEQIDNO:101)禾口RQLGXXXXXAMDY(SEQIDNO:102)。生物素化的反向引物20C2HC3-1(SEQIDNO:130)、20C2HC3-2(SEQIDNO:133)和20C2HC3-3(SEQIDNO:136)被用來與正向引物20C2HC3F(SEQIDNO:127)組合，產生3個文庫(參見圖5B)。文庫包含了>108的功能多樣性，覆蓋了每個組中每個隨機的位點上胺基酸的所有組合(參見表8)。表8tableseeoriginaldocumentpage40在噬菌體ELISA分析中總共測試了4輪淘選的18個輸出平板。共發現了1235個擊中，其中704個被測序。根據針對生物素化的A(51-20和生物素化的ADDL(bADDL)抗原的Fab片段的BIACOREKD值以及單點BIACORETM3000分析(表9)，使用CDR嫁接或嵌飾人源化技術，將總共6個Fab克隆轉變成了IgGl和IgG2m4。這6個Fab中的一個，被命名為4a-A3，是從文庫20C2B-39HC3-3中分離出的，並在重鏈的中間部分帶有3個胺基酸取代(RQLGIRgIDAMDY;SEQIDNO:3)。正如圖2B所證實的那樣，該重鏈CDR3序列是Hu20C2A3的序列。表9tableseeoriginaldocumentpage41實施例5:IgG2m4抗體的產生製備了IgG2m4抗體衍生物以降低Fc受體銜接、Clq結合、不想要的細胞毒性或免疫複合物的形成，同時維持典型的人類抗體的長半衰期和藥代動力學性質。IgG2m4的基本抗體格式是IgG2的格式，它在實驗模型中已經顯示出具有出色的半衰期(Zuckier，等(1994)CancerSuppl.73:794-799)。通過選擇性摻入IgG4序列，將IgG2的結構進行了修改，以消除Clq結合，同時維持了典型的低水平FcyR結合(Canfield和Morrison(1991)J.Exp.Med.173:1483-1491)。這是通過使用其中IgG2和IgG4的序列是相同的交叉點來實現的，從而產生了含有天然Fc序列而不是任何人工突變序列的抗體。使用該表現出最小的效應器相關活性的IgG2m4抗體的優點是可以與Wilcock等((2006)J.Neurosci.26:5340-6)公開的去糖基化的抗體相比較。IgG2m4形式的人類抗體恆定區是通過將人類IgG4序列選擇性地摻入標準的人類IgG2恆定區中而形成的，如圖6所示。從概念上講，IgG2m4是如圖6顯示的CH2結構域內的一對鏈交換的結果。相應於IgG4的序列發生了4個單一突變。在IgG2中突變的Fc殘基包括His268Gln、Val309Leu、Ala330Ser和Pro331Ser，這最小化了新表位的可能性。表10中顯示了位於IgG2恆定區中的特異性IgG4胺基酸殘基，以及基本結構的其它選擇。表10tableseeoriginaldocumentpage43*星號標註的位置進行了等位基因變異。aHougs,等(2001)Immunogenetics52(3-4):242-8.bW097/11971.cMedgyesi,等(2004)Eur.J.Immunol.34:1127-1135.dTao,等(1991)J.Exp.Med.173:1025-1028.eArmour,等(1999)Eur.J.Immunol.29:2613.fXu,等(1994)J.Biol.Chem.269:3469-3474,gCanfield和Morrison(1991)J,Exp.Med.173:1483.構建了人源化Hu20C2禾BHu20C2A3抗體的人類IgGl/K和IgG2m4/K版本。Hu20C2A3IgG2m4抗體的輕鏈和重鏈的完整的胺基酸序列被顯示在圖7A和7C中。實施例6:人源化抗ADDL抗體的結合親和性和特異性進行了親和性成熟以增加親和性並改進與ADDL的優先結合。為了評估人源化抗體的ADDL結合親和性，按照本文的公開進行了BIACORETM和滴定ELISA。簡單來說，用10%生物素化的ADDL抗原(1fiM)包被用鏈親和素包被的96孔微孔板(Sigma，St.Louis,MO)。將一系列從500ng/mL開始2倍稀釋的純化的抗體加入到ADDL捕獲板中，將板在25°〇孵育2小時。在用洗板機(Bio-Tek，Winooski,VA)使用PBS溶液清洗5次後，加入在3%脫脂奶阻斷劑中1/2000稀釋的多克隆山羊抗人K輕鏈抗體(Biomeda,FosterCity,CA)，在室溫孵育1小時。然後加入用阻斷溶液1/2000稀釋的兔抗山羊IgG(H+L)HRP-結合的檢測抗體(BethylLaboratories,Inc.,Montgomery,TX)，在室溫孵育1小時。在用PBS清洗後，加入HRP底物3，3'，5',5-四甲基聯苯胺(即用的TMB;Sigma,St.Louis,MO)，在10分鐘後用0.5NH2S04終止反應。在讀板器中(VICTORV型；PerkinElmer,Boston,MA)讀取450nm波長處的吸光度，使用EXCEI^工作表處理數據。估計板之間的分析偏差在20%以內。用BIACORETM測量，Fab克隆A3的Kd針対生物素化A卩1-20來說是849pM。同樣的Fab克隆的kd針對bADDL來說是82pM，表明A3Fab被證明是優先與ADDL結合的。當克隆通過嵌飾被人源化，並轉變為完整的IgGl分子或完整的IgG2m4分子(即Hu20C2A3)時，針對A(31-20和ADDL的Kd僮低於BIACORETM儀器的可靠檢測限，這表明與Hu20C2相比，Hu20C2A3針對A(31-20和ADDL的結合平衡常數的明顯提高。Hu20C2A3，是具有IgG2m4同種型的克隆A3的嵌飾版本，被表達在CHO和畢赤氏酵母中。通過ELISA評估了兩種來源的Hu20C2A3與AP單體和ADDL相互作用的能力。如圖8所示，在CH0(圖8A)或畢赤氏酵母(圖8B)中產生的Hu20C2A3表現出ADDL結合優先於Ap40單體結合(6倍)。從這些曲線確定的結合常數(IgGkso值)，產生的值對於畢赤氏酵母中產生的Hu20C2A3來說，對ADDL和A卩單體分別為64pM和376pM，對於CHO細胞中產生的Hu20C2A3來說，對ADDL和A(3單體分別為58pM和361pM。實施例7:使用人源化抗ADDL抗體抑制ADDL與神經元的結合使用本文公開的方法，進一步評估了人源化抗ADDL抗體阻斷ADDL與初級海馬神經元結合的能力。將Hu20C2A3抗體，或PBS作為對照，以不同的摩爾比率與bADDL混合，在慢速旋轉器上在37°C孵育1小時。在預孵育後，將抗體//bADDL製備物加入到初級神經元培養物中，在37'C再孵育1小時。在孵育期結束時，取出bADDL/抗體混合物，用培養基將板洗6次。然後將細胞在4%多聚甲醛中在室溫固定10分鐘，除去溶液，加入新鮮的固定劑，然後將細胞再固定10分鐘。然後用含有0.1%TRITONX-100的4%多聚甲醛使細胞通透化(2次，每次在室溫進行10分鐘)，在PBS中洗6次，然後用含有10%BSA的PBS在37'C處理1小時。然後在細胞中加入連接有鹼性磷酸酶的鏈親和素(在1%BSA中1:1，500;MolecularProbes,Eugene,OR)，室溫1小時。細胞用PBS清洗6次，將鹼性磷酸酶底物(帶有SAPPHIRE-II的CDP-STAR;Biosystems供應，FosterCity,CA)力口入到細胞中，孵育30分鐘，然後在LJL光度計(AnalystAD;LJLBiosystems,Sunnyvale,CA)上測定發光。在該分析中，發現了Hu20C2A3以亞化學計量的抗體/肽比率有效地抑制了bADDL與神經元的結合(EC5o=0.16;圖9)。抑制bADDL結合表明Hu20C2A3以生物學相關的方式與ADDL相互作用。為了證實Hu20C2A3與ADDL的相互作用與人類阿茨海默氏病病症有關，評估了生物素化Hu20C2A3對人類阿茨海默氏病腦組45織中含有Ap的斑塊的免疫標記能力。免疫組化定位顯示出在人類阿茨海默氏病腦組織中，在緻密核心和彌散斑塊中都有A卩的顯著標記。在與增加的ADDL:抗體量進行預孵育後，免疫反應性降低了，這證實了這種結合的特異性。與Hu20C2相似，Hu20C2A3也有效地標記了緻密核心和彌散的A(3沉積物。實施例8:Hu20C2A3的熱穩定性使用SEG-HPLC、螢光熱熔分析和粒度分析評估了Hu20C2A3的蛋白穩定性評價。螢光熱熔分析表明Fc和Fab的非摺疊轉換分別發生在大約70'C和80°C，這與可接受的內在蛋白穩定性相一致(圖IO)。實施例9:體外藥效動力學和效能分析現有技術指出，全身性注射單克隆抗A(3抗體能夠急劇增加血漿的AP水平，而腦AP的可測量降低需要長期用藥。已經建議用可測量的A(3在物種中進行被動免疫導致血漿A(3的升高，這是由於腦和外周室之間Ap平衡的變化引起的。這種"外周吸入"最終導致了腦AP的降低。但是在動物中，在急性抗體給藥後，在腦A(3明顯變化之前，觀察到了認知的改善，表明腦AP的變化可以以某種形式，在這些變化可以用現有技術測量到的時間點之前發生。或者，血漿AP的升高也可以用抗體給藥後外周A卩的穩定化來解釋。無論如何解釋，在動物模型中已經確立，早期的血漿水平升高是隨後腦A(J降低的先決條件。因此，Hu20C2A3抗體對血槳AP升高的影響被用作靶銜接的指標。在靜脈輸注劑量為30、100和300(ig/小鼠的Hu20C2A3後，相對於無關抗體(8B4)對照組來說，注射後4小時觀察到了明顯和強烈的血漿A(3x-40的增加(圖11)。對於CHO來源的材料來說，觀察到的血漿A(3x-40的增加是8B4水平的491%(30(ig，p>0.001)、826%(10Qng，pO.OOl)和755%(30Q(ig，pO.OOl)。類似地，對於畢赤氏酵母來源的材料來說，血漿APx-40的增加是8B4水平的395%(30|ag，p>0.001)、729%(lOQjig，p<0.001)禾口838%(30一，pO,OOl)。權利要求1.分離抗體或其片段，能夠差異性識別一種或多種Aβ衍生的可擴散配體的多維構象，其中所述抗體包含互補決定區(CDR)Arg-Xaa1-Leu-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQIDNO9)，其中Xaa1是Gln或Ala，Xaa2是Ser或Gly，Xaa3是Pro、Ala、Lys、Arg或Thr，Xaa4是Lys或Arg，Xaa5是Gly、Ser或Lys，Xaa6是Val、Thr，Ile或Arg。全文摘要本發明涉及差異性識別被稱為ADDL的Aβ衍生的可擴散配體的多維構象的抗體。本發明的抗體能夠區分阿茨海默氏病和對照的人腦提取物，可用於檢測ADDL和診斷阿茨海默氏病的方法中。本抗體也阻斷ADDL與神經元的結合、ADDL的組裝、以及τ磷酸化，可用於預防和治療與澱粉樣肽β1-42的可溶性寡聚體有關的疾病的方法中。文檔編號A61K39/395GK101291692SQ200680039263公開日2008年10月22日申請日期2006年10月17日優先權日2005年10月21日發明者吉恩·金尼,威廉·R·斯特羅爾,安志強申請人:默克製藥公司