一種誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法

2023-10-06 19:58:09

專利名稱：一種誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法
技術領域：
本發明涉及桉樹的組織培養技術領域域，尤其是指一種誘導桉樹產生愈傷組織並 分化出芽的方法。
背景技術：
桉樹是桃金孃科Myrtaceae桉屬Eucalyptus植物的統稱。多數桉樹為常綠高大 喬木，而少數為小喬木或灌木。桉樹分布於熱帶與亞熱帶地區，屬於喜光植物，而且根系粗 壯發達。桉樹具有速生，豐產，適應性強，生產周期短，用途廣等特點，是可作為紙漿材料的 主要的速生栽培樹種之一。桉樹目前已被多個國家和地區廣泛種植，桉樹人工林面積約佔 世界人工林總面積的三分之一。桉樹除作為紙漿材和纖維板材的用途之外，還可以作為提 取單寧和精油的原料，因此具有廣泛的開發利用價值。經過多年組織培養和扦插等無性系育苗的研究，以及雜交育種和選優等傳統選種 育種工作，目前生產上廣泛使用的就是巨桉和尾葉桉的雜交品種，例如DH32-29，廣林九號 及其它優良無性系。由於林木生長周期長，遺傳雜和性高，許多性狀屬於多基因控制的數量性狀，常規 的育種手段難以滿足定向培育桉樹新品種的要求。因此人們希望利用新興的基因工程技術 來解決桉樹常規育種難以解決的問題，定向地培育出經濟價值高的性狀。基因工程育種是 以現代分子生物學技術為基礎，將目的基因通過體外重組導入受體細胞，然後再生出完整 植株以培育出新桉樹品種的一種技術手段。它具有高效性和針對性，可彌補常規育種技術 的不足，加速優質，高價值桉樹新品種的選育。目前利用植物轉基因技術存在幾個問題一是轉化效率偏低；二是主要轉化技術 限於赤桉、巨桉等品種，在其他桉樹品種中報導很少；三是大部分成功再生的實驗材料是以 種子為基礎，種子變異大，難以應用於無性系的桉樹雜交種。由於廣泛栽培的DH32-29、廣林 九號等優良無性系通過葉盤和莖段愈傷組織的再生效率極低，難以獲得較多數量的獨立轉 化植株從而篩選出外源基因表達良好的株系，轉基因育種的發展收到極大地限制。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種誘導桉樹產生愈傷組織並分化出的方 法，解決現有桉樹愈傷分化出芽的轉化率低，不能對雜交種進行愈傷分化出芽，從而限制基 因育種等問題。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案一種誘導桉樹產生愈傷組織並 分化出芽的方法，包括以下步驟
1)採集腋芽，進行消毒及萌芽；
2)生根誘導和白化苗誘導培養；
3)以白化苗的莖段切段為外植體進行誘導培養獲得愈傷組織，該愈傷誘導培養基含有 多胺；4)將產生的愈傷組織分化出不定芽。所述第1步驟是採集2-4年生桉樹雜交品種的帶腋芽莖段，經消毒處理後接種在 MS培養基上萌發得到無菌芽；萌芽的培養條件是溫度22-30°C，無光照；所述消毒的方法 是採用酒精和升汞消毒，並用無菌水衝洗。第2步驟具體包括以下步驟
a)將第(1)步驟獲得腋芽萌發芽轉移到含0.l-2mg/L細胞分裂素，0. 01-lmg/L生長素 的MS培養基上誘導產生叢生芽；
b)叢生芽中的健壯芽叢轉移到含0.1-lmg/L生長素的1/2MS培養基上誘導產生生根
苗；
c)將生根苗切掉頂芽，接種在含蔗糖30-100g/L、NH4NO31650_6000mg/L、KH2PO4 170-800mg/L的MS培養基上，在黑暗中進行白化苗誘導培養。優選地，第2步驟具體包括
a)切取一定長度的腋芽，轉移到含0.l-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 01-lmg/L萘乙酸的MS 培養基上，培養21-28天，光照12-18小時/天，光照強度1500-100001x，溫度22-30°C ；
b)切取生長至一定長度的芽，轉移到含0.1-lmg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培養基上進行 生根誘導15-30天，光照12-18小時/天，光照強度1500-100001x，溫度22-30°C ；
c)將生根苗切掉頂芽，保留根和基部的若干個腋芽，接種在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培養基上進行白化苗誘導培養，暗培養14-35天，溫度 22-30 "C。第3步驟中，愈傷誘導培養基優選是含50-200mg/L腐胺、5_30mg/L亞精胺的MS培養基。第3步驟中，愈傷誘導培養基進一步包含0. 2-2mg/L細胞分裂素、0. 01-0. lmg/L 生長素。優選地，第3步驟具體包括
a)以白化苗的莖段切段為外植體，接種在含0.05-0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 1-0. 5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培養基上進行細胞活化培養，暗培養0_6天，溫度22-30°C;
b)活化後的外植體轉移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，0. 01-0. Img/ L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5_30mg/L亞精胺的MS培養基上培養產生愈傷組織，暗培養5-7 天，溫度22-30 0C ；
c)轉移到弱光照培養12-14天，光照12-18小時/天，光照強度20-2001X，22-30°C。所述第4步驟是將第(3)步驟產生的愈傷組織轉移到分化培養基上培養，使愈傷 組織分化不定芽，所述的分化培養基是含有多胺的MS培養基。其中，第4步驟的分化培養基進一步包含0.2-2mg/L細胞分裂素，0. 05_0. 5mg/L 生長素。優選地，所述第4步驟具體包括
a)將獲得的愈傷組織，轉移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/L萘乙酸， 10-40mg/L腐胺，0. 5-3mg/L亞精胺的MS培養基上，每隔14-25天轉移到相同的分化培養基 上繼代培養，光照12-18小時/天，光照強度500-30001χ，溫度22_30°C ；
b)在分化培養基上繼代培養14-100天產生不定芽。
本發明的有益效果如下本發明利用白化苗的莖段，經愈傷組織再生途徑分化出 芽，愈傷組織再生途徑可以用於目的基因導入受體細胞等基因工程，是轉基因的基礎。而 且，本發明建立的誘導桉樹雜交種產生愈傷組織並分化出芽的方法，以林場中生長的無性 系成年桉樹的萌芽條為基礎，再生系統的再生效率達30%以上，可以應用於DH32-29、廣林 九號及其它優良無性系，為利用現代生物技術對桉樹的遺傳改良奠定了良好的基礎，具有 十分重要的經濟價值。
具體實施例方式本發明公開了一種誘導桉樹雜交種產生愈傷組織並分化出芽的方法，包括以下步 驟
(1)採集腋芽，進行消毒及萌芽；
(2)生根誘導和白化苗誘導培養；
(3)愈傷組織的誘導；
(4)分化出不定芽。第(1)步驟中，採集2-4年生雜交桉樹新生的萌芽條，優選採集腋芽開始膨大，芽 鱗片尚未開裂的萌芽條，切成1. 5-2. Ocm長的帶腋芽的莖段，經消毒處理後接種在MS培養 基上萌發，得到無菌芽。莖段的消毒方法是
(a)75%乙醇浸泡20秒；
(b)無菌水衝洗2次；
(c)0.1%升汞浸泡5分鐘；
(d)倒出升汞，用無菌水衝洗4-6次；
(e)修剪成0.5-1. Ocm長的帶腋芽的莖段；
(f)0.1%升汞浸泡2分鐘；
(g)倒出升汞，用無菌水衝洗4-6次；
(h)接好的材料暗培養21-28天。萌芽用的培養基是，MS基本培養基含30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及pH5. 8。萌芽的培養條件是，溫度22_30°C，無光照。第(2)步驟中，進一步包括以下培養步驟
(a)切取1.0cm長的腋芽，轉移到含0.l_2mg/L細胞分裂素如6-苄基嘌呤，0. Ol-Img/ L生長素如萘乙酸的MS培養基上，培養21-28天，光照12-18小時/天，光照強度 1500-100001x，溫度 22-30°C ；
(b)切取生長至1.5cm長的芽，轉移到含0. 1-lmg/L生長素如3-吲哚丁酸的V2MS 培養基上進行生根誘導15-30天，光照12-18小時/天，光照強度1500-100001X，溫度 22-30 0C ；
(c)將生根苗切掉頂芽，保留根和基部的1-4個腋芽，接種在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 1650-6000mg/L,KH2PO4 170_800mg/L的MS培養基上進行白化苗誘導培養，暗培養14-35天， 溫度 22-30°C，該 MS 誘導培養基優選含 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L。其中第(3)步驟進一步包含以下步驟(a)以白化苗的3-10mm的莖段切段為外植體，接種在含0.05-0.3mg/L生長素如 2，4-二氯苯氧乙酸，0. 1-0. 5mg/L細胞分裂素如6-苄基嘌呤的MS培養基上進行細胞活化 培養，暗培養0-6天，溫度22-30°C ；
(b)活化後的外植體轉移到含0.2-2mg/L細胞分裂素如N-苯基_N_1，2，3-噻二 唑-5-脲，0. 01-0. lmg/L生長素如萘乙酸，多胺如50_200mg/L腐胺、5_30mg/L亞精胺的MS 培養基上培養產生愈傷組織，暗培養5-7天，溫度22-30°C ；
(c)轉移到弱光照培養12-14天，光照12-18小時/天，光照強度20-2001X，22-30°C。在該步驟中，以白化苗的不帶芽原基的莖段進行培養，使分化的體細胞經活化及 脫分化形成愈傷組織。而第(4 )步驟進一步包括
(a)將獲得的愈傷組織，轉移到含0.2-2mg/L細胞分裂素如6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/ L生長素如萘乙酸，多胺如10-40mg/L腐胺、0. 5_3mg/L亞精胺的MS培養基上，每隔14-25 天轉移到相同的分化培養基上繼代培養。再分化培養的條件為光照12-18小時/天，光照 強度 500-30001x，溫度 22-30 0C ；
(b)在分化培養基上繼代培養14-100天產生不定芽。本發明的方法，主要利用白化苗的莖段，經愈傷組織再生途徑分化出芽，其中再生 途徑包含由分化的體細胞經脫分化形成愈傷組織，然後再分化形成芽。該愈傷組織經再生 途徑可以用於將目的基因導入受體細胞，然後再生出完整植株，從而可實現對桉樹，特別是 對雜交品種的桉樹，如DH32-29、廣林九號及其它優良無性系，進行定向的遺傳改良。下面結合實例詳述描述本發明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的， 不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護範圍。實例1 結合表1所示愈傷組織分化率，本例中誘導桉樹莖段產生愈傷組織並分化 出芽的方法，具體包括以下步驟
首先，選取DH32-29的3年生植株，砍掉樹冠部分，保留1_1. 5m高的樹樁。1個月後採 集新生的萌芽條，切成2. Ocm長的帶腋芽的莖段，70%乙醇中浸泡20秒，無菌水衝洗2次， 然後在0. 1%氯化汞中消毒5分鐘，無菌水衝洗4次，修剪成1. Ocm長的帶腋芽的莖段，再於 0. 1%氯化汞中消毒2分鐘，無菌水衝洗6次。晾乾後接種在MS培養基中，每瓶接1-2顆， 25°C暗培養28天，得到萌發的腋芽。第二步，切取1.0cm長的腋芽，轉移到含0. lmg/L 6_苄基嘌呤，0. 01mg/L萘乙酸 的MS培養基上，每隔23天轉移到相同的培養基上繼代培養，光照16小時/天，光照強度 30001x，溫度 25 0C ο第三步，切取生長至1. 5cm長的芽，轉移到含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的1/2MS培養 基上進行生根誘導20天，光照16小時/天，光照強度30001x，溫度25°C。第四步，將生根苗切掉頂芽，保留根和基部的2個腋芽，接種在含蔗糖70g/L、 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培養基上進行白化苗誘導培養，暗培養23天，溫度 25 °C，從而獲得白化苗。第五步，以白化苗的5mm的莖段切段為外植體，本實例中共505塊外植體，接種在 含0. lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，0. 25mg/L6-苄基嘌呤的MS培養基上，暗培養5天，溫度 25°C，從而活化體細胞。
第六步，轉移到含0. 7mg/L N-苯基-N-1，2，3_噻二唑_5_脲，0. 02mg/L萘乙酸， 80mg/L腐胺，15mg/L亞精胺的MS培養基上，暗培養5天，溫度25 °C。第七步，轉移到弱光照培養14天，光照16小時/天，光照強度501x，溫度25°C，從 而獲得脫分化的愈傷組織共505塊。第八步，將獲得的愈傷組織，轉移到含0. 5mg/L 6_苄基嘌呤，0. lmg/L萘乙酸， 15mg/L腐胺，1. 5mg/L亞精胺的MS培養基上，每隔21天轉移到相同的分化培養基上繼代培 養，光照16小時/天，光照強度15001x，溫度25°C。最後，在分化培養基上繼代培養40天產生不定芽，共184塊。具體見表1
表1本發明實例中的愈傷組織分化率
本實例中，愈傷組織再生系統的再生效率達36. 4%。實例2 結合表2所示愈傷組織分化率，本例中誘導桉樹莖段產生愈傷組織並分 化出芽的方法，具體包括以下步驟
首先，選取廣林九號的3年生植株，砍掉樹冠部分，保留1-1. 5m高的樹樁。1個月後採 集新生的萌芽條，切成2. Ocm長的帶腋芽的莖段，70%乙醇中浸泡20秒，無菌水衝洗2次， 然後在0. 1%氯化汞中消毒5分鐘，無菌水衝洗4次，修剪成1. Ocm長的帶腋芽的莖段，再於 0. 1%氯化汞中消毒2分鐘，無菌水衝洗6次。晾乾後接種在MS培養基中，每瓶接1-2顆， 25°C暗培養28天，得到萌發的腋芽。第二步，切取1.0cm長的腋芽，轉移到含0. lmg/L 6_苄基嘌呤，0. 01mg/L萘乙酸 的MS培養基上，每隔23天轉移到相同的培養基上繼代培養，光照16小時/天，光照強度 30001x，溫度 25 0C ο第三步，切取生長至1. 5cm長的芽，轉移到含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的V2MS培養 基上進行生根誘導30天，光照16小時/天，光照強度30001x，溫度25°C。第四步，將生根苗切掉頂芽，保留根和基部的2個腋芽，接種在含蔗糖50g/L、 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培養基上進行白化苗誘導培養，暗培養30天，溫度 25 °C。第五步，以白化苗的4mm的莖段切段為外植體共321塊，接種在含0. lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，0. 25mg/L 6-苄基嘌呤的MS培養基上，暗培養6天，溫度25°C。第六步，轉移到含0. 7mg/L N-苯基-N-1，2，3_噻二唑_5_脲，0. 02mg/L萘乙酸， 80mg/L腐胺，15mg/L亞精胺的MS培養基上，暗培養5天，溫度25 °C。第七步，轉移到弱光照培養14天，光照16小時/天，光照強度501x，溫度25°C。第八步，將獲得的愈傷組織共321塊，轉移到含0. 5mg/L 6_苄基嘌呤，0. lmg/L萘 乙酸，15mg/L腐胺，1. 5mg/L亞精胺的MS培養基上，每隔21天轉移到相同的分化培養基上 繼代培養，光照16小時/天，光照強度15001x，溫度25°C。最後，在分化培養基上繼代培養30天產生不定芽，共136塊。具體見表2
表2本發明實例中的愈傷組織分化率
本實例中，愈傷組織再生系統的再生效率達42. 4%。
實例3 結合表3所示愈傷組織分化率，本例中誘導桉樹莖段產生愈傷組織並分化 出芽的方法，選取按傳統方法自行育種的一種巨桉和尾葉桉雜交種的2年生植株，其餘步 驟和實例1相同。本例中，含有分化的體細胞的白化苗莖段外植體共396塊，經脫分化形成 愈傷組織396塊，然後愈傷組織再分化出不定芽，共148塊。具體見表3 表3本發明實例中的愈傷組織分化率
本實例中，該再生系統的再生效率達37. 4%。
由上述實例可見，本發明利用白化苗的莖段，經愈傷組織再生途徑分化出芽，再生 率在30%以上。相應地，本發明的愈傷組織經共培養導入目的基因，再分化成芽，轉基因愈 傷組織的再生率也可達30%以上，從而能實現對桉樹，特別是雜交品種的的桉樹進行遺傳 改造。
權利要求
一種誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，包括以下步驟1)採集腋芽，進行消毒及萌芽；2)生根誘導和白化苗誘導培養；3)以白化苗的莖段切段為外植體進行誘導培養獲得愈傷組織，該愈傷誘導培養基含有多胺；4)將產生的愈傷組織分化出不定芽。
2.如權利要求1所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第1步驟是採集2-4年生桉樹雜交品種的帶腋芽莖段，經消毒處理後接種在MS培養基上萌 發得到無菌芽；萌芽的培養條件是溫度22-30°C，無光照；所述消毒的方法是採用酒精和 升汞消毒，再用無菌水衝洗。
3.如權利要求1所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於第2 步驟包括a)將第1步驟獲得腋芽萌發芽轉移到含0.l-2mg/L細胞分裂素，0. 01-lmg/L生長素的 MS培養基上誘導產生叢生芽；b)叢生芽中的健壯芽叢轉移到含0.1-lmg/L生長素的1/2MS培養基上誘導產生生根苗；c)將生根苗切掉頂芽，接種在含蔗糖30-100g/L、NH4NO31650_6000mg/L、KH2PO4 170-800mg/L的MS培養基上，在黑暗中進行白化苗誘導培養。
4.如權利要求3所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於第2 步驟具體包括a)切取一定長度的腋芽，轉移到含0.l-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 01-lmg/L萘乙酸的MS 培養基上，培養21-28天，光照12-18小時/天，光照強度1500-100001x，溫度22-30°C ；b)切取生長至一定長度的芽，轉移到含0.1-lmg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培養基上進行 生根誘導15-30天，光照12-18小時/天，光照強度1500-100001x，溫度22-30°C ；c)將生根苗切掉頂芽，保留根和基部的若干個腋芽，接種在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培養基上進行白化苗誘導培養，暗培養14-35天，溫度 22-30 "C。
5.如權利要求1所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第3步驟中，愈傷誘導培養基是含50-200mg/L腐胺、5_30mg/L亞精胺的MS培養基。
6.如權利要求5所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第3步驟中，愈傷誘導培養基進一步包含0.2-2mg/L細胞分裂素、0. 01_0. lmg/L生長素。
7.如權利要求6所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第3步驟具體包括a)以白化苗的莖段切段為外植體，接種在含0.05-0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 1-0. 5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培養基上進行細胞活化培養，暗培養0_6天，溫度22-30°C;b)活化後的外植體轉移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，0. 01-0. Img/ L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5_30mg/L亞精胺的MS培養基上培養產生愈傷組織，暗培養5-7 天，溫度22-30 0C ；c)轉移到弱光照培養12-14天，光照12-18小時/天，光照強度20-2001X，22-30°C。
8.如權利要求1所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第4步驟是將第3步驟產生的愈傷組織轉移到分化培養基上培養，使愈傷組織分化不定芽， 所述的分化培養基是含有多胺的MS培養基。
9.如權利要求8所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第4步驟的分化培養基進一步包含0. 2-2mg/L細胞分裂素、0. 05-0. 5mg/L生長素。
10.如權利要求9所述的誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述 第4步驟具體包括a)將獲得的愈傷組織，轉移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/L萘乙酸， 10-40mg/L腐胺，0. 5-3mg/L亞精胺的MS培養基上，每隔14-25天轉移到相同的分化培養基 上繼代培養，光照12-18小時/天，光照強度500-30001χ，溫度22_30°C ；b)在分化培養基上繼代培養14-100天產生不定芽。
全文摘要
本發明涉及一種誘導桉樹產生愈傷組織並分化出芽的方法，包括以下步驟採集腋芽，進行消毒及萌芽；生根誘導和白化苗誘導培養；以白化苗的莖段切段為外植體進行誘導培養獲得愈傷組織，該愈傷誘導培養基含有多胺；以及，將產生的愈傷組織分化出不定芽。本發明利用白化苗的莖段經愈傷組織再生途徑分化出芽，愈傷組織再生途徑可以用於目的基因導入受體細胞等基因工程，是轉基因的基礎。而且，以林場中生長的無性系成年桉樹的萌芽條為基礎，再生系統的再生效率達30%以上，可以應用於DH32-29、廣林九號及其它優良無性系，為利用現代生物技術對桉樹的遺傳改良奠定了良好的基礎，具有十分重要的經濟價值。
文檔編號A01H4/00GK101897298SQ201010249030
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月10日 優先權日2010年8月10日
發明者孟麗娜, 張蘭英, 李凝, 李 浩, 江淑珍, 王利芳, 陳方 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司