一步誘導棗葉片體細胞胚胎的方法

2023-10-06 20:04:59 1

專利名稱：一步誘導棗葉片體細胞胚胎的方法
技術領域：
本發明涉及一種一步誘導棗葉片體細胞胚胎的方法。
技術背景植物體細胞胚發生是指體細胞或生殖細胞在特定條件下，未經性細胞融合而通過與合子 胚發生相類似的途徑發育成新個體的形態發生過程。由於它是從體細胞分化而來，故稱為體 細胞胚胎或胚狀體。對體細胞胚胎發生機制的探討源於1902年Haberlandt提出的植物細胞全 能性假說，對體細胞胚胎的真正認識是從1958年Steward等利用胡蘿蔔根進行單細胞懸浮培 養，產生與合子胚相似的結構，並長成完整植株開始的。通過體細胞胚胎發生途徑形成再生 植株在高等植物中己經證明是普遍的現象，國內外在裸子植物、雙子葉植物、單子葉植物重 要科的代表植物中多有報導，己有300多種植物獲得過體細胞胚胎。目前，大部分研究資料 來源於草本植物，在部分木本植物上也有報導，如針葉樹、樺樹等。在果樹上已有28科，43 屬，93種(雜種)獲得了體細胞胚。關於棗體細胞胚胎途徑誘導再生植株的報導較少，且多以幼胚或子葉為外植體。如最早 陳維倫等利用酸棗幼胚的子葉獲得胚狀體，以後李登科等，程佑發等，郝建平等也是利用幼 胚和子葉為外植體獲得胚狀體。到目前為止，以棗離體葉片為外植體進行培養均以不定芽方 式再生，通過體細胞胚胎途徑還未見報導。本研究旨在以冬棗離體葉片為外植體進行體細胞 胚胎誘導，為建立高效穩定的葉片體細胞胚發生系統奠定堅實基礎，這對於利用葉片進行基 因工程、遺傳轉化、品種改良等方面的研究都具有十分重要的意義。 發明內容本發明建立了棗離體葉片體細胞胚胎誘導技術體系，能保證高效率的獲得冬棗葉片的體 細胞胚胎，為深入開展棗的基因工程、遺傳轉化、品種改良等方面的研究提供了一種新的技 術平臺。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是首先採用合適的離體葉片剪切方法，再對 外植體進行體細胞胚胎的誘導，通過不同培養基成分、不同植物生長調節劑、不同培養環境 的調控，篩選出冬棗葉片體細胞胚胎誘導的適宜培養基，獲得冬麥離體葉片體細胞胚胎。本發明的具體內容，即離體誘導冬棗葉片體細胞胚胎的方法如下外植體選擇與預處理選取苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，接種在MS+麥芽糖15 25 g/L+瓊月旨3 5 g/L+TDZ 5.0~10.0 mg/L+AgNO31.0~2.0 mg/L的固體培養基上進行暗培養，培養基pH值控制在5.0 6.0左右，環境溫度在25 3(TC條件下，能夠誘導出葉片體細胞胚胎。培養條件基本培養基為MS培養基，麥芽糖1.5-2.5%,瓊脂0.3%~0.5%，培養基滅菌 前pH為5.0 6.0。黑暗環境，溫度控制在25 30。C。外植體接種方法選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，用已滅菌剪刀垂 直葉脈剪切數刀，然後正面向上接種於誘導培養基上。誘導培養將剪切好的葉片接種到MS +麥芽糖15~25g/L +瓊脂3.0~5.0 g/L+TDZ 5.0~10.0 mg/L + AgN031.0-2.0 mg/L的固體培養基上進行暗培養。誘導15-20天時產生大量淡黃色塊 狀的愈傷組織，誘導20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。本發明專利的有益效果是，通過對冬棗葉片外植體適宜的剪切方法，然後接種到誘導培 養基上，不經轉換培養基即可獲得冬棗葉片體細胞胚胎，首次實現了棗離體葉片的體細胞胚 胎再生，並在棗葉片體細胞胚胎發生過程中，將非胚性愈傷誘導、胚性愈傷誘導、體胚分化 三個步驟合為一步，即在同一種培養基上實現了愈傷組織和胚狀體分化，利用此方法不僅簡 化了試驗步驟、不需要多次更換培養基、節省了人力物力，而且與分步誘導相比縮短了誘導 時間。因此，本研究建立的葉片體胚發生體系對棗再生體系的研究具有重要指導意義。


圖1是冬棗葉片初始接種狀態。圖2是冬棗葉片在誘導培養基中暗培養15~20天時產生淡黃色塊狀的愈傷組織。圖3是冬棗葉片在誘導培養基中暗培養25~35天時從塊狀愈傷組織表面逐漸分化出胚狀體。圖4是冬棗葉片分化出的球形胚。 圖5是冬棗葉片分化出的心形胚。 圖6是冬棗葉片分化出的子葉胚。
具體實施方式
選取苗齡20天的冬棗組培苗葉片，在無菌操作臺用已滅菌剪刀垂直葉脈剪切數刀，然後 正面向上接種於接種在MS+麥芽糖15~25 g/L+瓊脂3.0-5.0 g/L+TDZ 5.0-10.0 mg/L+AgN03 1.0~2.0 mg/L的固體誘導培養基上進行暗培養，培養基pH值控制在5.0~6.0左右，環境溫度 在25 3(TC條件下，誘導15-20天時產生大量淡黃色塊狀的愈傷組織，誘導20-30天時開始 從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。分化率為84.9%.
權利要求
1.一步誘導棗葉片體細胞胚胎的方法，其特徵在於通過對冬棗葉片進行離體培養，不經過轉換培養基即可一步實現愈傷組織誘導和胚狀體分化。
2. 按照權利要求l所述的方法，其特徵在於包括以下培養步驟(1) 選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，在無菌操作臺用己滅菌剪刀 垂直葉脈剪切數刀。(2) 將經步驟(1)獲得的冬棗離體葉片接種在MS +麥芽糖 15~20g/L+TDZ5.0~10.0mg/L+AgNO31.0~2.0mg/L的培養基上進行暗培養，誘導15-20天時 產生大量透明、淡黃色塊狀的愈傷組織，誘導20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突 起成瘤狀，逐漸分化出胚狀體。
3. 按照權利要求l所述的方法，其特徵在於基本培養基為MS、含麥芽糖15~25g/L、 瓊脂3 5g/L、 TDZ5.0~10.0mg/L、 AgNO31.0 2.0mg/L，培養基滅菌前pH為5.5~6.0，培養 溫度控制在25 35。C。
全文摘要
一步誘導棗葉片體細胞胚胎的方法，即通過冬棗葉片的組織培養獲得其體細胞胚胎，包括外植體選擇、剪切、離體培養，葉片愈傷組織胚狀體分化率達84.9％。選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，用已滅菌剪刀垂直葉脈剪切數刀。然後正面向上接種於誘導培養基(MS+麥芽糖15～25g/L+瓊脂3.0～5.0g/L+TDZ 5.0～10.0mg/L+AgNO3.0～2.0mg/L)上進行暗培養。誘導15-20天時葉片產生大量淡黃色塊狀的愈傷組織，不經轉換培養基在20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。以上培養基滅菌前pH為5.0～6.0，培養溫度控制在25～30℃。利用該方法，可誘導在20～30天後獲得大量葉片胚狀體，為用於棗葉片的離體再生。
文檔編號A01H4/00GK101248763SQ200810089510
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月3日 優先權日2008年4月3日
發明者麗 代, 劉孟軍, 娜 王, 秦子禹 申請人:河北農業大學