使用與多孔膜偶聯的分析物傳感分子測定分析物濃度的方法

2023-10-07 05:54:49

專利名稱：：使用與多孔膜偶聯的分析物傳感分子測定分析物濃度的方法
技術領域：
：本發明涉及測定樣品中分析物濃度的方法，其依靠檢測分析物和分析物傳感分子之間的複合物，其中所述分析物傳感分子附著到固體多孔支持物上。本發明還涉及測定分析物與分析物傳感分子實時結合動力學的方法，其通過測定分析物與分析物傳感分子的結合效率，其中所述分析物傳感分子附著到固體多孔支持物上。
背景技術：
：分子相互作用的檢測構成了許多診斷測試以及一般測試程序中的核心要素之一。因此，通常通過檢測分析物和分析物傳感分子之間的相互作用測定含有多種組分的樣品中特異分析物的存在，其中已知所述分析物傳感分子僅對該分析物是特異性的。同時，對高通量測試檢驗有濃厚的興趣，其能夠平行地檢測樣品中的多種分析物。使用所謂的微陣列，這種高通量測試是可能的，所述微陣列是已經在多種化學和生物化學應用中使用的微型檢測裝置。最初，開發微陣列技術用於檢測特異性核酸-核酸相互作用。核酸比例如蛋白質和抗體要容易處理得多，這個事實解釋了優先使用微陣列用於檢測基於核酸的相互作用。然而，同時，已經開發了微陣列格式，其也是針對能夠高通量平行測試蛋白質-蛋白質相互作用或者蛋白質-DNA相互作用。在大多數基於微陣列的測試系統中，通常分析物傳感分子(捕獲分子)被固定在陣列上的規定位置處，隨後將陣列與含有待檢測分析物的樣品溫育。在某些處理步驟之後，通過例如使用螢光標記物顯示分析物與各自分析物傳感分子之間的相互作用。通常，微陣列基質使用蓋玻片，因為它們能夠容易固定核苷酸序列。然而，考慮到蛋白質複雜三維構型的確認以及它們變化的疏水或親水特徵，蓋玻片與其他固體基質對於蛋白質固定化不是理想的。通常玻璃載玻片已經被塗覆，以便它們能夠固定核酸和/或蛋白質。此外，分析物傳感蛋白質和分析物之間的有效相互作用受到傳統的微陣列基質的阻礙，因為結合主要依靠在溶液中擴散到陣列的各自點上。為了解決這些問題，最近開發了所謂的流通式(flow-through)微陣列晶片。在這種途徑中，基於DNA或蛋白質的探針被固定在例如化學修飾的多孔矽晶片上，接著與樣品進行溫育。由於基質的多孔特徵，能夠更容易除去多餘的樣品以及任選的清洗溶液。這種流通式裝置的例子被描述在例如國際專利申請WO03/005013中。現有技術同樣仍然主要描述了檢測樣品中分析物存在的方法，沒有關注例如測定樣品中分析物的濃度，或者分析物與分析物傳感分子的結合動力學。發明目的和概述本發明的一個目的是提供測定待測試的樣品中至少一種分析物濃度的方法。本發明的另一個目的是提供一種方法，其能夠測定樣品中分析物與分析物傳感分子之間的實時結合動力學。為了達到上述目的，提供了如在獨立權利要求1中所限定的檢測方法。根據本發明的一個示範性實施方式，提供了檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法，該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物，其上被布置了至少一種分析物傳感分子；b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸；c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物，其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結合的樣品組分；d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與至少一種分析物之間的特異性相互作用；4e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。在本發明的另一個示範性實施方式中，可以隨時間變化測定濃度。在後面的實施方式中，在檢測分析物與分析物傳感分子之間的特異性相互作用時隨時間變化所產生的信號的發展，可以用於測量所述分析物與所述分析物傳感分子的實時結合動力學。根據分析物和分析物傳感分子的性質，該實施方式能夠例如鑑定和辨別化合物庫的小分子與基於治療性蛋白質的耙之間的^口口o在本發明的一個優選實施方式中，固體多孔基質可以是選自包括由例如尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚碸所製成的膜的組的膜。本發明一個特別令人感興趣的方面涉及一種實施方式，其中前面所提到的步驟b)-d)或者這些步驟中的任何步驟被重複多次。此外，上述方法的這種重複操作具有下列優點能夠比使用之前已知的程序更快和更高可靠性地測定分析物分子的濃度。如果以重複方式將本發明的該實施方式用於測定分析物與分析物傳感分子的實時結合動力學，則也具有該優點。本發明的另一個實施方式涉及使用上述的固體多孔基質進行該方法，其中將大量分析物傳感分子以微陣列的形式布置在所述多孔基質上。所述固體多孔基質上已知分析物傳感分子的有序配置以及後續與樣品的溫育能夠平行地測定大量不同分析物的濃度，這進一步有助於本發明方法的速度和效率。同樣，測定實時動力學也一樣。也可以通過重複步驟b)-d)多次以重複的方式-運行本發明的該實施方式。在本發明的某些實施方式中，分析物傳感分子將是基於蛋白質的化合物例如抗體、肽、半抗原、適體、蛋白質或(細胞表面)受體。在本發明的另一個實施方式中，可以使用與至少一種分析物連接和/或與至少一種分析物傳感分子連接的可檢測標記物進行該方法，以檢測分析物與分析物傳感分子之間的相互作用。如果可檢測標記物是例如螢光標記物，則這也會有助於所要求保護的測定樣品中分析物的濃度和/或實時結合動力學的方法的容易、效率和速度。在本發明的一個實施方式中，分析物傳感分子可以通過化學連接劑共價連接到支持物上。圖l顯示印製要求的示意布置圖，用於將抗體印製為分析物傳感分子。將大量不同的抗體印製在硝酸纖維素膜上。將這些抗體通過物理吸附而吸附到膜上。含有Cy5標記的抗體的點作為內部校準標準，並用於固定網格。圖2顯示測量圖1所示意描述的微陣列的校準標準。在剛剛印製之後拍照。可以精細調節軟體的兩個變量以得到最佳的圖像，即電流和閃光長度(flashlength)。在這種情況中，電流是變化的。在50mA的電流下，低濃度的內部校準是不可見的，這說明輸出低信號。然而，當電流提高到127.5mA時，可以見到低濃度的內部校準，這說明該電流是可以使用的。圖3顯示在圖2所描述的微陣列與含有100nM兔抗小鼠Cy5標記的抗體進行溫育的實驗的照片。不同的照片代表經膜循環樣品(1-8次)之後所獲得的信號。圖4涉及與圖2和3相同的實驗。不同的照片代表在循環5、6、7和8之後的信號。圖5涉及與圖2、3和4相同的實驗。上圖顯示在循環8之後沒有清洗微陣列所獲得的信號。下圖顯示相同微陣列在使用PBS.7.4，0.05%吐溫20清洗後的信號。圖6顯示另一個微陣列印製布置圖，其在實驗2中被用於監控抗原C-反應性蛋白(CRP)與腫瘤壞死因子a(TNFa)的結合。圖7顯示在印製捕獲抗體之後實驗2的微陣列。圖8顯示濃度為100nM的所檢測抗原CRP的信號強度。循環數指重複施加"新鮮"鏈黴素標記Cy5。"10+w"代表在最後的循環之後包括清洗步驟。圖9顯示沒有加入抗原的對照的結果。圖10顯示在圖8的基礎上所計算的信噪比。圖11顯示在實驗3中所使用的另一個微陣列印製布置圖。圖12顯示在印製捕獲抗體之後實驗3的微陣列。圖13顯示CRP和標記物Alexa647和Cy5的經標準化的強度。圖14顯示TNFa和標記物Alexa647和Cy5的經標準化的強度。圖15顯示依賴重複循環的CRP動力學檢測。圖16顯示依賴重複循環的TNFa動力學檢測。圖17顯示實驗4的檢測原理。圖18顯示在實驗4中使用的另一個微陣列印製布置圖。圖19顯示實驗4的分析物結合經標準化的信號強度。發明詳述在一個實施方式中，本發明涉及檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法，該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物，其上被布置了至少一種分析物傳感分子；b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸；c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物，其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結合的樣品組分；d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與所述至少一種分析物之間的特異性相互作用；e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。過去，測定樣品中分析物的方法主要針對能夠決定是否在樣品中存在某種化合物。然而，沒有公開下列方法，即結合到固體多孔支持物上的分析物傳感分子與樣品接觸，以檢測分析物傳感分子與樣品中分析物之間的特異性相互作用，以後續使用指示分析傳感分子和分析物之間相互作用的信號，測定樣品中分析物的濃度。可以用於本發明的支持物是固體和多孔的。用於本發明目的術語"多孔"的意思是基質對流體具有充分的可透過性以使流體可以通過所述基質。在優選的實施方式中，基質是多孔的，其能夠通過施加低到中度超壓而使流體從其通過。流體可以包括溶液，分散液，懸浮液，乳化液，體液例如血液、血漿、尿等。流體或流體樣品還可以包括例如來自海洋、湖泊、河流等的環境樣品。為了使得流體能夠通過膜內的孔，為了本發明的目的，術語"多孔"因此通常涉及包含直徑為0.1-lpm0.2-0.8^im、優選0.3-0.7miti和0.4-0.6|am(平均)的孔的基質。特別優選的孔度為0.45jxm。此外，根據本發明，固體多孔基質不僅具有前述功能的孔，而且通常尺寸顯示了孔隙度數值即開孔體積和膜材料之間的比例為20-80%之間。當然，可以用於本發明目的基質是本領域技術人員已知的，本領域技術人員能夠理解其中這些基質可以從聚合物材料、天然或人工纖維、矽樹脂、過濾材料、膜和其複合材料製成。根據本發明的固體多孔基質不可以是由氧化鋁形成。當然，可以將固體支持物製成各種形狀和尺寸，這取決於特定的應用。例子包括平板、薄片、盤、薄膜、線、點等。優選但不是必須的形狀是具有平坦的平面例如優選能夠通過自動診斷系統處理的膜、過濾器或微孔板。優選的實施方式將使用多孔膜作為固體支持物。這些膜可以是由尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚碸所製成的。這些膜可以是根據商品名Protran、Ultrabind、Immunodyne、Hybond和Biodyne通過商業渠道獲得的。可從Pall得到的由尼龍加固的硝酸纖維素構成的Protran膜是特別優選的。尺度可以變化，但是在一個實施方式中，厚度在0.1-15mm之間，在0.2-12mm之間，在0.33-llmm之間，在0.4-10mm之間，在l-10mm之間，在4-9mm之間或大約8mm和/或孔度為0.1-lpm，在0.2和0.8|im之間，0.3和0.7pm之間，以及0.4-0.6^im是優選的。如果膜是例如前述帶負電荷的尼龍膜之一，則也是可以利用的。在本發明中可以使用的分析物傳感分子是能夠以確立功能的方式被布置在固體多孔支持物上，這意味著在被布置在基質上時，分析物傳感分子保持特異地與通常被指定為分析物的靶結構相互作用的能力。如果含有各種分析物的樣品與分析物傳感分子溫育，則優選分析物傳感分子將與分析物相互作用，這是特異性的以便並且因此導致能夠後續被檢測的特異性相互作用。可以用於本發明目的的分析物傳感分子，可以是蛋白質、酶、受體、配體、抗原、半抗原、細胞、細胞片段、小分子、適體和抗體。分析傳感分子不可以是核酸。在優選的實施方式中，本發明的分析物傳感分子是基於蛋白質的分析物傳感分子。這些優選的分析物傳感分子包括蛋白質、受體、抗體等。在一個實施方式中，分析物傳感分子是已知與各自抗原分析物特異性結合的抗體。用作分析物傳感分子的抗體可以是任何來源的，包括小鼠、人、大鼠、雞、綿羊、山羊等，並包括本領域中公知的所有抗體類型例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、F(ab)、camel抗體、納米抗體(nanobodies)等。其中在Harlow禾卩Lane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988(例如第17頁)中可以得到能夠使用的不同類型的抗體的縱覽。另外，可以使用所有類型的抗體亞類例如前面所提到的IgA、IgE、IgM、IgG、IgD等。關於此內容再次參考Harlow和Lane(見上)。通過與支持物的共價或非共價連接，可以分析物傳感分子布置在任何前述固體多孔支持物的至少一部分之上或其內。在優選的實施方式中，將抗體噴墨印刷到硝酸纖維素膜上，並使其進行物理吸附。經印刷的膜乾燥過夜。優選使用PBSpH7.4中的5。/。BSA對經印刷的膜在室溫下進行封閉1小時，接著進行檢驗。支持物和分析物傳感分子之間的共價連接意味著形成化學鍵。為了共價連接的目的，固體多孔支持物可以被官能化，以提供化學官能團，其使得能夠在支持物和分析物傳感分子之間形成化學連接。因此，如果例如抗體被用作分析物傳感分子，並且應當被共價偶聯到膜上，則可以使用提供官能團(例如羧基、氨基、羥基、巰基等)的膜。接著，這些基團可以被直接或者使用連接劑交聯到抗體，其中所述連接劑可以是同雙功能的或異雙功能的。因此，可以激活支持物用於提供與分析物傳感分子的化學連接，通過例如使用聚合物塗覆惰性固體多孔基質，其中所述聚合物具有例如醯基氟官能團。其它共價結合化學物質也是可以利用的，而且不限於酐、環氧化物、醛、醯肼、醯基疊氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、二苯酮、碳化二亞胺、亞氨酯、異硫氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來醯亞胺、甲苯磺酸酯、三氟代9乙垸磺醯氯(tresylchloride)、馬來酸酐和羰基二咪唑。在一個實施方式中，碳化二亞胺官能團可以用於建立固體多孔支持物和分析物傳感分子例如抗體之間的連接。為了該目的，帶負電荷的尼龍膜例如包含COOH基團的BiodyneC膜，可以被連接劑例如EDAC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N，-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽)預處理。接著，這種活性中間物與分析物傳感分子例如抗體的氨基發生反應。通過使用低濃度的EDAC可以發生抗體或蛋白質的連接。典型地，EDAC的這些濃度將在0-25重量％的EDAC之間變化，其中0.5-10重量％、0.5-8重量％、0.5-4重量％、0.5-2重量°/。、特別1重量％是優選的。本領域技術人員能夠完全了解在將分析物傳感分子例如抗體與固體多孔支持物接觸時，以及在將分析物傳感分子例如抗體與樣品接觸時所採用的反應條件。典型的反應條件取決於一定的緩衝液、溫度、pH條件等。然而，這些條件將取決於樣品、分析物和分析物傳感分子的類型，以及取決於在分析物傳感分子與固體支持物的共價連接情況中所使用的化學官能團，並且通常可以從文獻中知道，或者由例如化學交聯劑的製造商提供。在本發明的一個實施方式中，可以使用這樣一種支持物進行該方法，該支持物僅包含均勻分布在至少一部分支持物上或其內的一類分析物傳感分子。然而，在本發明特別優選的另一個實施方式中，使用這樣一種支持物進行該方法，其中以建立通常被稱作"陣列"的支持物樣式的空間有序和隔離的模式，將分析物傳感分子分布在至少一部分固體支持物基質之上或其內。通過以陣列的形式，將分析物傳感分子布置在支持物上的一個優點是可以將不同類型的分析物傳感分子以及地不同的己知方向和分布布置在陣列上。這種方向將允許平行檢測樣品中的多種分析物。典型的，這些陣列是由點構成的，點代表特異的分析物傳感分子。由於點中分析物傳感分子的特性是已知的，所以能夠建立複雜的陣列。根據工業標準，陣列格式將具有密度，意味著點的數量範圍是10-100000、50-50000、100-10000，或者點的數量是1000、2000、3000、4000、或5000。當然，本領域技術人員能夠完全理解對於陣列的某個點，可以在其上布置固定數目的分析物傳感分子。因此，根據本發明可以提供微陣列形式的固體多孔支持物，其中微陣列的點各自包含不同量的分析物傳感分子。如果該方法用於測定分析物與分析物傳感分子實時動力學行為的結合，則提供其點包含不同量的各種分析物傳感分子的微陣列可以是特別感興趣的(同樣參見下面)。因此，陣列是分析物傳感分子的排列，特別是在固體多孔基質上可設定地址的位置上的生物大分子例如多肽和抗體。微陣列，是被微型化的陣列，以便需要最少量的分析物傳感分子和樣品進行評估。在陣列內，每個陣列分子都是可設定地址的，在陣列表面的至少兩個維度內能夠被可靠地和始終如一地測定。因此，在有序的陣列中，每個分析物傳感分子的位置在被點在陣列表面時，被分配給分析物傳感分子，並通常是對應每個位置所提供的鑰匙。通常有序的陣列被排列成對稱的網格模式，但是樣品可以以其他模式進行排列(例如以放射狀分布的線或有序的束)。分析傳感分子或"點"的應用形狀本質上對於本發明的性質是不重要的。因此，分析物傳感分子的微陣列通常是指局部沉積分析物靶向多肽，並且不限於圓形或基本上圓形的區域。例如，本發明的陣列可以使用基本上正方形的多肽區域，以及可以是基本上長方形(例如狹縫印跡應用)或者三角形、橢圓形或不規則的。點本身的尺寸(將整個點圍繞於其內的圓形面積的直徑)對於本發明是不重要的，儘管通常在0.1mm-0.5mm之間。陣列本身的形狀對於本發明也是不重要的，儘管通常是基本平面的，並且整體形狀可以是長方形或正方形的。微陣列的製備是指不同組分析物傳感分子以大約0.05mm-大約10mm之間或更多，優選大約0.1mm-lmm之間的點與點之間(中心與中心間隔)排列。可以用於本發明的陣列儀(Arrayer)也稱為陣列點樣儀(arrayspotter)是目前可以從不同公司獲得的。根據不同點樣技術，它們可以被分成接觸式和非接觸式(噴墨)陣列儀。接觸式陣列儀包括Affymetrix,AmershamiiPharmacia,BioRobot〖cs和GeneMachine所製造的，例如使用筆頭在筆頭接觸基質時分配樣品。PackardBioscience(目前是PerkinElmer)所製造的BioChipArrayer代表的非接觸式陣列儀採用壓電晶體控制頭在基質之上大約400pm分配預先吸取的樣品。本發明使用陣列的實施方式的優點是可以開發微型支持物平臺，其能夠使用較小的尺寸樣品和反應體積，這實現了規模經濟並節省時間。另外，這些分析儀能夠達到與傳統微陣列模式相當或更大的靈敏度。為本發明目的，術語"分析物"涉及被前述分析物傳感分子所特異識別的分子。因此，分析物可以選自包括蛋白質、抗原、半抗原、小分子、脂質等所組成的組。最優選的，分析物是蛋白質或各種蛋白質的組合。如上所述，將固體多孔支持物與至少一種樣品接觸可以通過將含有分析物的樣品與固體支持物在典型的溫度和條件下進行溫育，其中在所述支持物上優選被以微陣列的形式布置分析物傳感分子。正如上面所提出的，期望人們任選地使用溶液清洗支持物，該溶液能夠除去未與支持物和/或分析物傳感分子特異性結合的樣品組分。公知的是，在分析物例如蛋白質檢測過程中，待測試的樣品組分與檢測裝置可能發生非特異性結合。這種非特異性結合可能發生於支持物和/或分析物傳感分子。在本發明的一個實施方式中，人們可以通過在將檢測裝置與樣品接觸後，使用所謂用於除去非特異性結合組分的清洗溶液除去非特異性結合的組分，而解決這種非特異性結合。此外，本發明的發明人發現在本發明的一個實施方式中，期望使用能夠降低和/或除去和/或防止與支持物和/或分析物傳感分子非特異性結合的溶液或液體處理支持物。通常將這類溶液或液體稱作封閉溶液。能夠降低和/或防止樣品組分與前述支持物組分非特異性結合的封閉組分通常依賴支持物和/或分析物傳感分子的性質和量。封閉組分可以包括去汙劑例如SDS、TritonX100、TritonX80、NP-40、吐溫-80、吐溫20等。在另一個實施方式中，封閉溶液的封閉組分可以是BSA、FSA、HSA、酪蛋白或Fc尾。當然，也可以使用上述封閉劑的組合。後者封閉組分即BSA、HAS、FSA，特別是酪蛋白是優選的。通常，以溶液或液體例如封閉緩衝液的形式施加封閉溶液。例如封閉緩衝液的其他封閉組分可以是鹽、酸等，這依賴具體的應用。典型的封閉緩衝液將是PBSpH7.4，其含有任何前述組分濃度為1重量％、2重量％、3重量%、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量%，最高達到15。/。或20重量。/。的BSA、FSA、HAS或酪蛋白。如果組分例如酪蛋白、BSA、HAS被用作封閉溶液中的組分時，通常它們的濃度將在1%和15%之間，2%和10%之間，優選5%和10%之間。這些濃度是以重量百分比表示的。封閉的時間點可以不同。因此，在分析物傳感分子例如抗體結合支持物之前，支持物例如膜可以被預先封閉。支持物也可以在分析物傳感分子已經偶聯或布置在膜上之後被封閉。優選期望如果分析物傳感抗體被吸附到膜例如上述尼龍膜上。在將樣品和檢測裝置接觸使得樣品中的至少一種分析物與支持物上的分析物傳感分子特異性相互反應之後，可以任選地包括上述所謂的清洗步驟，該步驟的目的是除去和/或降低分析物樣品的非特異性結合組分，所述組分與基質和/或分析物傳感分子非特異性結合。在該清洗步驟之後，或者如果省去清洗步驟，將發生對分析物傳感分子和至少一種樣品的分析物之間特異性相互作用的檢測。上面對步驟d)已經提出在使支持物與樣品接觸後，分析物傳感分子和分析物之間的特異性相互作用將可以被檢測。有各種手段檢測樣品中分析物與分析物傳感分子之間的特異性相互作用。其例子是作為分析物傳感分子的抗體和樣品的組分例如蛋白質或被抗體特異性識別的典型化學化合物之間相互作用。然而，這些解釋並不以任何方式被本發明的這些示範性實施方式所限制。檢測分析物傳感分子例如抗體與分析物之間的相互作用，可以通過使用可檢測標記物修飾分析物而發生。使用可檢測標記物修飾分析物可以發生在檢測裝置和樣品接觸之前，檢測裝置和樣品接觸的過程中，或者在分析物傳感分子和分析物之間已經發生特異性相互作用之後。通過使用例如螢光組分例如Cy5、Cy3、TexasRed、FITC、Attodye、Cydye、Alexa647等、放射性基團等的修飾，可以使用可檢測標記物對分析物進行修飾。如果分析物傳感分子例如抗體和例如Cy5標記的分析物之間發生相互作用，則任何其他標記的樣品組分可以被清洗步驟除去，並且可以根據與分析物傳感分子的相互作用，檢測樣品中特異性分析物的存在，例如通過分析物傳感分子與在檢測裝置上所保留的分析物之間的相互作用所產生的螢光信號。其他的方法例如誘導銀染色可以用於檢測。其他可檢測標記物依賴產生染色的酶反應，例如辣根過氧化酶可以與樣品中的分析物偶聯，之後，通過提供相應的底物可以啟動反應，引發在被辣根過氧化酶修飾的分析物與分析物傳感分子之間相互作用的位置的染色。這些酶連接物還可以含有鹼性磷酸酶或化學發光物系統。也可以被稱作報告分子的可檢測標記物的其它例子包括但不限於染料、化學發光化合物、金屬複合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發射器和放射性發光化合物。也可以使用其它檢測分析物和分析物傳感分子之間相互作用的方法。例如，如果分析物傳感分子是抗體，則分析物可以從樣品中特異性地結合該抗體。接著，如果使用清洗步驟用於除去任何未結合或非特異性結合的所施加樣品組分，則可以加入其它對於分析物的另一部分也具有特異性的抗體。該抗體可以例如被連接到可檢測標記物。這種可檢測標記物可以是螢光標記物例如Cy5;然而，這種標記物也可以使例如已知序列的寡聚核苷酸。如果在所謂二抗與通過捕獲抗體被保持在支持物上的分析物相互作用之後，該寡聚核苷酸被用於聚合酶鏈式反應(PCR)，則可以檢測在樣品中分析物的存在。這種所i胃的免疫PCR是非常敏感的，並且能夠用於可靠地檢測溶液中微量的分析物。上述檢測方法依賴第二分析物傳感分子例如抗體，也被稱作"三明治式檢驗"。本領域技術人員非常了解這種檢驗。在另一個優選的途徑中，第二(檢測抗體)偶聯到例如生物素上。在進一步的步驟中，分析物傳感分子-分析物-二抗複合物與鏈黴素標記物的可檢測標記物例如螢光標記物接觸。接著，螢光標記物可以通過鏈黴素與生物素標記的二抗相互作用。當然可能存在該途徑的其它替代。例如，分析物傳感分子例如捕獲抗體14可以通過噴膜印刷機被印製在多孔膜上。隨後，可以對所印製的膜進行封閉使得非特異性結合最小化。接著，含有例如作為分析物的靶蛋白的樣品在該情況中將被直接標記。標記可以是螢光團、金珠、酶或半抗原例如上面所述的。使用下面所描述的流通配置，標記的樣品將被抽吸通過膜數次，以使得抗體-抗原結合。通過額外任選的清洗步驟，將除去過多的標記。在另一個實施方式中，使用噴膜印刷機將可以是靶蛋白的分析物印製在多孔膜上。封閉所印製的膜以使非特異性結合最小化。接著將也含有靶蛋白的樣品與多種任選被標記的能結合分析物的抗體混合。標記可以是例如螢光團。任選地，接著進行清洗步驟，以從膜上除去非特異性結合的抗體或標記。同樣，任選地，可以進行與耙向所結合抗體的第二標記抗體的溫育步驟。前述任選的替代也可以進行組合。抗原-抗體1或抗原-抗體1-抗體2結合將接著通過檢測設置而顯示，例如該檢測設置能夠檢測螢光信號，並使用校準標準進行對複合物的定量(參見下面)。後者實施方式實際上是競爭檢驗。輸入樣品中高濃度的靶蛋白將在膜上提供低信號。此外，第一捕獲抗體的量需要被仔細優化以便與樣品中靶蛋白的量相比不會過剩。當然，分析物傳感分子和分析物之間的特異性相互作用也可以不使用標記物而檢測，即所謂的"無標記"檢測。例如，這可以使用Biacore系統完成。如上所述，如果分析物傳感分子被以陣列格式布置在支持物上，則根據本發明的方法可以被用於實現在一種或者多種樣品中平行處理樣品和平行檢測多種分析物。因為每個檢測點可以對應不同的對某種分析物特異性的分析物傳感分子，因此在固體多孔支持物與樣品溫育並以上述方式處理之後，從這類檢測點產生的信號將指示在樣品中存在分析物。在根據本發明的方法最後步驟e)中，測定樣品中分析物的濃度。濃度的測定主要依賴在如上對步驟d)中所描述的檢測分析物傳感分子和分析物之間特異性相互作用所產生的信號。典型地，首先將之上被布置分析物傳感分子的支持物與樣品接觸，其中樣品包含能夠特異性結合支持物上分析物傳感分子的分析物，其中分析物傳感分子的濃度是已知的。通過使用具有已知但不同濃度的該特異性分析物，以及例如使用具有不同量分析物傳感分子的微陣列以及例如偶聯到分析物的螢光標記，可以建立所謂的校準或標準曲線，在該曲線中一定的螢光信號強度與樣品中已知的分析物濃度相關聯。在作為實際測量的第二步驟中，採用含有濃度未知的分析物的樣品。如上所述的根據本發明的方法處理這些樣品，例如如果分析物也被與已經用於建立校準曲線相同強度的螢光標記物所標記，則記錄螢光信號。接著，通過與前述的校準曲線進行比較，將這種螢光信號與樣品的濃度進行關聯。當然，本領域技術人員能夠知道螢光信號會發生飽和效應，例如如果將樣品與支持物接觸，其中樣品含有比支持物上可以利用於相互作用的分析物傳感分子多的分析物。在這些情況中，將逐步對分析物樣品進行稀釋，直到達到獲得非飽和螢光信號的狀態。測定樣品中分析物濃度的其它實施方式是本領域技術人員已知的。例如，如果將化學反應或酶反應用於檢測分析物和分析物傳感分子之間的相互作用，也可以通過比色反應，並用分析物濃度已知的樣品建立校準或標準曲線。之後，根據如上所述本發明的方法可以進行，並從所獲得的比色值計算濃度。本領域技術人員還會了解，需要確保只有這些被考慮的比色信號還沒有達到飽和水平。上面所述用於測定樣品中分析物濃度的方法的優點之一是樣品與多孔支持物結合。因為支持物是多孔的，樣品可以通過支持物，這能夠快速和有效地除去所有非特異性結合的樣品組分，導致一旦檢測分析物與分析物傳感分子之間特異性相互作用時，信噪音比整體增強。此外，使用多孔膜能夠得到有利和優選的本發明實施方式，即通過重複步驟b)-d)多次而以重複模式進行上述方法。優選，步驟b)-d)被重複至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次，最高達到30次。特別優選的循環次數是大約8-12個循環。通過例如在循環中經所述固休多孔支持物抽吸樣品，可以促進重複接觸，任選地清洗和檢測分析物傳感分子和分析物之間的相互作用。也可以通過抽吸之外還採用真空，或者採用真空替代抽吸，來促進循環。當然，本領域技術人員知道如何改造孔徑用於不斷地經所述支持物抽吸樣品，例如如果包括清洗步驟的話。例如，16這可以通過使用能夠被閥門切換到不同來源(例如樣品和清洗緩衝液源)的管線完成。在檢測分析物傳感分子與分析物之間的相互作用時，重複將樣品施加到支持物上引起顯著增強的信噪比。在以至少20秒，至少30秒，至少40秒，至少50秒，至少60秒，至少2分鐘，至少3分鐘或至少5分鐘的接觸或溫育時間打斷重複循環時，這是尤其正確的。可以採用上面所限定的循環次數。重複應用樣品可以包括重複加入新鮮的樣品和/或已經經膜通過一次的樣品即首次通過的"流通物"術語"重複循環"可以不僅指一起重複所有步驟b)-d)。代替的是，術語"重複循環"也可以指任何這些步驟b)-d)或者甚至其子步驟。例如，替代經多孔膜多次循環樣品的是，也可以只重複施加，即循環經膜的清洗溶液。類似地，可以在支持物上重複循環可檢測標記物。例如，這可以是優選的情況，如果鏈黴素標記的螢光標記物被用於檢測生物素標記的二抗。當然，也可以使用前述循環的步驟即循環樣品、清洗溶液和/或檢測標記物的組合。不希望囿於理論，採取重複循環優選被前述溫育時間所中斷，會提高在檢測分析物傳感分子和分析物之間的相互作用時的信噪比，因為重複分析物和分析物傳感分子之間反應的開和關會導致樣品非特異性結合組分的有效除去，並有利於特異性相互作用的選擇壓力。此外，樣品與支持物的重複接觸似乎是下列事實的原因與不進行重複循環而只包括一次溫育和任選的清洗步驟的情況相比，有效檢測所需的整體溫育時間被顯著降低。因此，本發明在以上述重複模式進行時，具有下列優點時間例如檢測抗體和抗原之間免疫反應所需要的時間可以比傳統的持續時間降低，傳統上可以持續最高達到3.5小時，例如沒有進行膜上溫育的話最低達到15分鐘。如果包括溫育步驟的話，5個抽吸循環的總檢驗時間可以是大約45分鐘。可以通過各種使用抽吸和/或真空手段的手段，完成根據本發明方法的重複操作，其中抽吸和/或真空手段是優選的，因為他們能夠允許樣品和任選的清洗溶液可控和穩定地在固體支持物上流動和通過。本發明的另一個實施方式涉及隨時間變化測定樣品中分析物的濃度的情況。隨時間變化測定所結合的成分能夠檢測分析物與其分析物傳感分子結合的實時動力學。當測定分析物與分析物傳感分子的實時結合動力學時，能夠將信號轉化成分析物的濃度。根據結合曲線的類型，需要知道結合速度常數，解離速度常數以及分析物傳感分子密度(即分析物傳感分子的數目/表面面積)。可以分別測定結合和解離常數。可以從所布置的濃度和體積以及點的直徑測定捕獲分子的密度。或者，在與已知濃度的分析物分子溫育時，可以測定結合或解離速度常數。為了檢測特異性的相互作用，也需要依賴前述的可檢測標記物例如螢光分子。一旦已經建立了反映分析物與分析物傳感分子結合動力學的結合曲線，含有未知濃度的分析物的樣品可以與固體支持物接觸，並也可以監控隨時間變化的分析物和分析物傳感分子之間的特異性相互作用。通過利用已經從不同但已知濃度的樣品獲得的各種標準曲線，測定未知濃度的樣品的曲線形狀，可以估計不僅分析物與分析物傳感分子結合的結合動力學參數，而且還可以估計樣品中分析物的濃度。並且如果步驟b)-d)或這些步驟中的任何步驟被重複多次，則分析物與分析物傳感分子之間實時結合動力學的測定可以被顯著改進，並且減少了檢測所需的時間。在本文中，參照如上所述根據本發明的方法的重複操作。當然，方法的重複操作可以被如上所述的溫育和接觸時間所打斷。本發明有多種有用的應用。因此，上述的方法可以用於免疫反應，這可以檢測例如在血液樣品中的某些抗原。因此，上述方法可以用於診斷目的。上述方法特別的優點是不僅能夠檢測樣品中某種分析物的存在，而且可以在相對短時間內測定其濃度。而且，上述方法可以用於測定分析物與分析物傳感分子的實吋結合動力學。因此，上述方法可以不僅用於檢測例如化合物庫中能夠與治療上感興趣目標如細胞受體相互作用的小分子化合物，而且能夠用於測定小分子與其靶蛋白之間相互作用的結合動力學。因此，本發明可以用於利用從不同來源例如環境來源、血液、淋巴等獲得樣品測定樣品內分析物的存在和濃度。額外地和/或可替代地,通過依賴本發明涉及測定分析物傳感分子和分析物分子之間相互作用的實時動力學的實施方式，本發明的方法可以用於測定樣品中分析物的存在，以及與分析物傳感分子的結合行為。在本發明可替代的實施方式中，檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法包括歩驟a)提供至少一種固體多孔支持物，其上被布置了至少一種分析物傳感分子；b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸；c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物，其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結合的樣品組分；d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與至少一種分析物之間的特異性相互作用；e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。如上所述，如果例如步驟b)-d)(或者這些步驟中的任何步驟)被再次重複多次，以及如果任選的溫育時間被保持充分短，則樣品中存在的分析物可能不會立即與過剩存在的分析物傳感分子完全反應。在這種情況中，即如果以重複模式操作該方法，則可以記錄在每個循環之後檢測分析物和分析物傳感分子特異性相互作用的隨時間變化的信號。在經過重複循環之後，由于越來越多的分析物結合到分析物傳感分子上，因此將觀察到信號強度的提高，一旦分析物與分析物傳感分子的結合達到飽和，則這將達到保持水平。如果現在以這種重複模式進行該方法，並且採用均具有不同已知濃度特異性分析物的不同樣品，可以計算校準或標準曲線，這反映不同量的分析物與分析物傳感分子隨時間變化的結合動力學。如果現在使用含有未知濃度樣品的樣品在相同的條件下重複該方法，即相同的重複循環次數以及任選的溫育和清洗時間，也會獲得信號相對於時間的曲線，這反映隨著時間的變化，分析物與分析物傳感分子的結合行為。因此，可以監控樣品內未知濃度的分析物的結合動力學，並可以同時測定分析物的濃度。下面根據某些實驗實施例舉例說明本發明。然而這些實施例不以任何方法用於限制本發明的範圍，而是為了通過其某些示範性實施方式舉例說明本發明。實驗實驗l製備印製抗體的膜為了獲得微陣列格式的固體多孔支持物，使用硝酸纖維素膜。使用噴膜印刷機在該膜上布置不同的抗體。在圖1中，顯示了所獲得微陣列的示意圖。含有螢光標記如Cy5的抗體將在適當激發之後產生螢光信號，而與是否結合分析物無關。這些分析物傳感分子用於確定微陣列的邊緣和拐角，並且用於提供測量所得到的螢光的檢測裝置校準的內標。在微陣列上檢測分析物後面，接著使用在PBSpH7.4中無蛋白酶的5重量。/。BSA對前述的微陣列封閉過夜。隨後，拍攝圖2所示的照片。127.5mA和50mA的數值表示以不同電流驅動光學系統LED所拍攝的照片。在第二步驟中，300pl100nM兔抗小鼠Cy5標記的抗體被加入到第一室中的微陣列。將該微陣列與樣品溫育大約1分鐘。之後，經所述微陣列抽吸樣品多次，而沒有中間的清洗步驟。在每次溫育步驟之後，通過在使用Philips開發的LED設置(波長ex/em:650/670nM)激發後拍照來監控樣品中的分析物即兔抗小鼠Cy5標記的抗體與分析物傳感分子即山羊抗兔抗體之間的相互作用。每個循環的溫育時間為大約1分鐘。圖3顯示在經過循環1、2和4之後的照片。圖4顯示在循環5、6、7和8之後的所記錄的照片。圖5的下圖顯示如果在最後循環(循環8)之後使用PBS.7.4，0.05重量％吐溫20清洗微陣列3次後所獲得的結果。圖5的上圖顯示沒有清洗的相同照片。從最後的照片，可以清楚地看出兔抗小鼠Cy5標記的抗體和山羊抗兔抗20體之間發生了相互作用。此外，能夠清楚看到在微陣列上布置較多山羊抗兔抗體的情況中的信號比在微陣列上布置較少量的情況具有更強的信號。實驗2在該實施例中，測試了重複循環可檢測標記物對信號強度的影響。微陣列印製布置圖使用在圖6中所示的微陣列印製布置圖。如上所述產生該微陣列。Cy5標記的抗體再次代表內標。實驗設置使用下面的捕獲抗體(分析物傳感分子)、抗原(分析物)和檢測二抗。鏈黴素標記Cy5被用於檢測。PBS—直指PBSpH7.4。PBST—直指PBSpH7.4，0.0%吐溫20。tableseeoriginaldocumentpage21以下列濃度使用組分:捕獲抗體小鼠抗人CRP700nM3.5^1儲液+296.5pl具有5%甘油的PBS小鼠抗人TNFa700nM63pl儲液+237pl具有5%甘油的PBS驢抗山羊Cy5標記的700nM21^1儲液+279pl具有5%甘油的PBS200nM6^1儲液+294pl具有5%甘油的PBS抗原CRP/TNFa抗原100nM8.2plCRP儲液+34(ilTNFa+l957.8^1具有1。/。BSAp.f.的PBS100pM2^1的100nM溶液+1998(^1具有1。/。BSAp.f.的PBS空白具有P/。BSAp.f.的PBS檢測抗體全部以生物素進行標記檢測系統鏈黴素Cy5標記的1:10001Ojxl儲液+9990plPBS溫育微陣列和檢測相互作用的程序如下。實驗進行兩次在膜上印製陣列拍攝陣列照片使用100(HilPBS+5。/。BSA封閉陣列1小時(室溫(RT)，黑暗)拍攝陣列照片以測定回收向陣列加入500ial抗原溶液打開真空並等待直到完全除去流體再重複4次通過吸移(pipetting)500plPBS清洗陣列打開真空並等待直到完全除去流體再重複2次向陣列加入50(^1檢測抗體溶液打開真空並等待直到完全除去流體再重複4次如前使用PBS-T清洗陣列3次拍攝陣列照片向陣列加入500^1鏈黴素-Cy5溶液打開真空並等待直到完全除去流體拍攝所有陣列的照片根據需要重複最後3個步驟多次圖7顯示在印製之後的陣列。下表中顯示捕獲抗體的回收率值，這是在200nM和700nM驢抗山羊Cy5標記的內標的基礎上計算的。_tableseeoriginaldocumentpage23結果圖8和9顯示在重複循環(即10次，包括最後清洗步驟)後下列經過標準化的強度結合的C-反應性蛋白(CRP);不同濃度的腫瘤壞死因子a(TNFa);以及空白。圖10顯示在圖8和9的基礎上所測定的CRP和TNFa信噪(S/N)比。實驗顯示可以在15分鐘內有效進行該檢驗。實驗3在該實施例中，研究可檢測標記物的影響。進一步研究抽吸的影響以及流通物通過微陣列的循環。微陣列印製布置圖使用在圖11中所顯示的微陣列印製布置圖。如上所述產生該微陣列。Cy5標記的抗體仍代表內標。實驗設置使用下面的捕獲抗體(分析物傳感分子)、抗原(分析物)和檢測二抗。鏈黴素標記的Cy5被用於檢測。PBS—直指PBSpH7.4。PBST—直指PBSpH7.4,0.0%吐溫20。名稱濃度貨號公司CRP捕獲抗體9mg/ml4C28HytestLtd.CRP-6抗原2.8mg/ml1707-2004BiotrendCRP檢測抗體1.7mg/ml4C28BHytestLtd.TNFa捕獲抗體0.5mg/ml14_7348_81eBioscience人重組TNFa0.1mg/ml14-8329-63sBioscisncsTNFa檢測抗體0.5mg/ml13-7349-816Bioscisncs驢抗綿羊Cy51.5mg/ml713-175-003JacksonImmuno以下列濃度使用組分:捕獲抗體小鼠抗人CRP8儲液+180plPBS小鼠抗人TNFa3.33(iM未稀釋的儲液驢抗山羊Cy5標記的200nM6^1儲液+294pl具有5%甘油的PBS24500nM15^1儲液+285pl具有5%甘油的PBS700nM21^1儲液+279pl具有5%甘油的PBS抗原，檢測二抗100nM8.2^1CRP儲液+34plTNFa儲液+1906.1pl具有1%BSA的PBSlOOpM1.9^1上述溶液+1946.3pl具有1%BSA的PBS100M1.9(il上述溶液+1946.3pl具有1%BSA的PBS空白1948.2|J具有1%BSA的PBS接著加入到所有溶液66.7nM11.8|_ilCRP檢測抗體儲液66.7nM40^1TNFa檢測抗體儲液所有檢測抗體都以生物素進行標記檢測系統1:100010^1儲液鏈黴素-Cy5+1990jxlPBS1:100010pl儲液鏈黴素-A647+1990plPBS溫育微陣列和檢測相互作用的程序如下。實驗進行兩次-印製陣列拍攝陣列照片對於該實驗使用尼龍膜M吏用50(^1PBS/孔+5Q/。BSA封閉陣列1小時在PBDT中清洗陣列3+5分鐘，並拍攝照片確定回收率將其他陣列與不同濃度的抗原和檢測抗體500W溫育持續5分鐘。接著，應用真空直到膜乾燥。接著溫育鏈黴素染料2分鐘。再次應用真空直到膜乾燥。拍攝所有膜的照片。溫育流通物5分鐘。之後，應用真空直到膜乾燥並拍照。再重複3個步驟。溫育新鮮的鏈黴素染料溶液5分鐘。之後，應用真空直到膜乾燥。拍昭。"、、o*通過吸移500^1PBS-T清洗膜，應用真空直到膜乾燥。重複兩次，接著拍照。因此，這些循環總結如下循環l:5分鐘抗原+檢測抗體，接著2分鐘鏈黴素-染料循環2-4:5分鐘流通物循環5:5分鐘新鮮鏈黴素-染料循環5+w:3次PBS-T(沒有在膜上的溫育)圖11顯示在印製後的陣列。在下表中，顯示了在200nM、500nM和700nM驢抗山羊Cy5標記的內標的基礎上計算的捕獲抗體的回i！夂率值。溶液則後回收率200nM0.0431o馬o13.8%500nM0.13760.022416.3%700nM0.20900.030814.7%平均=15.0%結果圖12顯示在封閉後拍攝的用於測定回收率的微陣列照片。圖13和14顯示以不同濃度和染料的CRP和TNFa經標準化的強度。圖15和16顯示依賴各種循環的CRP和TNFa檢測動力學。結果明確顯示可以在短時間內進行免疫檢驗，並且抽吸、應用真空和重複某些操作步驟能夠影響所測量的信號強度。實驗4在該實施例中，將700nM山羊抗兔抗體印製在尼龍膜上。將該膜與100nM兔抗小鼠Cy5進行溫育(參見圖17)。為了溫育，將分析物溶液經膜抽吸5次。進行該實驗3次。微陣列印製布置圖使用圖18中所示的微陣印製列布置圖。如上所述生產微陣列。Cy5標記的抗體仍代表內標。26結果圖19顯示通過重複分析物溶液的循環，經標準化的信號強度會提高。從上述實驗能夠得出三個主要的結論首先，通過經微陣列快速循環樣品，能夠顯著降低有效檢測分析物與分析物傳感分子之間相互作用所需的時間。在上述實驗l中，如果不在膜上進行溫育的話，檢測信號的總時間花費大約10分鐘。這與現有技術中這種應用所需能夠花費最高達到3.5小時不同。第二，通過將例如圖5所獲得的信號與之前已經建立的標準校準曲線進行比較，可以測定兔抗小鼠Cy5標記的抗體的濃度。相應地，這也應用於其他實驗。第三，通過監控隨著每個循環即隨時間變化信號強度的發展，能夠實際測定分析物的結合動力學，在實驗1中是兔抗小鼠Cy5標記的抗體與其捕獲抗體，前提是實驗l中的捕獲抗體是山羊抗兔抗體已經被以不同的濃度布置在微咗別卜.這沐7^固的時間佔？^生了不固的<畝號力度知強麼2權利要求1.檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法，該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物，其上被布置了至少一種分析物傳感分子；b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸；c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物，其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結合的樣品組分；d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與所述至少一種分析物之間的特異性相互作用；e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。2.根據權利要求1所述的方法，其中隨時間變化測定濃度，以測量所述分析物與所述分析物傳感分子的實時結合動力學。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述基質的孔隙度允許流體從其流過。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述基質是選自包括由尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚碸所製成的膜的組的膜。5.根據權利要求1所述的方法，其中多次重複步驟b)-d)或者這些步驟中的任何步驟。6.根據權利要求1所述的方法，其中大量分析物傳感分子被以微陣列的形式布置在所述支持物上。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一種分析物傳感分子是對分析物具有特異性的抗體。8.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一種樣品的所述至少一種分析物被至少一種可檢測標記物修飾。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述至少一種可檢測標記物選自包括螢光團、酶、染料、化學發光化合物、放射性同位素、金屬複合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發射器和放射發光化合物的組。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白質。全文摘要本發明涉及測定樣品中分析物濃度和/或分析物與分析物傳感分子的結合動力學的方法。為此目的，本發明依靠檢測分析物與分析物傳感分子的相互作用，其中所述分析物傳感分子以微陣列形式物理吸附到固體多孔支持物上。在優選的實施方式中，該方法可以重複循環運行。文檔編號G01N33/557GK101501499SQ200780028864公開日2009年8月5日申請日期2007年8月1日優先權日2006年8月2日發明者G·H·P·K·C·普亞迪拉,H·R·施塔伯特申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司