薑黃素在製備大電導鈣激活鉀通道開放劑中的用途

2023-10-25 04:06:32

薑黃素在製備大電導鈣激活鉀通道開放劑中的用途
【專利摘要】本發明屬中藥領域，涉及中藥薑黃主要活性成分薑黃素的新的藥用用途，具體涉及薑黃素在製備鉀通道開放劑中的用途，尤其是薑黃素作為大電導鈣激活鉀通道開放劑的新用途。本發明經細胞實驗結果證明，所述的薑黃素具有開放大電導鈣激活鉀通道的作用，包括：對該通道電流的增大作用，對該通道蛋白的總表達和表面表達的增加作用，抑制該通道蛋白的降解途徑，增強其穩定性的作用。所述的薑黃素進一步可製備新的大電導鈣激活鉀通道開放劑藥物，用以製備治療平滑肌功能紊亂相關疾病的藥物，包括治療膀胱過度活動症、胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關疾病的藥物。
【專利說明】薑黃素在製備大電導鈣激活鉀通道開放劑中的用途【技術領域】
[0001]本發明屬中藥領域，涉及中藥薑黃主要活性成分薑黃素的新的藥用用途，具體涉及薑黃素在製備鉀通道開放劑中的用途，尤其是薑黃素作為大電導鈣激活鉀通道開放劑的新用途。
【背景技術】
[0002]研究報導，大電導鈣激活的鉀通道(BK通道)廣泛分布於各種類型的細胞中，尤其在平滑肌細胞、神經元和內分泌細胞等興奮性細胞中表達豐富。BK通道受膜電位和細胞內Ca2+濃度雙重調節，是細胞興奮性，肌肉收縮和遞質釋放等多種生理過程的強大調節器。有研究顯示，BK通道的激活、失活和變異與多種疾病調節有關，例如:作為血管平滑肌細胞膜上的優勢離子通道，BK通道的激活和表達增加能夠平衡高血壓時冠脈張力的上升，增強平滑肌細胞舒張功能適應性；在固有免疫中，阻斷BK通道使微生物殺傷和消化過程受到抑制；在若干種腫瘤的發生過程中，BK通道抑制腫瘤細胞增殖，影響其遷移，表現出抗腫瘤的特性，在神經系統中，激活的BK通道對神經細胞有保護作用。因此，BK通道是治療高血壓，腦中風，惡性腫瘤等許多疾病的潛在靶點。
[0003]鑑於BK通道在人類生理、病理過程中的重要作用，尋找高活性、高選擇性、類藥性好的BK通道開放劑成為本領域研究的熱點。但是，目前對BK通道開放劑的研究大多還停留在早期藥物發現的階段，僅有4個開放劑進入臨床試驗的開放劑，而其中3個(NS8，BMS204352和TA1702)都因故被中止，只有Andolast還在試驗中。
[0004]薑黃素是一種從草本植物薑黃中提取的天然植物酚類化合物。據文獻報導，薑黃素是一個多靶點治療藥物，對若干疾病，如炎症性疾病，阿爾茲海默症、心血管疾病、腫瘤等有治療作用。現代藥理研究表明，薑黃素主要通過抗炎、抗氧化、抑制多種酶類等藥理活性發揮作用。
[0005]目前，尚未見關於薑黃素具有調節BK通道活性的作用的報導。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供薑黃素新的藥用用途，涉及薑黃素在製備鉀通道(BK通道)開放劑中的用途，尤其涉及薑黃素在製備大電導鈣激活鉀通道開放劑中的用途。
[0007]本發明通過細胞實驗，證實了薑黃素能夠顯著增加BK通道的電流，增加BK通道的蛋白表達，以及進一步產生的開放BK通道的用途。
[0008]本發明所述的薑黃素是一種從草本植物薑黃中提取的天然植物酚類化合物，可以按常規方法通過中 藥薑黃進行人工提取，或通過市購的渠道獲得。
[0009]本發明以攜帶BK通道基因的pCMV-myc質粒轉染HEK293細胞，使BK通道在HEK293細胞中過表達；採用全細胞膜片鉗的方法研究薑黃素對BK通道電生理活性的影響；用蛋白質免疫印跡實驗(Western Blot)和細胞表面生物素化方法檢測BK通道總蛋白和細胞膜表面蛋白的表達水平，通過Cycloheximide-based protein chase實驗研究薑黃素對BK通道蛋白降解過程的作用。經細胞生物學實驗結果證明，薑黃素具有以下開放BK通道的作用:
[0010]1、增加瞬時轉染BK通道基因的HEK293細胞中BK通道總蛋白的表達。
[0011]2、增大BK通道電流。
[0012]3、增加BK通道蛋白的表面表達。
[0013]4、抑制BK通道蛋白降解途徑，從而穩定BK通道蛋白。
[0014]本發明經細胞實驗結果證明，薑黃素具有開放大電導鈣激活鉀通道的作用，包括對該通道電流的增大作用；對該通道蛋白的總表達和表面表達的增加作用；抑制該通道蛋白的降解途徑，增強其穩定性。
[0015]本發明所述的薑黃素進一步可製備新的大電導鈣激活鉀通道開放劑藥物，用以治療平滑肌功能紊亂相關疾病的藥物，包括治療膀胱過度活動症、胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關疾病。
[0016]本發明為薑黃素抗腫瘤，神經保護等的多種藥理作用的機制提供了理論依據；有助於確證BK作為藥物靶標；也為進一步將薑黃素作為大電導鈣激活鉀通道開放劑製備治療膀胱過度活動症，胃蠕動過強等平滑肌功能紊亂相關疾病的藥物奠定了實驗基礎。
[0017]為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的薑黃素作為大電導鈣激活鉀通道開放劑的新用途進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這 些修正和改變也納入本發明的範圍內。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是Western Blot方法證實瞬時轉染pCMV-myc_BK質粒後BK通道蛋白的過表達圖。
[0019]圖2是薑黃素對BK通道總蛋白的增加作用，
[0020]其中，與空白對照相比，P <0.05。
[0021]圖3是薑黃素對BK通道電流的增大作用，
[0022]其中，A:瞬時給藥薑黃素的作用；B:長時間給藥薑黃素的作用。
[0023]圖4是薑黃素增加BK通道蛋白的表面表達，
[0024]其中，與對照組相比P <0.05。
[0025]圖5是薑黃素對BK通道蛋白降解途徑的抑制作用，
[0026]其中，*:與對照組同時間點相比，P < 0.05。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]I)質粒轉染HEK293細胞
[0029]轉染前一天，將HEK293細胞傳代，並以3X 108!/1的密度接種於直徑3.5cm的培養皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培養24h。將I μ g質粒DNA加入到100 μ L無血清無抗生素培養基中混勻，2 μ L Lipofectamine2000加入到100 μ L無血清無抗生素培養基中混勻，室溫下兩種溶液靜置5分鐘，然後將兩種溶液混合，室溫靜置20分鐘。用無血清抗生素培養基衝洗細胞兩次，加入500 μ L無血清無抗生素培養基，將前面製備好的混合液加入培養皿，用300 μ L無血清無抗生素培養基衝洗EP管後加入培養皿中，加入C02細胞培養箱中培養。6小時後換成正常培養基，48~72h後進行試驗。螢光顯微鏡下觀察對照組螢光細胞形態，估計轉染效率。
[0030]實驗結果顯示，pCMV-myc-BK質粒瞬時轉染HEK293細胞24小時後，BK通道蛋白有
效表達。
[0031]2)薑黃素增加BK通道總蛋白
[0032]實驗方法:
[0033]HEK293細胞以3X 108!/1的密度接種於直徑3.5cm的培養皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培養24小時後進行轉染實驗。轉染後24小時，實驗組給予不同濃度的薑黃素(2.5 μ M、5 μ Μ、10 μ M、20 μ M)。藥物作用24小時後，裂解細胞，收集蛋白，進行WesternBlot實驗，檢測BK通道蛋白的表達情況。
[0034]I) HEK293細胞蛋白提取:
[0035]①細胞藥物處理完畢後，棄上清，0° C的PBS洗滌2次，細胞刮收集細胞，置EP管中，4° C條件下離心，3000rpm5min,棄上清；
[0036]②加入細胞裂解液，在冰水浴中裂解0.5h，每隔IOmin反覆震蕩一次，使細胞充分裂解；
[0037]③4。C 條件下離心，12000rpm5min ；
[0038]④吸取上清，1:4加入緩衝液，37° C，20min滅活蛋白質，_80°C保存。
[0039]⑤用BCA法測定蛋白濃度。
[0040]2) Western Blot 實驗:
[0041 ] ①製備8%分離膠和5%層積膠；
[0042]②將樣品加入電泳孔槽中，空餘孔槽加入等體積的上樣緩衝液，先採用60V恆壓
0.5h，後改用120V至溴酚藍至凝膠底部；
[0043]③電轉液配製好後4°C預冷；裁PVDF膜，濾紙，PVDF膜在甲醇內浸泡lOmin，然後與濾紙，海綿，電轉夾等一起置入4°C預冷的電轉液中30min ；
[0044]④電泳結束後，參考蛋白質Markers切下目的蛋白所處凝膠區域，將其用轉膜緩衝液漂洗；組裝轉印夾層:陰極-3張濾紙，凝膠，PVDF膜，3張濾紙-陽極；用玻棒去除殘留於凝膠和PVDF膜之間的氣泡,然後裝好轉膜裝置,220mA恆流轉膜2h ；
[0045]⑤將轉印膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)室溫封閉；
[0046]⑥用抗體稀釋液按1:200稀釋一抗，一抗4°C孵育過夜；用了831'漂洗4*5min ; 二抗(1:5000)室溫孵育 lh，TBST 漂洗 4*5min;
[0047]⑦膜上加上Protein ECLkit試劑(等體積的A液和B液充分混合)；使用AlphaEaseFC System下成像，並對條帶進行分析。
[0048]實驗結果顯示，分別以2.5 μ Μ、5 μ M、10 μ Μ、20 μ M的薑黃素作用於瞬時轉染ΗΕΚ293細胞後，相對於對照組可以看到BK通道蛋白的表達量顯著提高，2.5 μ M組P< 0.05 ;5μΜ、10μΜ、20μ]\α?Ρ < 0.01 ；η = 4 ;且 10 μ M 時 BK 通道蛋白表達量提高最多，表明薑黃素能夠提高BK通道蛋白的表達並呈現劑量依賴性。
[0049]3)薑黃素增加BK通道蛋白的細胞表面表達
[0050] 實驗方法:細胞表面生物素化實驗[0051]HEK293細胞接種在IOcm培養皿中，當細胞密度達到90_95%時，可以進行表面生物
素化實驗。
[0052]I)生物素標記(4°C下進行)
[0053]①預冷DPBS-Ca-Mg (7mL)快速衝洗兩次；
[0054]②用含有lmg/mL 的 NHS-SS-biotin/DPBS 溶液孵育細胞 30min (gentlelyshaking) (7mL/ 孔)；
[0055]③用淬火液(含有IOOmM甘氨酸的DPBS-Ca-Mg溶液)漂洗細胞兩次，每次IOmin-終止生物素化反應。
[0056]2)裂解細胞(4°C下進行)
[0057]①預冷DPBS-Ca-Mg漂洗衝洗細胞兩次；
[0058]②刮下細胞，用200uL RIPA(with PMSF)裂解30min，提取蛋白；
[0059]③裂解液以6000Xg離心10min，收集上清。其中1/10 (20uL)上清作為全細胞蛋白上樣對照，剩餘進行免疫共沉澱。
[0060]3)免疫共沉澱 [0061]①孵育(4°C):上一步剩餘的上清與200uL streptavidin-agarose磁珠孵育。streptavidin-agarose磁珠提取兩次:第一次4°C過夜,第二次4°C 2h ；
[0062]②洗脫(37°C):RIPA衝洗 beads5 次，用 50uL 含有 200mM DTT 的 2XLaemmli 上樣緩衝液37°C孵育一小時，洗脫過程可以重複兩次。洗脫液不要混合，作為第一次洗脫和第二次洗脫；
[0063]③14000 Xg離心2min，收集洗脫液。
[0064]4) Western Blot 檢測蛋白量
[0065]實驗結果顯示，與對照組相比，薑黃素能使BK通道蛋白的細胞表面表達增加。
[0066]4)薑黃素增加BK通道電流
[0067]實驗方法:全細胞膜片鉗實驗
[0068]電極液配製:
[0069]電極內液(mmol / L):KC1140, HEPES 10, MgCl2I, Na2ATP5, Na2GTP0.5，EGTA I 和Cacl20.001, pH7.35。
[0070]電極外液(mmoL/ L):Nacll45, KC14, MgCl2I, CaCl2I, HEPES 10 和葡萄糖 10，pH7.4。所有實驗均在室溫(22 °C )下進行。
[0071]操作方法:
[0072]玻璃微管電極在電極拉制機上兩步拉制而成，充灌電極內液後，尖端阻抗為2~3ΜΩ。將拉制好的電極尖端先在不含anaphotericin-B的電極內液中浸]Λ3秒,然後從電極尾部反向充灌含amphotericin-B的電極內液,用手指輕彈電極中部排除尖端氣泡。在10分鐘內儘快進行細胞封接。在室溫下，將貼附有細胞的蓋玻片放入盛有Iml浴液的實驗小槽中，在倒置相差顯微鏡下找到折光性好、膜光滑的細胞，用微推進器控制電極接近細胞，使檢測方波的高度下降約一半時放掉正壓，給予電極尖端約l(T20cmH20的負壓，使微管電極尖端與細胞間形成電-化學絕緣，阻抗達到10-1006Ω，即形成細胞貼附式膜片(cell-attached patch),約3~20分鐘,可以看到膜電容出現並逐漸增大,而Rs則逐漸變小，提示穿孔膜片正在逐漸形成，20-30分鐘後，膜電容瞬變值和Rs都趨於穩定。給予細胞-1OOmV至+IOOmV,步階電壓為+20mV的電壓刺激，電流經Axon膜片鉗放大器後，記錄到pClamp9.0和Clamp9.0軟體系統中，以獲取電流-電壓變化曲線。
[0073]BK通道電流和1-U曲線記錄:
[0074]電流記錄程序為維持電位一 60mV，刺激電位從一 IOOmV至IOOmV,階躍10mV，刺激時問100ms，刺激問隔時間10 S。先記錄未加入BK通道特異性阻滯劑IBTX)(前BK通道電流，然後再記錄加入IBTX後BK通道電流。採用Clampfit軟體，將加入IBTX前後記錄的BK通道電流相減，可得IBTX敏感的鉀離子流，即為BK通道電流，以電流和刺激電位作圖，可得1-U曲線。
[0075]BK通道電流時間-過程圖:
[0076]電流記錄程序為維持電位一 60mV，刺激電位IOOmV,刺激時間100ms，刺激間隔時間10s，可記錄到總鉀離子流的變化。
[0077]實驗結果顯示，與對照組相比，在不同電壓刺激下，實驗組BK通道的電流明顯高於對照組。表明薑黃素對BK通道具有開放作用。
[0078]5)薑黃素對BK通道蛋白降解途徑的抑制作用
[0079]實驗方法:Cycloheximide_basedprotein chase 實驗
[0080]肥(293細胞轉染後2處，預給藥薑黃素(10^) 12小時後，加入蛋白合成抑制劑Cycloheximide (CHX)0分別於CHX作用細胞0、3、6、12、24h後，收集細胞，提取蛋白進行Western Blot 實驗。
[0081]實驗結果顯示，與對照組相同作用時間節點相比，實驗組BK通道蛋白量明顯增多。用AlphaEaseFC軟體對3次實驗結果進行光密度測定，用Excel繪製平均BK蛋白量-時間趨勢圖，實驗組曲線下降趨勢比對照組緩慢。表明薑黃素可降低了 BK通道蛋白的降解速率，增加BK通道蛋白的穩定性。
【權利要求】
1.薑黃素在製備大電導鈣激活鉀通道開放劑中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的薑黃素增加大電導鈣激活鉀通道的總蛋白和表面蛋白表達。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的薑黃素增加大電導鈣激活鉀通道的電流。
4.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的薑黃素抑制大電導鈣激活鉀通道蛋白降解，增加該蛋白的穩定性。
5.大電導鈣激活鉀通道開放劑在製備治療平滑肌功能紊亂相關疾病的藥物中的用途，所述的大電導鈣激活鉀通道開放劑中以薑黃素為活性成分。
6.根據權利要求5所述的用途，其特徵在於，所述的平滑肌功能紊亂相關疾病選自膀胱過度活動症 或胃蠕動過強症。
【文檔編號】A61P1/00GK103933020SQ201310023700
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2013年1月22日
【發明者】張雪梅, 彭文, 陳啟菁, 王雲滿, 付文成, 王利, 王浩 申請人:復旦大學