預防再激活的結核病tb疫苗的製作方法

2023-10-11 21:02:19 3

預防再激活的結核病tb疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明公開可向潛伏感染個體施用以預防結核病複合群微生物物種（結核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis）、牛分枝桿菌（M.bovis）、非洲分枝桿菌（M.africanum））引起的潛伏結核病感染的再激活的疫苗或者免疫原性組合物。本發明是基於在感染的不同階段組成型表達的大量結核分枝桿菌來源的蛋白和蛋白片段。本發明涉及這些多肽、其免疫活性片段和編碼它們的基因用於免疫組合物諸如疫苗的用途。
【專利說明】預防再激活的結核病TB疫苗
[0001] 本申請是申請日為2010年4月23日，申請號為"201080017717. 7"，發明名稱為 "預防再激活的結核病TB疫苗"的申請的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明公開可向潛伏感染個體施用以通過靶向組成型表達的抗原諸如ESAT6、 CFP10和來自ESX-1分泌系統的其他抗原而預防結核病複合群微生物（tuberculosis complex microorganisms)物種（結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆 菌(M. bovis)、非洲分枝桿菌（M. africanum))引起的潛伏結核病感染的再激活的疫苗。
[0003] -般背景
[0004] 由結核分枝桿菌（M. tuberculosis)引起的人類結核病是一個嚴重的全球性健康 問題，根據WH0,其造成每年約3百萬人死亡。在二十世紀60年代和70年代期間，全世界新 的結核病（TB)病例發生率已經處於下降中，但在近十年中，部分由於AIDS的來臨和結核分 枝桿菌的多藥抗性菌株的出現，這種趨勢已經發生明顯的改變。
[0005] 結核病複合群（tuberculosis complex)的生物體可引起多種疾病，但最常見的侵 入途徑是通過吸入細菌。這在肺中開始感染，最終可擴散到身體其他部位。通常，這種感染 在生長方面被免疫系統限制，使得大多數感染個體除了最終減退的咳嗽和發熱以外顯示極 少的體徵。大約30%的個體不能容納感染，將發展原發性疾病，這在許多情況中最終將是致 命的。然而，認為甚至表面上控制感染的那些個體仍保持被感染，很可能持續其餘生。當然， 已經健康了數年或甚至數十年的個體可能突然發展結核病，該結核病被證明是多年前其感 染的相同生物體引起的。結核分枝桿菌和TB複合群的其他生物體的獨特之處在於，分枝杆 菌可躲避免疫應答，以難治的非複製或緩慢複製期存活長時間。這稱為潛伏TB，目前是非常 嚴重的全球性健康問題，估計影響全世界人群的大約1/3 (Anon.，2001)。
[0006] 目前唯一可供臨床使用的疫苗是BCG，該疫苗的效力仍然有些爭議。雖然BCG在原 代感染的動物模型中一直表現良好，但它顯然未能控制TB流行。與此一致，BCG接種表現 為提供抵抗兒科TB (由於原代感染）的保護，而對抵抗成年疾病(通常是童年獲得的潛伏感 染的再激活)提供極小或沒有保護。還已顯示，向目前對分枝桿菌敏感或潛伏感染的個體接 種疫苗是無效的。
[0007] 結核分枝桿菌感染的過程主要經歷3個時期，如圖1所示。在急性期，細菌在器官 中增殖，直到免疫應答增強到其可控制感染的點，此時細菌負荷（bacterial load)達到峰 值並開始下降。此後，在細菌負荷穩定維持在低水平時形成潛伏期。在這個時期，目前認為 結核分枝桿菌由活躍的增殖趨於休眠期，基本上轉變為非複製狀態並維持在肉芽腫內。
[0008] 然而，近來已經變得明顯的是，即使在特徵為恆定的低細菌數目的感染階段，至少 部分細菌群體仍保持活性代謝的狀態（Talaat AM等2007)。因此，儘管有強的免疫應答，這 些細菌存活，保持活性代謝和複製。所以，在感染個體中，存在非複製細菌（因為位於胞內， 免疫系統可能難以檢測到）與緩慢複製細菌之間的平衡，所述緩慢複製細菌具有活性但改 變的表達譜，試圖適應在免疫宿主中遇到的敵對環境。處於這一階段的細菌通常不被TB領 域中目前正開發的大多數預防性疫苗所靶向，例證是當典型的預防性疫苗被提供給潛伏感 染的實驗動物時缺乏活性（Turner2000 )。
[0009] 在一些情況中，由於病原菌和感染進入再激活階段，這一平衡被傾斜，在再激活階 段細菌開始快速複製並且感染個體中的細菌數目增加。在潛伏感染個體中、在非常強的免 疫壓力下複製的細菌是本發明接種策略的靶。處於這一潛伏感染階段的細菌通常不被TB 領域中目前正開發的大多數預防性疫苗所靶向，例證是當預防性疫苗被提供給潛伏感染的 實驗動物時缺乏活性（Turner等2000)。這不令人驚訝，因為現在已知強的宿主免疫應答導 致許多抗原諸如主要預防性疫苗抗原Ag85和PstS的下調（Rogerson, BJ等2006)。對於 Ag85B，已經顯示，在感染後存在Ag85B表達的最初短暫增加，但在感染後2周，細菌Ag85B 表達水平已經從峰值期間的0. 3轉錄子/CFU結核分枝桿菌下降到0. 02轉錄子/CFU，且這 一低水平在感染後持續至少達100天。因此在感染後2周的任何時間點，少於2%的細菌積 極地表達Ag85B (同前)。Ag85B的低表達由以下支持：感染後3周或之後肺中能夠響應於 Ag85B產生IFN-g的T細胞數目快速下降。
[0010] 相反，一些抗原貫穿不同感染階段更穩定地(組成型)表達，一個實例是ESAT6。在 最初感染階段後，ESAT-6表達水平穩定在0. 8轉錄子/CFU結核分枝桿菌。這是比Ag85B 高得多的轉錄水平，這一水平穩定地保持達感染後至少100天（Rogerson, BJ等2006)。再 一次地，轉錄數據被免疫數據支持，免疫數據顯示在感染後期階段在感染部位，T細胞對 ESAT-6的強的識別（同前)。這一組成型表達模式是個重要特徵，說明這些分子實現對於病 原體至關重要的必需功能，這些功能依賴於需要組成型表達以使病原體在免疫宿主中存活 的基因。這些分子是本發明的基礎，對於向潛伏感染個體施用的疫苗是尤其重要的抗原，因 為它們靶向細菌生命周期的所有階段，因而具有儘可能寬的活性基礎。這與集中於鑑定在 非複製持續期間被分枝桿菌上調的抗原的現有思路不同（Andersen，P. 2007、W002048391、 W004006952、Lin MY 和 Ottenhoff TH2008;Leyten EM.等 2006)。儘管這些抗原在非複製 持續期間被上調，它們可能不總是免疫識別可獲得的，因為從非複製細菌可獲得的量低於 檢測或觸發保護性免疫效應功能的合理閾值。
[0011] 相反，來自ESX-1分泌系統的多種蛋白已經顯示為高度免疫原性和以高水平表 達。ESX-1在多種病原性分枝桿菌中是保守的，並參與結核桿菌（tubercle bacilli)的 毒性。個體ESX-1蛋白在分泌ESAT-6、CFP10和EspA中的貢獻已被充分記載（Pym AS等 2003 ;Guinn ΚΙ 等，2004 ;Stanley, SA 等 2003 ;Brodin, Ρ·等 2006 ;MacGurn JA 等 2005 ; Raghavan，S.等2008)，效應分子的功能已顯示為膜裂解，從吞噬體逃逸和細菌擴散（Gao LY 等 2004;Smith J.等 2008)。
[0012] 控制潛伏性感染的免疫應答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。 然而，有一些證據證明與主導細胞類型的轉變有關。雖然CD4T細胞對急性期的感染控 制是必要的和足夠的，但研究揭示⑶8T細胞反應在潛伏期更為重要（van Pinxteren LA 等·2000)。
[0013] 本領域的技術人員將會容易地理解，一種基因的表達不足以使其成為一種好的候 選疫苗。確定一種蛋白在結核分枝桿菌潛伏感染期間是否被免疫系統識別的唯一方法是制 備出這種給定的蛋白，並按照這裡描述的適當試驗對該蛋白進行測試。在這方面，我們的研 究組已經證實，被分枝桿菌強表達的抗原諸如ESAT-6 (早期分泌抗原靶-6)在所有感染階 段個體中被識別，事實上尤其在潛伏感染個體中被識別（Boesen, Ravn, Doherty2002)。然而 在自然感染期間引發的ESAT-6特異性T細胞雖然可能大量存在，但作為抵抗傳染病的保護 性Τ細胞，它們幾乎全部是所謂的效應表型，即具有非常有限的壽命和低活性的終末分化Τ 細胞（Seder R，等2008)。這顯著不同於本研究中證實的防止ΤΒ的再激活的疫苗促進的高 質量、所謂的多功能T細胞。
[0014] 它遠不同於可用作接觸後疫苗的所有高表達和免疫原性的蛋白，因為許多這種蛋 白將引發超敏反應，反而惡化情況。這在Kock的原始結核菌素疫苗的臨床試驗中清楚地證 實。疫苗作為接觸後疫苗向患有不同形式疾病包括皮膚TB和肺部TB的患者提供。試驗完 全失敗，參與的幾個患者因為嚴重的超敏反應而死亡（Guttstadt A. 1891)。在數百種已知 在初次感染期表達並作為疫苗被測試的抗原中，少於半打的抗原表現出明顯的潛力。迄今 為止僅有一種抗原已經被證實具有作為接觸後疫苗的所有潛質（Lowrie, 1999)。然而這個 疫苗僅在作為DNA疫苗（目前還未被批准用於人類的實驗技術）施用時起作用。而且，該技 術被證明是有爭議的，因為有其它研究組聲稱使用該方案接種疫苗誘導了非特異性的保護 或甚至使疾病惡化（Turner, 2000)。
[0015] 因此，防止感染個體的疾病再激活的有效接觸後接種策略是高度期望的。
[0016] 發明概述
[0017] 本發明涉及由可向潛伏感染個體施用以通過靶向組成型表達的抗原諸如ESAT6、 CFP10和EspA預防結核病複合群微生物物種（結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌） 引起的潛伏結核病感染的再激活的疫苗治療結核病複合群物種（結核分枝桿菌、牛分枝杆 菌、非洲分枝桿菌)引起的感染。ESAT6、CFP10和EspA相互依賴地都是分泌所需的，都屬於 已知是毒性必需的ESX-1分泌系統。這些分泌的抗原對於細菌散播和裂解細胞膜是決定性 的。ESAT6、CFP10和EspA也是在疾病不同階段組成型表達的抗原-而例如Ag85的表達在 感染後立刻被下調。令人驚訝地，免疫原性、組成型表達的抗原當作為接觸後疫苗施用時預 防潛伏結核病感染的再激活，從而保持感染潛伏。
[0018] 本發明的第一方面涉及一種疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或免疫原性組合物 接觸後地施用於潛伏感染個體，預防結核病的再激活，所述疫苗或免疫原性組合物包含在 結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染期間組成型表達的抗原或編碼所述抗原的核酸。
[0019] 在一些實施方案中，所述組成型表達的抗原可屬於ESX-1分泌系統，選自以下組 成的組：
[0020] i)SEQ ID N0. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、32、33 和 34 ;
[0021] ii) (i)中任一序列的免疫原性部分，如，T細胞表位；和
[0022] iii)與⑴或（ii)中任一序列具有至少70%序列同一性且同時具有免疫原性的 胺基酸序列類似物。
[0023] 在一些實施方案中，所述組合物可包含免疫原性部分的混合物，諸如2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12或13種免疫原性部分的混合物。
[0024] 在一些實施方案中，所述抗原選自以下組成的組：SEQ ID N0. 19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30 和 31。
[0025] 在一些實施方案中，所述多肽可與分枝桿菌科的細菌表達的抗原融合。
[0026] 在一些實施方案中，所述融合配偶體可以是組成型表達的抗原。
[0027] 在一些實施方案中，所述組合物可包含與CFP10融合的ESAT6。
[0028] 在一些實施方案中，所述組合物可包含選自以下的另外的遞送系統：活的重組疫 苗，即基因修飾的生物體諸如表達分枝桿菌基因的細菌或病毒；免疫原性遞送系統，諸如 DNA疫苗，即表達上述蛋白的基因或基因片段的質粒；蛋白疫苗，即在遞送系統諸如佐劑中 遞送的蛋白本身或來源於蛋白本身的合成肽。
[0029] 在一些實施方案中，所述佐劑可包含DDA/TDB和/或聚I:C。
[0030] 在一些實施方案中，所述胺基酸序列可被脂化以允許所述多肽的自佐劑作用。
[0031] 本發明的第二方面涉及一種選自以上第一方面中定義的組的抗原，所述抗原用於 治療潛伏結核病。
[0032] 本發明的第三方面涉及一種治療動物包括人類的由毒性分枝桿菌，例如，由結核 分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)或 牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)引起的結核病感染的再激活的方法，所述方法包括向 動物施用本申請第一方面的疫苗或免疫原性組合物。
[0033] 在一些實施方案中，所述疫苗或免疫原性組合物可在感染後諸如急性感染階段期 間或急性感染階段之後和/或潛伏感染階段期間施用。
[0034] 在一些實施方案中，所述方法可包括鑑定潛伏感染毒性分枝桿菌的受治療者的步 驟。
[0035] 在一些實施方案中，所述潛伏感染毒性分枝桿菌的受治療者可以以諸如以下的診 斷方案鑑定：Mantoux結核菌素皮膚試驗（TST)、Quantiferon試驗、體外檢測對HBHA的響 應或在以組成型表達的抗原刺激後檢測IP10。
[0036] 本發明的第四方面涉及選自以上第一方面中定義的組的抗原用於製備接觸後疫 苗的用途，所述接觸後疫苗抵抗由結核病複合群的物種如結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非 洲分枝桿菌引起的潛伏感染的再激活。
[0037] 在一些實施方案中，所述疫苗可以是用於感染後諸如急性感染階段期間或急性感 染階段之後和/或潛伏感染階段期間施用。
[0038] 在一些實施方案中，所述疫苗可包含以上第一方面中定義的免疫原性部分。
[0039] 發明詳述
[0040] 本發明公開一種疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或免疫原性組合物接觸後地施 用於潛伏感染個體，預防結核病的再激活，所述疫苗或免疫原性組合物包含在結核分枝杆 菌感染期間組成型表達的抗原或編碼所述抗原的核酸。
[0041] 優選地所述組合物包含屬於ESX-1分泌系統的組成型表達的抗原，ESAT6 (SEQ ID NO. D.CFP10 (SEQ ID NO. 2),EspA (SEQ ID NO. 3),Rv3614c (SEQ ID NO. 4),Rv3615c (SEQ ID NO. 5),EspR (SEQ ID NO. 6), Rv3868 (SEQ ID NO. 7), Rv3869 (SEQ ID NO. 8), Rv3870 (SEQ ID NO. 9), Rv3871 (SEQ ID NO. 10), Rv3872 (SEQ ID NO. 11), Rv3873 (SEQ ID NO. 12)、Rv3876 (SEQ ID NO. 13)、Rv3877 (SEQ ID NO. 14)、Rv3878 (SEQ ID NO. 15)、 Rv3879c (SEQ ID NO. 16)、Rv3880c (SEQ ID NO. 17)、Rv3881c (SEQ ID NO. 18)、Rv3882c (SEQ ID N032)、Rv3883c (SEQ ID N033)、Rv3865c (SEQ ID N034);或這些序列中任一序 列的免疫原性部分，如T細胞表位；或與任一序列具有至少70%序列同一性且同時具有免疫 原性的胺基酸序列類似物。
[0042] 可選地，所述組合物包含免疫原性部分的混合物，所述免疫原性部分優選地選自 以下組成的組：SEQ ID Ν0·19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 和 31。
[0043] 本發明的另一實施方案是組合物，其中所述多肽與分枝桿菌科的細菌表達的抗原 融合，優選地其中所述融合配偶體是組成型表達的抗原。優選的融合蛋白包含與CFP10融 合的ESAT6。
[0044] 根據本發明的組合物優選地包含選自以下的另外的遞送系統：活的重組疫苗，即 基因修飾的生物體諸如表達分枝桿菌基因的細菌或病毒；免疫原性遞送系統，諸如DNA疫 苗，即表達上述蛋白的基因或基因片段的質粒；蛋白疫苗，即在遞送系統諸如佐劑中遞送的 蛋白本身或來源於蛋白本身的合成肽。佐劑優選地選自以下組成的組：二甲基雙十八烷基 溴化銨（dimethyldioctadecylammonium bromide) (DDA)、Quil Α、聚 I:C、氫氧化錯、弗氏 不完全佐劑、IFN-γ、IL-2、IL-12、單磷醯脂質A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯（TDM)、海藻糖二 山嵛酸酯（dibehenate)和胞壁醯二肽（MDP)，最優選地促進多功能T細胞應答的佐劑諸如 DDA/TDB和IC31。最優選的佐劑包含DDA/TDB和/或聚I :C。可選地所述胺基酸序列被脂 化以允許所述多肽的自佐劑作用（self-adjuvanting effect)。
[0045] 本發明還公開用於治療潛伏結核病和預防感染的再激活的上述抗原。
[0046] -種治療動物包括人類的由毒性分枝桿菌，如，由結核分枝桿菌、非洲分枝桿菌或 牛分枝桿菌引起的結核病感染的再激活的方法，所述方法包括向動物施用上述的疫苗或免 疫原性組合物，其中所述疫苗或免疫原性組合物在感染後，諸如急性感染階段期間或急性 感染階段之後和/或潛伏感染階段期間施用。
[0047] 所述方法可包括如以諸如以下的診斷方案鑑定潛伏感染毒性分枝桿菌的受治療 者的步驟：Mantoux結核菌素皮膚試驗（TST)、Quantiferon試驗、體外檢測對HBHA的響應 或以組成型表達的抗原刺激後檢測IP10。
[0048] 本發明還公開上述抗原用於製備接觸後疫苗或免疫原性組合物的用途，所述接觸 後疫苗或免疫原性組合物抵抗由結核病複合群物種如結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非洲分 枝桿菌引起的潛伏感染的再激活，其中所述疫苗或免疫原性組合物是用於感染後諸如急性 感染階段期間或急性感染階段之後和/或潛伏感染階段期間施用並包含一種或多種上述 的免疫原性部分。
[0049] 分枝桿菌作為病原體的成功是因為它與其宿主相互作用的複雜和精巧方式-部 分地由專門的ESX-1細菌蛋白-分泌系統控制的過程。ESX-1系統遞送細菌蛋白（例如 ESAT-6、CFP10和EspA)到宿主細胞，這對於毒性是關鍵的。從桿菌分泌後，ESAT-6蛋白在 吞噬體膜上形成孔，允許桿菌逃離吞噬體限制而進入胞質，從而促進細胞間擴散。
[0050] 組成型表達模式是個重要特徵，說明這些分子實現對於病原體至關重要的必需功 能，這些功能依賴於需要組成型表達以使病原體在免疫宿主中存活的基因。這些分子是本 發明的基礎，對於向潛伏感染個體施用的疫苗是尤其重要的抗原，因為它們靶向細菌生命 周期的所有階段，因而具有儘可能寬的活性基礎。
[0051] ESAT6、CFP10和EspA相互依賴地都是分泌所需的，都屬於已知是毒性必需的 ESX-1分泌系統。這些分泌的抗原對於細菌散播和裂解細胞膜是決定性的。ESAT6、CFP10 和EspA也是在疾病不同階段組成型表達的抗原-而例如Ag85的表達在感染後立刻被下 調。免疫原性、組成型表達的抗原當作為治療疫苗施用時預防潛伏結核病感染的再激活，從 而保持感染潛伏。
[0052] 定義
[0053] 多功能T細胞
[0054] 術語多功能T細胞被理解為同時表達所有細胞因子IFN-Y、IL-2和TNF-α，或 IL-2加另外兩種細胞因子IFN- γ和TNF- a的至少一種的T細胞。
[0055] 多肽
[0056] 單詞"多肽"在本發明中具有其通常的含義。即任何長度的胺基酸鏈，包括全長蛋 白、寡肽、短肽及其片段，其中胺基酸殘基經由共價的肽鍵連接。
[0057] 多肽可以是經化學修飾的，被糖基化、脂化(例如Mowat等1991年所述的用棕櫚醯 基氧基琥拍醯亞胺或Lustig等1976年所述的用十二燒醯氯化學脂化（lipidation))、包含 輔基或者包含另外的胺基酸如組氨酸標籤或信號肽。
[0058] 因此，每一多肽可由具體的胺基酸表徵並由具體的核酸序列編碼。應理解，這種序 列包括重組或合成方法製備的類似物和變體，其中這種多肽序列已經通過重組多肽中一個 或多個胺基酸殘基的取代、插入、添加或者缺失而被修飾，但在這裡所描述的任何生物檢測 中仍具有免疫原性。取代優選是"保守性的"。這些保守性取代根據下表定義。在第二列相 同單元格裡的胺基酸和優選在第三列相同行中的胺基酸，可以彼此取代。第三列中的氨基 酸由單字母代碼表示。
[0059]
【權利要求】
1. 一種疫苗，所述疫苗施用於潛伏感染個體，預防結核病的再激活，所述疫苗包含在結 核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染期間組成型表達的抗原或編碼所述抗原的核酸，其中所 述抗原是： i) SEQ ID NO. 4 或 ii) SEQ ID NO. 4的T細胞表位。
2. 如權利要求1所述的疫苗，其中所述抗原與分枝桿菌科的細菌組成型表達的抗原融 合。
3. 如權利要求2所述的疫苗，所述疫苗包含與CFP10融合的ESAT6。
4. 如前述權利要求任一項所述的疫苗，所述疫苗包含遞送系統。
5. 如權利要求4所述的疫苗，其中所述遞送系統是佐劑。
6. 如權利要求5所述的疫苗，其中所述佐劑包含DDA/TDB和/或聚I:C。
7. 如前述權利要求1-3中任一項所述的疫苗，其中所述胺基酸序列被脂化以允許所述 多肽的自佐劑作用。
8. 如權利要求4所述的疫苗，其中所述胺基酸序列被脂化以允許所述多肽的自佐劑作 用。
9. 如權利要求5所述的疫苗，其中所述胺基酸序列被脂化以允許所述多肽的自佐劑作 用。
10. 如權利要求6所述的疫苗，其中所述胺基酸序列被脂化以允許所述多肽的自佐劑 作用。
11. 如權利要求1-10任一項中定義的疫苗，所述疫苗用於治療潛伏結核病。
12. 權利要求1-4任一項中定義的抗原或編碼所述抗原的核酸在製備用於治療動物包 括人類的由毒性分枝桿菌引起的結核病感染的再激活的疫苗中的用途，其中所述疫苗施用 於所述動物。
13. 如權利要求12所述的用途，其中所述疫苗在急性感染階段之後和/或潛伏感染階 段期間施用。
14. 選自權利要求1-10任一項中定義的組的抗原用於製備疫苗的用途，所述疫苗抵抗 由結核病複合群的物種引起的潛伏感染的再激活。
15. 如權利要求14所述的用途，其中所述結核病複合群的物種選自由結核分枝桿菌、 牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌組成的組。
16. 如權利要求14所述的用途，其中所述疫苗是用於急性感染階段之後和/或潛伏感 染階段期間施用。
17. 如權利要求14-15任一項所述的用途，其中所述疫苗包含一種或多種權利要求1-3 中定義的抗原。
【文檔編號】A61P31/04GK104107425SQ201410141208
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2010年4月23日 優先權日:2009年4月24日
【發明者】J·迪特裡希, 彼得·安德森, 卡裡納·溫斯波·倫德貝裡, 特呂克·蒂·吉姆·坦·候昂 申請人:國立血清研究所