低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法
2023-10-11 19:17:49
專利名稱：低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法
技術範圍本發明涉及對動脈硬化症臨床診斷很重要的低密度脂蛋白(LDL)中膽固醇(下面稱為「LDL膽固醇」。本說明書中單獨說「膽固醇」的時候包括酯型膽固醇和游離型膽固醇兩者。)的分別定量方法。
背景技術：
LDL在血液中主要起著運輸膽固醇的作用，在動脈粥樣硬化中血管壁沉積的膽固醇主要是來源於LDL。血漿中LDL的增加是缺血性心臟病等粥樣硬化性疾病的主要危險因子之一，所以LDL膽固醇的分別定量在臨床上很有用。
傳統的LDL膽固醇定量方法包括由分離操作和膽固醇定量操作兩個步驟組成的方法，以及分別求出血中總膽固醇、HDL中的膽固醇和甘油三酯並根據Friedewald公式算出LDL膽固醇量的方法。
分離操作有超速離心法、沉澱法、免疫化學法等。使用超速離心法時，利用比重差以超速離心機分離LDL，然後測定膽固醇量。沉澱法是加入HDL抗體、多價陽離子和2價陽離子等，使之生產不溶性沉澱，定量離心分離所得上清中LDL膽固醇的方法(WPI Acc No.85-116848/20)。免疫化學法是將抗HDL、VLDL、CM的抗體結合於膠乳，凝集反應後用離心或過濾的方法除去膠乳，從而定量LDL膽固醇的方法(WPI Acc No.84-301275/49)。這些傳統方法都有簡便性和經濟性的問題。
根據Friedewald公式，從總膽固醇中減去HDL膽固醇，再減去甘油三酯的1/5量，求出LDL膽固醇。但是，此方法受飲食和個體差異的影響，所以有正確性的問題。
此外，近年來報導有不需要分離操作的LDL膽固醇定量方法(WPIAcc No.83-766269/38)，但對LDL的特異性不高。
發明的公開本發明的目的在於提供無需複雜離心分離操作、能簡便地分別定量LDL膽固醇的方法。
本發明者們發現，第一步先除去除低密度脂蛋白中膽固醇以外的膽固醇，第二步測定殘留的膽固醇，能夠定量低密度脂蛋白中的膽固醇，從而完成了本發明。
即，本發明提供了一種可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被測樣品中低密度脂蛋白的膽固醇的定量方法，它由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨後定量被測樣品中殘留膽固醇的第二步驟組成。
根據本發明，提供了無需複雜的離心分離操作，能夠簡便地分別定量LDL膽固醇的方法。
圖的簡單說明
圖1表示在實施例1中LDL膽固醇的測定結果和Friedewald算出值的相關關係。
圖2表示在實施例2中LDL膽固醇的測定結果和Friedewald算出值的相關關係。
圖3表示在實施例4中，不存在及存在HDL、VLDL和CM的情況下LDL膽固醇濃度和根據本發明方法測定所得吸光度的相關關係。
發明實施的最佳形式作為脂蛋白中所含的膽固醇，有酯型膽固醇(膽固醇酯)和游離型膽固醇。在本說明書中，單獨說「膽固醇」的時候同時包括二者。
作為用於本發明方法的被測樣品，可以是可能含有HDL、LDL、VLDL和CM等脂蛋白的樣品中的任一種，例如有血液、血清、血漿等體液及其稀釋物，但並不僅限於此。
本發明的方法由第一步驟和第二步驟構成，在第一步驟中除去被測樣品中HDL、VLDL和CM中的膽固醇，在隨後的第二步驟中定量被測樣品中殘留膽固醇。因為在第一步驟中除去了HDL、VLDL和CM中的膽固醇，第二步驟定量的膽固醇主要是樣品中LDL中的膽固醇。
第一步中的「除去」指的是分解膽固醇，而且其分解產物在隨後的第二步中不被檢出。作為選擇性除去LDL以外的脂蛋白，即HDL、VLDL、CM等中所含的膽固醇的方法例如有以下的方法。
即，在作用於低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑的存在下，用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進行作用，除去產生的過氧化氫。
作為除去過氧化氫的方法，例如有用過氧化氫酶進行作用將其分解成水和氧的方法，以及使用過氧化物酶使酚類或苯胺類氫供體化合物和過氧化氫反應轉化為無色醌類的方法，但並不僅限於此。
第一步反應液中的膽固醇酯酶濃度優選0.2～1.0U/毫升，作為其來源，優選假單胞菌屬細菌產生的物質。此外，膽固醇氧化酶的濃度優選0.1～0.7U/毫升，優選使用細菌和酵母來源的物質。更進一步，過氧化氫酶的濃度優選40～100U/毫升。此外，過氧化氫轉化為無色醌類時的過氧化物酶濃度優選0.4～1.0U/毫升，作為酚類或苯胺類氫供體化合物的濃度，優選0.4～0.8mmol/L。
作為第一步中所用的作用於LDL以外的脂蛋白的表面活性劑的優選例子，例如有HLB為13以上15以下、優選13以上14以下的聚氧化烯衍生物。作為衍生物的例子例如有高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪醯胺縮合物、高級烷胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物、烷基酚縮合物等。還有，表面活性劑的HLB計算方法眾所周知，例如《新表面活性劑》(掘內博著、昭和61年、三共出版社)中記載的。
作為HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物的優選具體例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB值為13以上15以下的化合物，但並不僅限於此。
此外，作為第一步所用的表面活性劑，可以使用陽離子表面活性劑。作為此時的陽離子表面活性劑，優選下述一般式(I)所示的具有季銨鹽作為親水基團的物質。
其中式(I)中，R分別各自獨立地表示碳數1～8的直鏈烷基，R1表示碳數3～20的烯基。
第一步中所用的上述表面活性劑的濃度優選0.1～10克/升左右，更優選0.5～5.0克/升左右。
第一步優選在pH5～8的緩衝液中進行，作為緩衝液優選Tris、三乙醇胺、Good’s等含有胺的緩衝液。特別優選作為Good’s的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO緩衝液，緩衝液的濃度優選10～500mM。
在第一步中，為抑制和LDL的反應並提高其它脂蛋白的除去程度，反應液中可含有2價的金屬離子。作為2價的金屬離子，例如可以使用銅離子、鐵離子和鎂離子等，特別優選鎂離子。2價金屬離子的濃度優選5～200mM。
還有，在第一步的反應液中，可任意地加入脂蛋白分解酶。因特別可使VLDL中的膽固醇容易反應，優選加入這種酶。此酶在反應液中的濃度優選5.0～10.0U/毫升。
第一步的反應液溫度優選25～40℃左右，最優選37℃。此外，反應時間可以是2～10分鐘左右。
在隨後的第二步中，定量被測樣品中的殘留膽固醇。例如可以通過至少加入作用於LDL的表面活性劑，定量如第一步中加入的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用生成的過氧化氫而進行。在這裡，至少作用於LDL的表面活性劑可以是只選擇性作用於LDL的表面活性劑，也可以是作用於所有脂蛋白的表面活性劑。
作為作用於所有脂蛋白的表面活性劑的優選例子，例如有HLB11以上不足13、優選12以上不足13的聚氧化烯衍生物。作為衍生物的例子，例如有高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪醯胺縮合物、高級烷胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物、烷基酚縮合物等。
作為HLB11以上不足13的聚氧化烯衍生物的優選例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB11以上不足13的化合物，但並不僅限於此。
此外，作為僅選擇性作用於LDL的表面活性劑，例如有陰離子表面活性劑。作為這裡所用的陰離子表面活性劑，沒有特殊的限定，優選芳香環上結合有碳數4～18的直鏈或支鏈烷基的物質。在這裡，芳香環優選苯、萘、聯苯等只由碳氫構成的物質。更優選上述芳香環中結合有如磺酸鹽等親水基團的物質。這樣的優選陰離子表面活性劑的例子如下述式(II)～(VI)所示。
其中在式(II)～(VI)中，R分別各自表示碳數4～18的直鏈或直鏈烷基。此外，作為第二步中所用的優選陰離子表面活性劑，例如有高級醇硫酸鈉等。
第二步所用的表面活性劑的濃度優選0.1～100克/升，更優選1～50克/升。
第二步的其它優選反應條件和第一步中的優選反應條件相同。
下面就基於實施例對本發明進行具體的說明。但本發明並不僅限於這些實施例。實施例1第1試劑BES緩衝液、pH6.0 100mmol/LHDAOSN-(2-羥基磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺 0.7mmol/L假單胞菌屬細菌來源膽固醇酯酶(旭化成工業社製造，商品名「CEN」) 0.8U/毫升鏈黴菌屬細菌來源膽固醇氧化酶(東洋紡織社製造，商品名「COO」)0.5U/毫升過氧化氫酶 80U/毫升氯化鎂 10mmol/L花王社製造的Emulgen B66(聚氧乙烯衍生物(HLB＝13.2))0.2％第2試劑BES緩衝液、pH7.0 50mmol/L4-氨基安替比林 4.0mmol/L過氧化物酶 2.4單位/毫升疊氮化鈉 0.1％花王社製造的Emulgen A60(聚氧乙烯衍生物(HLB＝12.8))5.0％分別將含有膽固醇濃度為100毫克/dl的精製HDL、LDL、VLDL、CM的各4微升樣品和預先37℃加溫的300微升第1試劑混合，在37℃下反應5分鐘後，加入100微升第2試劑反應5分鐘，測定600nm處的吸光度。從所測定的吸光度算出膽固醇量，並和樣品中的膽固醇量相比算出捕捉率。結果如下表所示。表1
如表2所示，根據上述方法，當其它脂蛋白中的膽固醇基本不被捕捉而LDL中膽固醇的大部分可被捕捉，因此LDL中的膽固醇可以被選擇地定量。實施例2第1試劑PIPES緩衝液、pH7.050mmol/LHDAOS 0.7mmol/L假單胞菌屬細菌來源膽固醇酯酶(旭化成工業社製造，商品名「CEN」) 0.8U/毫升鏈黴菌屬細菌來源膽固醇氧化酶(東洋紡織社製造，商品名「COO」) 0.5U/毫升過氧化氫酶80U/毫升氯化鎂10mmol/L花王社製造的Emulgen B66 0.2％第2試劑PIPES緩衝液、pH7.050mmol/L4-氨基安替比林4.0mmol/L過氧化物酶2.4單位/升疊氮化鈉 0.1％Triton×100 3.0％進行和實施例1相同的操作，求出各脂蛋白的反應性。結果如下表2所示。表2
實施例3試樣使用健康人血清，進行實施例1、2的操作，求出LDL膽固醇濃度。作為對照方法，用Friedewald公式(CLIN.CHEM.、41、1414、1995)求出血清的LDL膽固醇濃度。其結果如圖1和圖2的相關圖所示。
如圖1和圖2所示，根據兩種方法定量的結果很一致，說明本發明的方法能夠正確地定量LDL中的膽固醇。實施例4第1試劑Good’s緩衝液、pH7.050mmol/lHDAOS 0.7mmol/l膽固醇酯酶 0.8U/毫升膽固醇氧化酶0.5U/毫升過氧化氫酶 80單位/毫昇陽離子表面活性劑(氯化月桂基三甲基銨)0.1％第2試劑4-氨基安替比林 4.0mmol/l過氧化物酶 2.4單位/毫升疊氮化鈉0.1％非離子表面活性劑(聚氧乙烯月桂醚)0.1％(非離子表面活性劑在第2反應中使用)將20微升試樣和180微升預先加熱到37℃的第1試劑混合，在37℃下下反應5分鐘後，加入60微升第2試劑，反應5分鐘，在600nm下測定吸光度。
圖3表示LDL膽固醇濃度和吸光度的關係，表明即使在HDL、VLDL和CM存在下也能夠特異性且濃度依賴性地測定LDL膽固醇。
實施例5試樣使用血清，進行實施例4的操作，求出LDL膽固醇濃度。作為對照方法，使用Friedewald公式(CLIN.CHEM.，41，1414，1995)求出血清中LDL膽固醇的濃度。其結果如表3所示。如表3所示，根據本發明方法的結果和根據Friedwald公式所得的結果具有良好的相關性。
權利要求
1.一種可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被測樣品中低密度脂蛋白中的膽固醇的定量方法，它由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨後定量被測樣品中殘留的膽固醇的第二步驟組成。
2.根據權利要求1記載的方法，其中的第一步驟是在作用於低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑的存在下，用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進行作用，除去生成的過氧化氫。
3.根據權利要求2記載的方法，上述第二步驟是往上述第一步驟的產物中加入至少作用於低密度脂蛋白的表面活性劑，定量上述膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用所生成的過氧化氫。
4.根據權利要求3記載的方法，上述至少作用於低密度脂蛋白的表面活性劑為作用於所有脂蛋白的物質。
5.根據權利要求1～4任一項記載的方法，上述第一步驟所用的作用於除低密度脂蛋白以外脂蛋白的表面活性劑為HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物。
6.根據權利要求4記載的方法，上述第二步驟所用的作用於所有脂蛋白的表面活性劑為HLB值11以上13以下的聚氧化烯衍生物。
7.根據權利要求2記載的方法，上述第一步驟所用的作用於除低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑為陽離子表面活性劑。
8.根據權利要求7記載的方法，上述陽離子表面活性劑為季銨鹽。
9.根據權利要求3記載的方法，上述第二步驟所用的至少作用於低密度脂蛋白的表面活性劑為陰離子表面活性劑。
10.根據權利要求2～9任一項記載的方法，上述第一步驟中表面活性劑的濃度為0.1～10克/升。
11.根據權利要求6或9記載的方法，上述第二步驟中HLB值11以上13以下的上述聚氧化烯衍生物或上述陰離子表面活性劑的濃度為1～100克/升。
12.根據權利要求1～11任一項記載的方法，上述第一步驟和第二步驟在pH5～8的緩衝液中進行。
13.根據權利要求12記載的方法，上述緩衝液中含有胺。
14.根據權利要求1～13任一項記載的方法，上述第一和第二步驟在溫度25～40℃下進行。
全文摘要
本發明公開了無需複雜離心操作、能夠簡單地分別定量LDL膽固醇的方法。本發明的低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨後定量被測樣品中殘留膽固醇的第二步驟構成。
文檔編號G01N33/92GK1253627SQ97182112
公開日2000年5月17日 申請日期1997年10月13日 優先權日1997年4月14日
發明者松井寬史, 水野和重, 伊藤康樹, 小原秀一, 藤原明, 高杉憲一, 岡田正彥 申請人:電化生研株式會社