納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備工藝的製作方法

2023-10-11 15:33:59

專利名稱：納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗血管再狹窄的塗層支架及其製備工藝，尤其涉及一種納米三氧 化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架及其製備工藝。
背景技術：
隨著人們生活方式的改變和平均壽命的延長，心腦血管及外周血管閉塞性疾病的 發病率明顯升高。自Gruzentig於1977年完成第一例經皮冠狀動脈腔內成形(PTCA)以 來，經皮腔內血管成形術(PTA)已經成為解決血管閉塞性疾病的首要方法，但PTA術後仍 有30-50%的患者發生再狹窄，影響了 PTA的遠期療效。之後人們又採用血管內支架成形 術(Endoluminal stenting)有效的解決了 PTA術後血管回縮與血管的重塑，再狹窄率也下 降到了 18%左右。支架成形術後支架內再狹窄(ISR)的發生機制除血管壁在血管擴張後 彈性回縮和血栓形成外，損傷所誘導的血管平滑肌細胞(VSMC)的過度增殖並向內膜的遷 移也起到了關鍵的作用，於是預防血管平滑肌細胞的增殖與遷移成為了解決ISR發生的關 鍵。在此基礎上，針對血管平滑肌細胞的增殖，藥物塗層支架(DEQ應運而生，目前，應用的 最為廣泛的是紫杉醇和雷帕黴素藥物塗層支架。然而，心血管支架雖然可以有效地降低ISR 的發生率，但是金屬支架本身作為異物，刺激VSMC增生，不能完全預防ISR的發生，因此選 擇生物相容性良好的高分子聚合物覆蓋在支架表面，不僅可以克服金屬支架本身帶來的致 栓性，加速血管內皮化的過程，而且可以作為抗增殖藥物的載體，直接而集中地到達病患部 位，從而可以避免全身給藥的毒副作用。1乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)的特性乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)為人工合成的聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)的共 聚物，大量的實驗研究證明了 PLGA是一種具有良好生物降解性和生物相容性的重要的生 物醫用高分子材料，不會引起明顯的炎症反應、免疫反應和細胞毒性反應，並經美國食品與 藥物管理局(FDA)批准作為注射用藥物、納米粒、植入劑等製劑的材料，廣泛應用於藥物給 藥系統的研究。乳酸羥基乙酸共聚物在生物體內經過酶的分解代謝，最終形成二氧化碳和 水被排出體外，不會造成對人體內環境的汙染，因而被認為是最有發展前途的生物可降解 高分子材料，備受國內外關注。將乳酸羥基乙酸共聚物做為帶藥的載體，可以通過調節乳酸 羥基乙酸共聚物分子中乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)的比例和分子量的大小，得到不同降解 速率的載體材料。常用的乳酸羥基乙酸共聚物比例有80 20,75 25,50 50等，按分 子量的大小又分為不同的規格。比例為50 50的PLGA由於親水性好，並具有較好的混懸 分散性能，因而是目前最為常用的乳酸羥基乙酸共聚物規格。2三氧化二砷的抗增殖作用三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)俗稱砒霜、亞砷酸等，為一種劇毒藥，又是 一種作用廣泛的藥物，作為藥物應用已有2400多年的歷史。1865年，Lessauer曾用口服 Fowler氏液(亦稱亞砷酸鉀溶液)治療白血病，這被認為是第一次使用抗癌藥物治療惡性腫瘤。1996年哈爾濱醫科大學第一醫院報告應用三氧化二砷注射液治療急性早幼粒細胞白 血病(acute promyelocytic leukaemia，APL)，臨床取得良好療效，引起國內外同行對砷的 重新認識。此後又有多篇文章進一步報導以三氧化二砷為主要成分的注射液具有明顯的抗 急性早幼粒細胞白血病的作用。上海第二醫科大學附屬瑞金醫院陳國強等從細胞和分子生 物學角度闡明了其作用機理，美國食品和藥品管理局也正式批准用砒霜治療急性早幼粒細 胞白血病的方案。因此，人們從中得到了啟發，開始進一步探索研究三氧化二砷對其他多種 惡性腫瘤的療效。目前已有大量實驗研究了急性早幼粒細胞白血病對實體瘤及腫瘤細胞的 作用，如肝H印G2和SMMC-7721細胞，胃癌MGC-803細胞，神經母細胞瘤，人舌鱗狀細胞癌， 肺癌NCI-H69細胞、食道癌EC8712細胞、胰腺癌細胞、人膀胱癌BIU-87細胞等均證明了砷 具有一定的廣譜抗癌性，其機制主要是抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，多 途徑抑制腫瘤增殖轉移。3納米技術在醫藥領域中的應用納米技術(Nano technology)是指對0. 1 IOOnm空間尺度內操縱原子和分子， 對材料進行加工，製造具有特定功能的產品，或對某物質進行研究，掌握其原子與分子的運 動規律和特性的高新技術。並已對許多高科技領域乃至整個社會都產生了巨大的影響。自 上世紀納米技術的概念被提出之後，在材料、冶金、化學化工、醫學、環境、食品等各領域均 表現出巨大的應用前景。隨著納米科技對醫藥研究領域的不斷滲透和影響，誕生了納米藥 物這一新名詞，從而引發了醫藥領域一場深遠的革命。納米藥物是指以納米級高分子納米 粒(nano-particles,NP)或納米球(nano—spheres，NS)、納米囊(nano-capsules,NC)等為 載體，與藥物以一定方式結合在一起後製成的藥物，其粒徑可能超過lOOnm，但通常應小於 500nm，納米藥物也可以是直接將原料藥物加工製成的納米粒。納米藥物顆粒小、表面反應活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強。納米藥 物與常規藥物相比具有以下特點(1)能增大藥物溶解度和吸收利用度，減少藥物用量，減 輕或消除毒副作用並節省藥物資源；(2)納米顆粒作為生物大分子的載體，能改善蛋白質、 多肽類大分子等口服藥物的吸收和生物利用度；C3)納米藥物可以實現緩釋、控釋和靶向 治療。藥物緩釋是指用藥後能在較長時間內持續釋放藥物以達到長效作用；藥物控釋是指 藥物能在預定時間內主動按某一速度從製劑中恆速釋放於作用器官或特定靶組織，並使藥 物濃度較長時間維持在有效濃度內。目前，已有多篇文章報導，將傳統藥物納米化後，藥效 大大提高，特別是在抗腫瘤研究中顯示了充分的優越性。

發明內容
本發明體提供一種能夠延長三氧化二砷對血管平滑肌細胞的有效作用時間並具 有緩慢釋放修改的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備工藝。本發明採用如下技術方案來解決其技術問題本發明所述的一種納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備方法， 其特徵在於步驟1納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的製備取0. 01-0. 03g三氧化二砷粉末於摩爾濃度為lmmol/L的氫氧化鈉溶液中充分溶 解，並以lmmol/L的鹽酸將pH值調至7. 2-7. 4，形成A液；
將IOOmg乳酸羥基乙酸共聚物溶解在2ml的二氯甲烷中，形成B液；將A液加入B液(A液與B液的體積比為6-10 1)中，超聲乳化lmin，形成C液；將12ml的質量百分比濃度為2. 25%的聚乙烯醇加入60_100ml的C液中，使用超 聲波發生器對C液進行超聲90秒，在冰水中分散，形成D液；將D液升至室溫並以300r/min轉速攪拌池，形成納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸 共聚物膠體溶液，得到E液，將三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物納米粒膠體溶液於4°C， 15000rpm,離心30min，棄去上清液，沉澱用蒸餾水洗3次，除去未包裹的游離藥物，真空凍 幹得凍乾粉，密封后置於4°C保存；步驟2納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備將不鏽鋼金屬裸支架於CQ50超聲波發生器中清洗3分鐘，烘乾後靜置於上述B液 中Mh，形成乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架，乾燥後將乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架靜 置於E液中48h，去除後於37°C烤箱中乾燥30min，最後形成納米乳酸羥基乙酸共聚物塗層 支架。與現有技術相比，本發明取得了如下有益效果採用新技術製備了乳酸羥基乙酸共聚物載三氧化二砷的新劑型，納米三氧化二砷 /乳酸羥基乙酸共聚物是一種較理想的緩慢釋放製劑，可延長三氧化二砷對血管平滑肌細 胞的有效作用時間，體外有一定的抑制細胞生長和誘導凋亡作用。初步的實驗研究證實其 對血管平滑肌細胞的增殖和遷移有一定的抑制作用，此藥物新劑型今後有望成為藥物塗層 支架表面的藥物塗層，為臨床防治支架內再狹窄提供新的思路和方法。1.採用雙相乳化蒸發法製備的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物超聲分散 後，分別用透射電鏡(圖1)和掃描電鏡(圖幻觀察，為近似圓形，並有一定電子密度，呈散 在分布的球體。由CMIAS98A圖像分析系統計算平均粒徑，可知本實驗製備的納米三氧化二 砷/乳酸羥基乙酸共聚物的平均粒徑為90nm。在掃描電鏡視野下任意選幾個視野，用能譜 儀對納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物成份進行分析(圖幻，可見其中含有砷、碳和氧 的成分，砷的質量百分含量(Wt%)為3. 25%，原子百分含量(At%)為0. 72%，故可以證 實納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物已成功製備。採用原子螢光分光光度計測定的納 米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的平均載藥量為1. 72%，平均包封率為53. 75%。以 生理鹽水為介質考察了納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的體外動態釋放，經計算該 藥物的累積釋放率4d時達到72. 37%,15d時達到96. 82%，並逐漸進入平臺期(圖13)。2.本發明採用浸塗法製備載納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架後， 在掃描電鏡下觀察裸金屬支架表面凹凸不平(圖4)；乳酸羥基乙酸共聚物包被的金屬支 架表面明顯覆蓋一層膜狀物質，較為平坦(圖7)；納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物 血管塗層支架的表面可觀察到膜狀物質的包裹，且膜上含有一定的電子密度的納米級顆粒 (圖10)，該納米顆粒的平均粒徑為92nm，與我們所製備的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸 共聚物的平均粒徑基本一致。能譜儀分別對裸金屬支架(圖6)、乳酸羥基乙酸共聚物包被 的金屬支架(圖9)和納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物包被的金屬支架(圖12)進 行了成分分析。能譜儀對納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物血管塗層支架的成分分析 顯示該支架含有鐵、鎳、鉻、碳和氧元素外，砷的質量百分含量(Wt%)為12. 57%，原子百分 含量(At%)為7. 86%，證實了砷的存在，說明納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物已被包被於支架表面。3.納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的含砷量用原子螢光分光光度計測定的砷的標準工作曲線為I = 3. 737+13. 097C, r = 0. 9995，其中I為分析信號峰面積，C為砷濃度，經測定，納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共 聚物的平均載藥量為1. 72%，平均包封率為53. 75%。4.納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架體外釋藥速率的動態測定結 果以生理鹽水為介質考察了納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的體外動態釋 放，經計算該藥物的累積釋放率4d時達到72. 37%，15d時達到96. 82%，並逐漸進入平臺期 (圖⑶。5.納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物對血管內皮細胞增殖及遷移的影響MTT (甲基噻唑基四唑)法體外測定納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物對原 代培養的血管平滑肌細胞增殖的抑制作用具有時間依賴性和劑量依賴性。納米三氧化二砷 /乳酸羥基乙酸共聚物的時間依賴性殺傷效應一直呈持續增加趨勢。流式細胞儀結果顯示 藥物作用4 及7 後，較高濃度納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的誘導凋亡作用 (18. 71%,29. 9% )明顯強於較低濃度納米As203/PLGA(10. 20%U8. 29% )。⑤Transwell 細胞遷移實驗結果顯示較高濃度納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物對血管平滑肌細 胞遷移的抑制作用(77.5%)明顯強於較低濃度納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物 (32. 5% )。⑥RT-PCR及Wfestern blot顯示納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物對血管 平滑肌細胞的Bcl-2基因的表達有抑制作用，對Bax基因的表達有促進作用(Bcl-2/Bax比 值降低)。且隨著藥物濃度的增加Bcl-2/Bax比值降低更明顯(見圖6、7、8、9)。


圖1是本發明製備的納米三氧化二砷透射電鏡照片。圖2是本發明製備的納米三氧化二砷掃描電鏡照片。圖3是納米三氧化二砷的能譜檢測結果(注銅峰是銅網所致)。圖4是本發明製得的裸金屬支架一張電鏡照片。圖5是本發明製得的裸金屬支架的另一張電鏡照片。圖6是本發明製得的裸金屬的能譜圖。圖7是本發明製備的乳酸羥基乙酸共聚物包被金屬支架一張電鏡照片。圖8是乳酸羥基乙酸共聚物包被金屬支架另一掃描電鏡照片。圖9是乳酸羥基乙酸共聚物包被金屬支架的能譜圖。圖10是本發明製備的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物包被的金屬支架的 一張電鏡照片。圖11是納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物包被的金屬支架的另一張電鏡照 片。圖12是納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物包被的金屬支架EDS圖。圖13是本發明製備的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架累積釋放率。
圖14是陰性對照組處理血管平滑肌細胞後光鏡結果(X 200倍)。圖15是2umol/L納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物組處理血管平滑肌細胞 後光鏡結果(X200倍)。圖16是3 μ mol/L納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物組處理血管平滑肌細胞 後光鏡結果(父200倍)。圖17是4 μ mol/L納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物組處理血管平滑肌細胞 後光鏡結果(父200倍)。圖18是5 μ mol/L納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物組處理血管平滑肌細胞 後光鏡結果(父200倍)。圖19是陰性對照組對血管平滑肌細胞遷移的影響。圖20是1 μ mol/L納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物組對血管平滑肌細胞遷 移的影響。圖21是3μ mol/L納米三氧化二砷 移的影響。圖22是6 μ mol/L納米三氧化二砷 移的影響。圖23是不同濃度納米三氧化二砷/ 7 後，RT-PCR電泳結果。圖M是不同濃度納米三氧化二砷/ 72h 後，western-blot 印跡結果。
『乳酸羥基乙酸共聚物組對血管平滑肌細胞遷 『乳酸羥基乙酸共聚物組對血管平滑肌細胞遷 乳酸羥基乙酸共聚物作用於血管平滑肌細胞 乳酸羥基乙酸共聚物作用於血管平滑肌細胞
具體實施例方式實施例1一種納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架，包括支架本體，支架本體 的外部包覆有納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物。實施例2一種納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備方法，步驟1納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的製備取0. 01-0. 03g三氧化二砷粉末於摩爾濃度為lmmol/L的氫氧化鈉溶液中充分溶 解，並以lmmol/L的鹽酸將pH值調至7. 2-7. 4，形成A液；將IOOmg乳酸羥基乙酸共聚物溶解在2ml的二氯甲烷中，形成B液；將A液加入B液中，其中，A液與B液的體積比為6-10 1，本實施例可以選擇 6 1、7 1或10 1，超聲乳化lmin，形成C液；將12ml的質量百分比濃度為2. 25%的聚乙烯醇加入60_100ml的C液中，使用超 聲波發生器對C液進行超聲90秒，在冰水中分散，形成D液，其中，超聲波發生器的型號為 CQ50 ；將D液升至室溫並以300r/min轉速攪拌池，形成納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸 共聚物膠體溶液，得到E液，將三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物納米粒膠體溶液於4°C， 15000rpm,離心30min，棄去上清液，沉澱用蒸餾水洗3次，除去未包裹的游離藥物，真空凍幹得凍乾粉，密封后置於4°C保存；步驟2納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備將不鏽鋼金屬裸支架於CQ50超聲波發生器中清洗3分鐘，烘乾後靜置於上述B液 中Mh，形成乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架，乾燥後將乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架靜 置於E液中48h，去除後於37°C烤箱中乾燥30min，最後形成納米乳酸羥基乙酸共聚物塗層 支架。本實施例制的的納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架，肉眼觀察除表 面被覆一層膜樣物質外，較裸金屬支架無明顯變化。
權利要求
1. 一種納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備工藝，其特徵在於， 步驟1納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物的製備取0. 01-0. 03g三氧化二砷粉末於摩爾濃度為lmmol/L的氫氧化鈉溶液中充分溶解，並 以lmmol/L的鹽酸將pH值調至7. 2-7. 4，形成A液；將IOOmg乳酸羥基乙酸共聚物溶解在2ml的二氯甲烷中，形成B液； 將A液加入B液(其中，A液與B液的體積比為6-10:1)中，超聲乳化lmin，形成C液； 將12ml的質量百分比濃度為2. 25%的聚乙烯醇加入60_100ml的C液中，使用超聲波 發生器對C液進行超聲90秒，在冰水中分散，形成D液；將D液升至室溫並以300r/min轉速攪拌3h，形成納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共 聚物膠體溶液，得到E液，將三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物納米粒膠體溶液於4°C， 15000rpm，離心30min，棄去上清液，沉澱用蒸餾水洗3次，除去未包裹的游離藥物，真空 凍幹得凍乾粉，密封后置於4°C保存；步驟2納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架的製備 將不鏽鋼金屬裸支架於CQ50超聲波發生器中清洗3分鐘，烘乾後靜置於上述B液中 Mh，形成乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架，乾燥後將乳酸羥基乙酸共聚物包裹的支架靜置 於E液中48h，去除後於37°C烤箱中乾燥30min，最後形成納米乳酸羥基乙酸共聚物塗層支^K O
全文摘要
一種納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架，包括支架本體，在支架本體的外部包覆有納米三氧化二砷塗層。製備方法取一定量的三氧化二砷粉末於氫氧化鈉溶液中充分溶解，調整pH值後形成A液；將一定量乳酸羥基乙酸共聚物溶解在二氯甲烷中,形成B液；將A液加入B液中，超聲乳化後形成C液；將聚乙烯醇加入C液中，超聲,冰水中分散後，形成D液；將D液攪拌，形成納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物膠體溶液，即E液；將不鏽鋼金屬裸支架超聲清洗，烘乾後靜置於上述B液中，乾燥後將該支架靜置於E液中，去除後於烤箱中乾燥，最後形成納米三氧化二砷/乳酸羥基乙酸共聚物塗層支架。
文檔編號A61L31/16GK102068718SQ201010533299
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者張東生, 趙蘇蘇 申請人:東南大學