一種靶向prc2抗腫瘤藥物的篩選方法

2023-10-11 05:20:49

一種靶向prc2抗腫瘤藥物的篩選方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗PRC2依賴性腫瘤藥物的篩選方法，特別的，本發明涉及以EED-EZH2相互作用為靶點的篩選方法，通過所述方法可篩選出能夠拮抗EED-EZH2互作並能使EZH2降解的小分子化合物，該小分子化合物對PRC2依賴性腫瘤細胞有殺傷作用，可開發成為抗腫瘤藥物。
【專利說明】一種靶向PRC2抗腫瘤藥物的篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗PRC2依賴性腫瘤藥物的篩選方法，所述方法以EED-EZH2相互 作用為靶點，通過初篩和復篩，篩選出對EED-EZH2互作有拮抗並能使PRC2複合物組分有降 解作用的小分子化合物，該小分子化合物可抑制PRC2複合物活性，降解EZH2,對PRC2依賴 性的腫瘤細胞有殺傷作用，可用作抗腫瘤藥物。
[0002] 發明背景
[0003] 癌症由多種因素引起，在世界範圍內，它是第一致死因素。2008年統計的數據顯 示，大概有七百六十萬人死於癌症（佔所有死亡人數的13% )。急需新的，更有效的癌症療 法來改善這種狀況。長期以來，表觀遺傳和基因突變被認為是癌症發生過程的兩種不同機 制。通過基因途徑致癌相對比較直接：抑癌基因的突變和/或致癌基因引起的功能獲得型 突變或功能喪失型突變，及異常表達。通過表觀遺傳途徑致癌相對來說沒那麼簡單。它取 決於染色質結構包括DM甲基化，組蛋白變體和修飾，核小體重塑和一些小的非編碼調節 RNAs (Sharma et al.，2010)。在癌症的發生和發展中，表觀基因組經歷了很多改變，包括基 因組範圍DNA去甲基化（超甲基化），CpG島啟動子甲基化程度增高，核小體空間結構改變 及修飾。
[0004] 進年來，對表觀遺傳失調在癌症中的作用的認識有所增強。由此，也給靶向性癌症 療法帶來了新的機遇。表觀遺傳學主要是研究基因DNA序列不變的轉錄的可遺傳變化。該 領域的研究，也讓我們發現了些選擇性激活或抑制靶基因的藥物。所以，表觀遺傳學也成為 了一門發展很迅速的學科。雖然，我們對表觀遺傳學的認識還相對比較膚淺。但是，近來，我 們也發現一些表觀遺傳調控因子，包括DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質重塑和基因轉錄， 在癌症的引起和發展中所起的作用。大量研究表明，異常的翻譯後調控-組蛋白修飾，在很 多疾病的發生和發展中有著重要作用。
[0005] 科學家和藥學界近來開發高效、特異的染色質相關蛋白抑制劑取得很大進步。而 這些抑制劑主要靶向：組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶、乙醯賴氨酸結合域。目前，大量 的研究集中在靶向組蛋白甲基轉移酶。
[0006] 在癌症領域，在一些不同的腫瘤類型中發現的一些組蛋白甲基轉移酶基因改變無 疑引起了很多關注，也支撐了疾病中廣泛被認為由基因驅動的表觀遺傳的失調的重要性。 一些例子（像後面要討論的甲基轉移酶EZH2)，它的催化結構域，SET結構域的雜合子點突 變導致相對野生型的功能獲得性突變。使其更傾向於超甲基化，並且沉默抑癌基因和/或 特異的分化相關基因。同樣的，在其它腫瘤中（比方說，多發性骨髓瘤中NSD2的高表達）， 染色體移位導致甲基轉移酶的高表達，也導致異常的轉錄和擴增。相反地，由組蛋白甲基轉 移酶DOTlL引起的賴氨酸甲基化卻使得白血病生成所需的多種基因持續的表達。因此，對 於像EZH2或DOTlL的小分子抑制劑應該能減少或消除組蛋白甲基轉移酶對特異位點賴氨 酸的甲基化，並且逆轉它的致癌性。現今，研究的比較多的抑制劑主要是針對EZH2。
[0007] EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)是一種組蛋白甲基轉移酶，它催化甲基從 輔因子S腺苷甲硫氨酸轉移到組蛋白H3的27位賴氨酸上，使得組蛋白H3的27位賴氨酸 三甲基化。一些研究表明在一些實體瘤中，包括前列腺癌、乳腺癌、腎癌和肺癌。EZH2水平 會升高並且使其靶基因沉默，從而導致預後差。
[0008] 來自Chinnaiyan實驗室的開創性研究，揭示了在轉移性前列腺癌中，EZH2和組蛋 白H3的27位賴氨酸三甲基化高水平與預後差相關聯。除此以外，組蛋白H3的27位賴氨酸 去甲基酶UTX的失活突變也同樣與轉移性前列腺癌相關，這預示著組蛋白H3的27位賴氨 酸的超甲基化在前列腺癌中起著重要的作用。其它研究也顯示了 EZH2的高表達及帶來的 靶基因的沉默與很多實體瘤的差的預後有同樣的相關性。包括，乳腺，腎臟和肺。近些時候， EZH2的SET結構域的體細胞激活型突變，使組蛋白H3的27位賴氨酸三甲基化提高，在濾泡 性淋巴瘤和彌散性大B細胞淋巴瘤中被鑑定出來了。結合起來，這些發現表明通過EZH2高 表達或點突變而導致的組蛋白H3的27位賴氨酸三甲基化水平失調，沉默靶基因對於腫瘤 的生長、存活都有重要作用，由此也突出了開發靶向此酶療法的緊迫性。矛盾的是，EZH2的 失活型突變也在骨髓增生異常症候群中被報導了，這也揭示了這個蛋白的抑癌作用。EZH2 和組蛋白H3的27位賴氨酸甲基化在促進或是抑制腫瘤生成和/或維持中的作用似乎要依 情況而定。鑑於潛在的毒性作用，在開發長期服用的治療性抑制劑時要很謹慎。儘管有這 些潛在的缺陷，但是很多製藥和生物公司的研發團隊已經開發了高效的、特異性的EZH2的 小分子抑制劑。同樣有很多研究興趣在天然產物抑制劑。
[0009] EZH2,是 PRC2 (polycomb repressive complex 2)複合物中發揮催化作用的組 分。PRC2包含四種核心亞單位：SUZ12(哺乳動物中的同源物為Su(Z) 12)，EZH2(哺乳動物 中的同源物為E (z))，EED (哺乳動物ESC)和RbAP46/48 (也稱作RbBP4/7 ;哺乳動物中的 同源物為 P55) (Kuzmichev et al.，2002 ;Margueron and Reinberg, 2011)。這些組分都 有很多功能。例如，SUZ12含有一個鋅指模序，對於EZH2的催化活性是必須的（Pasini et al.，2004)。EZH2通過其保守的SET結構域而發揮組蛋白甲基轉移酶作用。近來也發現了其 類似物EZH1，同樣能過介導H3K27三甲基化（Margueron et al.，2008 ;Shen et al.，2008)。 EED是一種含WD-40重複序列的蛋白，它能與EZH2相互作用並通過所謂的芳香籠，也即由 三個芳香族胺基酸（97位苯丙氨酸，364位色氨酸，365位酪氨酸）組成的結構結合三甲 基化的組蛋白H3的27位賴氨酸，從而激活PRC2,是EZH2發揮甲基轉移酶活性所必須的 (Ketel et al.，2005;Kuzmichev et al.，2005)。總的來說，EZH2，EED 和 SUZ12 三種組分是 PRC2複合物發揮催化活性及後續的起始基因抑制功能所不可或缺的（Ketel et al.，2005 ; Sparmann and van Lohuizen, 2006)。第四種組分，RbBP4/7,是PRC2與組蛋白尾巴發生聯 系所必須的（Kuzmichev et al.，2002)。除了核心亞單位外，PRC2還含有些其它因子，比方 說 JARID2，AEBP2，and PCL(Margueron and Reinberg，2011;Nekrasov et al.，2007;Peng et al.，2009 ;Shen et al.，2009)。這些組分的準確功能還不是很明白，但它們對PRC2酶 活的發揮和PRC2與DNA的結合具有調節作用（Margueron and Reinberg, 2011)。為了使癌 症中的PRC2複合物失效，從而抑制無限制的細胞擴增，一些研究開始靶向EZH2和EED之間 的相互作用，而這種相互作用對於酶活是必須的。採用了一種新的策略，通過幹擾蛋白相互 作用而解離PRC2複合物從而阻斷EZHl和EZH2的活性。
[0010] 在此種策略的啟發下，本方法主要從EED開始，通過篩選能與EED結合的小分子天 然產物，並進一步從中找到能干擾PRC2複合物形成的抑制劑，從而為開發一些針對於PRC2 依賴性腫瘤的藥物提供些借鑑。


【發明內容】

[0011] 本發明涉及一種靶向PRC2抗腫瘤藥物的篩選方法，包括：（a)使待檢樣品與EED 接觸，選出與EED能結合的初篩樣品；(b)將初篩樣品與EED-EZH2互作（也可稱為EED-EZH2 複合物）接觸，若所述樣品能拮抗EED-EZH2互作，則該樣品為抗PRC2依賴性腫瘤陽性藥 物。所述方法以EED-EZH2相互作用為靶點。
[0012] 其中優選的，上述方法還包括步驟（c)驗證步驟（b)篩選獲得的樣品對PRC2依賴 性腫瘤細胞的抑制效果。優選的，上述方法的步驟（a)中應用生物分子相互作用儀篩選，如 生物分子相互作用儀BIAC0RE3000。優選的，上述方法的步驟（b)中採用競爭性Co-IP模型 篩選出可以拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物。
[0013] 本發明還涉及通過上述方法篩選獲得的小分子化合物。優選的，本發明涉及小分 子化合物2D7或1E7。本發明還涉及一種組合物，含有上述方法篩選獲得的小分子化合物以 及藥學上可接受的載體或輔料。優選的，本發明涉及含有小分子化合物2D7或1E7的組合 物，所述組合物還含有藥學上可接受的載體或輔料。
[0014] 本發明還涉及上述篩選獲得的小分子化合物（特別是小分子化合物2D7或1E7) 或上述組合物（含有小分子化合物2D7或1E7)在製備抗腫瘤藥物、或降解EZH2藥物中的 應用。
[0015] 其中優選的，在初篩之前，先表達純化EED蛋白：用大腸桿菌BL21表達原核表達質 粒pGEX-4T-l_EED，得到的帶GST標籤的EED融合蛋白比較容易用Glutathione Sepharose 4B珠子進行純化，GST標籤和EED蛋白之間含凝血酶的酶切位點，使得能夠從Glutathione S印harose 4B珠子上直接切下EED，保證了所獲得的EED蛋白的純度。採用的是原核表達， 獲得了較高濃度的EED蛋白。同時偶聯在CM5晶片上的EED相對較耐NaOH洗脫，也就是說 用此方法獲得的EED穩定性較高。
[0016] 接著，利用生物分子相互作用儀BIAC0RE3000篩選待檢樣品，初篩出能與EED結合 的小分子化合物：應用BIAC0RE3000進行小分子與蛋白相互作用分析。相比傳統的酵母雙 雜，ELISA，FRET，Co-IP，ChIP，Western，EMSA等方法，有實時監控，無需標記，強親和力，弱 親和力及瞬間相互作用都可以檢測，完全活性的互作分析，自動化高、省時省力等優點。實 驗證明，初篩得到的小分子化合物，第一批挑18個，進行下一步復篩，有效小分子化合物有 2個，其中一個在文獻中有報導證實，1E7即EGCG為報導的具有抗癌作用的小分子化合物， 並對EZH2和EED有降解作用。我們對2D7 S卩Wedelolactone的相似作用進行了初步驗證。 說明此方法的篩選有效性還是挺高的。
[0017] 接著，採用競爭性Co-IP模型復篩拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物：競爭性 CO-IP模型，對於篩選拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物的復篩準確性高。雖然只是體外 的實驗，但是跟體內的作用效果還是很符合的。此模型不僅能篩選出能與EZH2競爭結合 EED的小分子化合物，也能篩選出能直接降解EZH2或是EED的小分子化合物，而這些小分子 化合物的共同效果是能阻礙EZH2-EED的互作。從而使其靶向性強。
[0018] 最後，對篩選獲得的小分子化合物的抗腫瘤作用或降解EZH2或EED進行驗證：對 篩選到的兩種小分子化合物的作用的初步驗證。對內源EZH2的降解是靶向EZH2-EED互作 的一個比較直接的衡量指標，它操作簡單，標準明確。目前抗腫瘤藥物體外篩選的方法很 多，主要有MTT比色法、3H-T dR摻入法、酸性磷酸酶法（APA)、ATP生物發光法、SRB法以及 高通量篩選等，其中MTT比色法因其具有簡單、快速、精確、不涉及使用放射性元素，且結 果與同位素摻入法一致等優點，在很多實驗室被廣泛使用作為抗腫瘤藥物體外篩選的常 用方法。
[0019] 正確的研究方法和科學的思路在抗腫瘤藥物的篩選中起關鍵的作用，針對機制 的篩選系統是比較理想的，現在很多集中在與腫瘤發生，轉移，發展相關的蛋白激酶、腫瘤 細胞中阻止細胞程序性死亡的基因如Bcl-2、p53基因，基質金屬蛋白酶等都成為抗腫瘤藥 物篩選的靶標。PRC2複合物與腫瘤相關性的研究已比較明確，靶向EZH2-EED互作從而影響 PRC2複合物的功能，從而重新激活被沉默的抑癌基因對於抗腫瘤有很好的效果及靶向性。 本方法以EZH2-EED相互為靶點，靶向性強。應用分子相互作用分析儀BIAC0RE3000篩選與 EED結合的小分子化合物，靈敏度較高，自動化好，操作簡單。拮抗EZH2-EED互作的體外篩 選模型，與體內的一致性較高。其中篩到的小分子化合物出現在被發表的文獻中，也證實了 此篩選方法的有效性。為今後的抗腫瘤藥物的篩選提供了很好的借鑑。本發明篩選出的另 一個小分子化合物也被驗證對內源EZH2具有降解作用，對PRC2依賴性腫瘤細胞有很好的 殺傷作用。 附圖簡介
[0020] 現將本發明用有關附圖來描述，其中：
[0021] 圖1 :用凝血酶酶切後，收集的流出物，期間加入PBS衝洗，分管收集的EED蛋白 液，分別上樣，跑膠考染，對於理論值大小下面的兩條蛋白條帶，切膠後再進行質譜鑑定；
[0022] 圖2 :考染理論值大小下面的兩條蛋白帶的質譜鑑定結果，其中（A)代表圖1中上 面那條帶的MS結果，其中上：質譜鑑定目標蛋白條帶結果，劃線部分為與hEED胺基酸序列 相匹配的部分，下：以上序列於NCBI資料庫中比對結果，其中hEED得分最高；(B)代表圖1 中下面那條帶的MS結果，其中上：質譜鑑定目標蛋白條帶結果，劃線部分為與hEED胺基酸 序列相匹配的部分，下：以上序列於NCBI資料庫中比對結果，其中hEED得分最高。
[0023] 圖3 :此圖為502種小分子化合物（實測499個），用BIAC0RE3000檢測結合EED的 反應值匯總。橫坐標是化合物編號，從1-499,縱坐標是BIAC0RE 3000測得的反應值（RU)， 箭頭標示的為發現的能靶向EZH2-EED互作的兩種小分子化合物，1E7已被報導，2D7為新發 現的；
[0024] 圖4 :為體外篩選能干擾EED-EZH2互作的模型，小分子化合物競爭性的與EED結 合，從而使Co-IP下來的EZH2減少；
[0025] 圖5 :用競爭性Co-IP實驗篩選出1E7、2D7的結果圖；
[0026] 圖6 :此圖為用BIAC0RE3000對2D7、1E7與EED結合的動力學進行測定後的處理 結果，左圖為2D7的結果，右圖為1E7的結果；
[0027] 圖7 :2D7對白血病細胞K562,肝癌細胞H印G2,內源EZH2的降解作用刪掉；
[0028] 圖8 :在白血病細胞K562,肝癌細胞H印G2,不同濃度的2D7對其增殖影響的MTT試 驗，L02為正常肝細胞，作為對照。 實施例
[0029] 本發明下面所述是以實施例說明，本發明不限於這樣的實施例。
[0030] 對於本發明所述方法的實施例如下：
[0031] 1、表達純化EED蛋白。
[0032] 取本實驗室保存的pGEX-4T-l-EED原核表達質粒（IOOng)，加入100 ii L感受態細 胞E.coli BL21(DE3)(由康為世紀公司購買）中，冰上放置20min後42°C熱刺激90s，再繼 續於冰上放置2min。向感受態細胞中加入800 ii L新鮮配置的無抗生素LB培養基（0. 5% 酵母提取物，1%胰蛋白腖，1%氯化鈉，pH 7. 0，121°C滅菌20min)後，37°C、200rpm搖床 培養45min。取200 ii L培養後菌液均勻塗布在含50mg/L氨苄（後面用到的抗性平板及液 體培養基終濃度均相同）的LB平板（0. 5%酵母提取物，1 %胰蛋白腖，1 %氯化鈉，1. 5% 瓊脂粉，pH 7.0，121°C滅菌20min後倒皿）上，置於37°C隔水式恆溫培養箱中培養，待其 長出單菌落，挑單菌落至4ml含氨苄的LB液體培養基中，放搖床上37°C，250rpm，搖過 夜，按體積比1 :1〇〇接入200ml含氨苄的LB液體培養基中，搖到0D600至0. 6-0. 8,按終 濃度0? 2mM(母液1M)加入IPTG誘導，放搖床上28°C，150rpm，搖過夜，5000rpm，5min離 心收集菌體，PBS 洗三遍，用 15ml PBS(KH2P04 0.24g/L，Na2HP04 1.44g/L，NaCl 8.0g/L， KCl 0. 2g/L，pH7. 4)重懸，加入終濃度ImM的蛋白酶抑制劑PMSF，用超聲波細胞粉碎機，程 序設定，工作時間8s，間隙時間15s，工作次數30,超聲功率200W，在冰上超聲裂解，重複 三次，8000rpm，15min離心，收集上清再離心，8000rpm 5min，再取上清，加入填充有終體積 ImL Glutathione Sepharose 4B珠子的的GST蛋白純化柱，柱子密封，在4°C環境室的轉子 上旋轉4h讓蛋白與珠子充分結合,接著讓上清流過柱子,再密封,將凝血酶（sigma T4648 1000u)500ul (儲液濃度為 100units/mL)與 1500ul binding buffer (NaCl 8. 2g/L, KCl 0? 2g/L, Na2HPCM 3. 6g/L, KH2PCM 0? 2g/L, pH 7. 3)混勻，加入珠子中，室溫，低速搖床上過 夜，次日收集流出物，再向珠子中加入1.5m L binding buffer並分管收集流出物，並用考 馬斯亮藍法定性是否還有蛋白，重複該操作（再加1.5mL binding buffer,收集流出物）， 直至考馬斯亮法測定液不變色止，停止收集，以上所得的收集液即為所需蛋白，跑膠考染並 質譜鑑定。考染及質譜鑑定結果見圖1和2。所有收集液用IOKD的蛋白濃縮管濃縮（操 作按照Amicon? Ultra_15Centrifugal Filter Devices for volumes up to 15mL User Guide進行），用微量紫外可見?突光分光光度計e-spect(Malcom)測定其濃度為4. 152mg/ mL〇
[0033] 2、利用生物分子相互作用儀BIAC0RE3000篩選，初篩出能與EED結合的小分子化 合物。
[0034] 將純化的EED蛋白通過氨基偶聯的方式偶聯到CM5 (GE Healthcare)晶片上。簡 言之，根據供應商的說明書，將羧甲基化的葡聚糖生物傳感器晶片（CM5，GE Healthcare)用 N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺（NHS) 活化。將EED用IOmM乙酸鈉pH5. 0稀釋至100 ii g/ml，之後以5 ii L/分鐘的流速注射，以達 到約10000反應單位（RU)的偶聯蛋白質。在蛋白質注射後，注射IM乙醇胺以封閉未反應 的基團。將502個從天然植物等來源中分離的單體化合物，用binding buffer稀釋後按順 序加入96孔板，設定BIAC0RE3000程序，自動進樣（具體操作按Biacore 3000Instrument Handbook進行）。挑選RU值20以上的小分子化合物，做下一步復篩。小分子化合物過機 數據見圖3。
[0035] 3、拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物復篩。
[0036] 用實驗室保存的帶myc標籤的EZH2真核表達質粒，和構建在pCNDA-4. 0載體的 EED真核表達質粒（帶myc和his雙標籤），共轉染至293T細胞（轉染步驟要求按英格恩 生物公司Entranster TM-H轉染試劑使用說明進行），轉染後24h，4°C，3000rpm，5min,離 心收集細胞，用PBS重懸洗去殘餘DMEM培養基，4°C，3000rpm，5min，離心棄上清，菌體用 加有終濃度ImM的蛋白酶抑制劑PMSFlXcell lysis buffer(購自cell signaling的 cell lysis buffer (10 X) Catalog: 9803)冰上裂解，30min，4°C，12000rpm，15min，離心收 集上清，加入anti-His(TA-02,中杉金橋）抗體，4°C環境室轉子上旋轉Ih JflAProtein G Plus-Agrose (sc-2002)，混勻後均分幾管，分別按5um/L的終濃度加入初篩獲得的的小 分子化合物，加入等量的DMSO的管作為對照。接著將其放到4°C環境室轉子上旋轉過夜， 4°C，3000rpm, 3min，離心後去上清，用PBS重懸ProteinG珠子，放到4°C環境室轉子上旋轉 IOmin,重複離心，旋轉，共三次，最後4°C，3000rpm，3min,離心，小心去掉上清，向Protein G 珠子中加入 2Xloading buffer(每 20mL 體系，l.Omol/L Tris-HCl (pH 6.8)41^,20% SDS 6mL,甘油 Am],, 0 -疏基乙醇 I. 2mL, 0? I %漠酌藍 0? 8mL, ddH20 4mL) 30ul，沸水浴中煮 5min，冰上冷卻，12000rpm, lmin，離心取上清跑8 %的SDS-PAGE膠，用c_Myc抗體（9E10) (sc-40)做western blot,對比對照組與加入小分子化合物組的myc_ezh2的條帶，帶明顯 變弱的化合物為復篩獲得的可以拮抗EED-EZH2互作的小分子化合物。篩選主要採用競爭 性Co-IP模型（見圖4)，篩選實驗獲得2種小分子化合物，編號1E7和2D7,結果見附圖5， 並對其結合EED的動力學用BIAC0RE3000進行了測定。結果見附圖6。
[0037] 4、對篩選到的兩種小分子化合物的作用的初步驗證。
[0038] (1)小分子化合物2D7對內源EZH2的降解作用。
[0039] 實驗用細胞係為本實驗室保存的白血病細胞系K562和人肝癌細胞系H印G2。 前一天鋪六孔板，第二天長至80%匯合度時，分別按照0，10碰，50碰，100碰和0，10碰， 25uM，50uM終濃度加入小分子化合物2D7,刺激24h後，用細胞刮刀刮下，並吸入離心管中， 4°C，5000rpm，3min，離心去上清，收集細胞，用PBS重懸，再離心去上清，收集細胞，加入 80ul，IX cell lysis buffer含終濃度ImM的蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解，30min，4°C， 12000rpm，10min，離心，取上清，加入5X loading buffer,沸水浴中煮5min,冰上放置冷 卻，短暫離心，上樣，跑SDS-PAGE電泳膠，用western blot檢測內源EZH2(#3147S cell signaling)表達量，結果見圖7。
[0040] (2)小分子化合物2D7對腫瘤細胞的殺傷作用。
[0041] 用MTT法對小分子化合物2D7對K562細胞和H印G2細胞的殺傷作用進行初步評 價，L02為正常肝細胞作為對照。本實驗用的為凱基MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒。 操作步驟按照說明進行。
[0042] 1.在96孔板加入細胞100 ii L/孔（約I X 104)，置37°C 5% C02細胞培養箱培養 24小時。
[0043] 2?加入適當濃度的受試化合物。（0, 3. 125uM, 6. 25uM, 12. 5uM, 25uM, 50uM，IOOuM)
[0044] 3.將96孔板在37°C，含5% C02空氣及100%溼度的細胞培養箱中孵育適當時間 48h。
[0045] 4?將 5XMTT 用 Dilution Buffer 稀釋成 1XMTT。
[0046] 5.每孔加50iiL 1父1!'1'，在371：孵育4小時，使階1'還原為甲月贊。
[0047] 6.吸出上清液，每孔加150ii L DMSO使甲月贊溶解，用平板搖床搖勻。
[0048] 7.酶標儀在490nm波長處檢測每孔的光密度。
[0049] 8.結果分析：以小分子化合物濃度為橫坐標，490nm波長下的光吸收值為縱坐標 做曲線圖。
[0050] 小分子作用效果見圖8。
【權利要求】
1. 一種靶向PRC2抗腫瘤藥物的篩選方法，包括： (a) 使待檢樣品與EED接觸，選出與EED能結合的初篩樣品； (b) 將初篩樣品與EED-EZH2互作接觸，若所述樣品能拮抗EED-EZH2互作，則該樣品為 抗PRC2依賴性腫瘤陽性藥物。
2. 如權利要求1所述方法，其中還包括步驟（c):驗證步驟（b)篩選獲得的樣品對PRC2 依賴性腫瘤細胞的抑制效果。
3. 如權利要求1所述方法，其中步驟（a)中應用生物分子相互作用儀篩選。
4. 如權利要求1所述方法，其中步驟（b)中採用競爭性Co-IP模型篩選。
5. 權利要求1-6任一所述方法篩選獲得的小分子化合物。
6. 如權利要求5所述的小分子化合物，其為2D7或1E7。
7. 組合物，含有權利要求1-4任一所述方法篩選獲得的小分子化合物以及藥學上可接 受的載體或輔料。
8. 如權利要求7所述的組合物，其中的小分子化合物為2D7或1E7。
9. 權利要求5或6的小分子化合物或權利要求7或8的組合物在製備抗腫瘤藥物、或 降解EZH2藥物中的應用。
【文檔編號】G01N33/50GK104374904SQ201410643454
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月7日 優先權日:2014年11月7日
【發明者】黃文林, 陳慧明, 陳帥 申請人:中國科學院微生物研究所