一種魚類Hepcidin表達促進劑及其應用的製作方法

2023-09-24 12:55:40

本發明涉及一種含特異性免疫激活功能結構域並能高效誘導魚類產生Hepcidin的人工合成CpG-ODN製劑及其在魚類先天免疫抗菌中的應用。

(二)

背景技術：

隨著我國水產養殖業的迅猛發展，魚類病害頻發並日趨嚴重，造成巨大經濟損失。同時由於抗生素和殺蟲劑的大量使用，引起了環境汙染、病原耐藥和食品安全等問題，嚴重影響了水產養殖業可持續發展和人們的身體健康。隨著國家出臺了一系列嚴格的食品安全標準，一大批抗生素已被禁止應用於水產動物養殖，水產養殖業正面臨無藥可施的困難局面。因此，亟待研製和開發安全、無公害和環境友好型的新型、高效的魚類抗病技術和抗病製劑。其中免疫防禦技術代表了重要的發展方向。

Hepcidin是一種主要由肝臟表達的生物活性因子，具有抗菌肽和鐵離子轉運調節素的雙重生物學功能。它能通過直接的殺菌作用與間接的降低血清鐵濃度而抑制細菌生長的作用，實現有效的免疫抗病，因此是免疫抗病製劑開發應用中最為受到關注的重要因子之一。當前對於Hepcidin的開發應用主要見諸對其基因的克隆與外源性重組表達，而對於通過調控內源性Hepcidin表達而實現免疫抗病的技術尚不多見。外源性重組表達的Hepcidin製劑雖能有效抑制病原菌的侵染，但存在生產成本高、儲存和使用過程中易於失活、不利於大規模應用等缺點，特別是由於外源性重組表達的Hepcidin製劑不利於應用在較大規模的水產養殖領域。因此，通過開發內源性Hepcidin高效誘導表達技術而實現免疫抗病是一條重要的替代性途徑。

含胞嘧啶鳥嘌呤基序的寡脫氧核糖核酸(CpG-ODN)製劑是一類重要的免疫調節因子。CpG-ODN具有製備成本低、產品穩定、屬於核酸製劑無毒副作用、在環境中易於降解而不富集、安全高效和環境友好等優點，因此是極富應用價值的免疫抗病製劑。但CpG-ODN具有種屬特異性、組織細胞特異性和特定基因調控的特異性。不同物種中產生免疫學效應的CpG-ODN的序列、組成與結構均不盡相同，同一物種中不同細胞和基因活化所需的CpG-ODN的類型也不盡相同。因此，對於不同的物種以及不同的細胞和基因，需要有針對性地開展設計、改造和篩選。CpG-ODN還具有刺激型和抑制型兩種不同的類型，前者具有激活免疫系統的功能，而後者具有抑制免疫系統的功能，這擴大了CpG-ODN製劑的應用範圍，但同時也增加了其開發應用中設計和篩選的難度。CpG-ODN的免疫刺激和抑制功能由多種因素所決定，包括寡核苷酸鏈的長度、核苷酸的組成、CpG核心區兩翼序列的結構以及關鍵核苷酸的修飾狀態等，這些參數需要結合功能評價進行篩選和優化。我們通過對候選CpG-ODN序列的特殊設計，使得篩選出的序列片段具有合適的寡核苷酸鏈長度、CG島數量、硫代磷酸骨架位點和高效特異結合宿主CpG受體Toll-like receptor 9(TLR9)的高級結構，經篩選的CpG-ODN序列具有高效誘導魚類抗菌肽Hepcidin表達的功能。

本發明針對水產動物魚類物種，以刺激肝臟組織中Hepcidin基因表達為目的，系統開展了刺激型CpG-ODN的設計、合成、修飾、篩選與功能評價等研究。利用模式實驗動物斑馬魚研究模型，從預設計合成的19條候選CpG-ODN中，篩選到兩條能高效誘導斑馬魚肝臟表達Hepcidin的CpG-ODN序列。功能研究顯示，這兩條CpG-ODN能在顯著誘導肝臟表達Hepcidin的同時，降低血清中的鐵離子濃度，從而抑制細菌生長。此外，CpG-ODN還抑制細菌表達OmpA膜蛋白，增強補體對細菌的殺傷力。免疫抗病試驗結果表明，本發明所獲得的CpG-ODN能顯著保護實驗魚免受嗜水氣單胞菌的感染，發病死亡率顯著降低。

(三)

技術實現要素：

本發明目的是人工合成魚類種屬和組織特異性CpG-ODN，用於誘導肝臟組織表達Hepcidin。利用斑馬魚實驗模型，通過體內導入CpG-ODN，並結合Hepcidin表達分析、抗體阻斷試驗、鐵離子含量測定、細菌生長抑制測定等功能評價試驗，從預設計的19條含不同結構類型的CpG-ODN序列中，篩選出兩種符合C型結構特徵的CpG-ODN。發現其能特異性提高肝臟中Hepcidin的表達，降低血清中鐵離子濃度，抑制細菌生長，顯著提高實驗魚對嗜水氣單胞菌等病原菌感染的免疫保護力。建立了一種利用誘導內源性Hepcidin高效表達從而實現魚類免疫抗病的新技術。

本發明採用的技術方案是：

本發明提供一種魚類Hepcidin表達促進劑，所述促進劑為下列之一：CpG-ODN-C4：TCGTCGTCGAGCGAGGCAGTCGTT和

CpG-ODN-C5：GTCGTTTCGACGGGTGCAGTCGTT。

本發明還提供一種所述魚類Hepcidin表達促進劑在製備免疫製劑中的應用。

進一步，所述免疫製劑為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染免疫抑制劑。

進一步，所述免疫製劑為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染免疫抑制劑。

本發明採用生物信息學結構模擬技術，設計各種頸環結構特徵的19種CpG-ODN序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將19種CpG-ODN分別逐條注射斑馬魚，用螢光定量RT-PCR技術測定刺激前後肝臟組織中Hepcidin轉錄產物(mRNA)的變化水平，進行劑量依賴性統計分析。利用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)測定刺激前後實驗魚血清鐵離子濃度，利用平板抑菌試驗測定細菌生長能力，然後統計分析肝臟Hepcidin誘導表達、血清鐵離子濃度下降以及細菌生長抑制間的相關性。利用嗜水氣單胞菌敗血症感染模型，通過死亡率和成活率的統計分析，測定CpG-ODN的免疫保護功能。

與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：本發明所述促進劑能高效誘導抗菌肽Hepcidin表達，繼而大大提高魚類針對細菌性感染時的存活率。同時，本發明所提供的促進劑為一類無汙染的短核苷酸序列，能在自然環境中分解。相對於傳統的抗生素、磺胺類抗菌藥，本發明所提供的促進劑製備的抗菌免疫製劑是一種典型的具有高效抗菌功能的環境友好型製劑。

(四)附圖說明

圖1是本發明所設計的各型CpG-ODN以及嗜水氣單胞菌基因組DNA(A.h DNA)對斑馬魚抗菌肽Hepcidin誘導作用的螢光定量RT-PCR檢測結果；

圖2是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5對斑馬魚抗菌肽Hepcidin的刺激作用的螢光定量PCR，ELISA和Western Blot的檢測結果；A為CpG-ODN-C4誘導肝臟組織Hepcidin轉錄水平變化，B為CpG-ODN-C5誘導肝臟組織Hepcidin轉錄水平變化，C為CpG-ODN-C4誘導血清中Hepcidin蛋白濃度變化，D為CpG-ODN-C5誘導血清中Hepcidin蛋白濃度變化，E為CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激後Western Blot檢測血清中Hepcidin表達濃度變化。

圖3是經Hepcidin抗體處理後斑馬魚血清抑菌能力變化的檢測結果；A為CpG-ODN-C4刺激後斑馬魚血清抑菌動力學曲線測定，B為CpG-ODN-C5刺激後斑馬魚血清抑菌動力學曲線測定。

圖4是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射斑馬魚後血清中亞鐵離子濃度變化的檢測結果；A為CpG-ODN-C4刺激後斑馬魚血清鐵離子濃度變化，B為CpG-ODN-C5刺激後斑馬魚血清鐵離子濃度變化。

圖5是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5增強斑馬魚抵抗嗜水氣單胞菌的免疫保護作用；A為CpG-ODN-C4刺激後A.h細菌侵染條件下斑馬魚存活數統計，B為CpG-ODN-C5刺激後A.h細菌侵染條件下斑馬魚存活數統計，C為CpG-ODN-C4刺激後V.a細菌侵染條件下斑馬魚存活數統計，D為CpG-ODN-C5刺激後V.a細菌侵染條件下斑馬魚存活數統計。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：

實施例1、具有潛在激活魚類Hepcidin表達能力的CpG-ODN序列的設計與合成：

本發明所設計的CpG-ODN均為偏酸性無甲基化修飾，部分或全序列硫代修飾的寡核苷酸片段，所設計的各型CpG-ODN的序列見表1(名稱標註為字母加數字，字母代表其CpG-ODN類型，硫代修飾位點字體加粗)。CpG-ODN序列由上海捷瑞生物工程有限公司利用德國PolyGen 96柱DNA/RNA合成工作站代為合成。

表1.本發明所設計的CpG-ODN序列

實施例2、螢光定量RT-PCR檢測各型CpG-ODN對斑馬魚Hepcidin的誘導作用：

實驗魚為實驗室繁育的斑馬魚(體重3-4克)，飼養於標準28℃恆溫飼養設施，實驗前訓化並觀察2周，確認健康後進行實驗。將人工合成的各型CpG-ODN用滅菌PBS稀釋為1.0μM的濃度，分別以腹腔注射的方式注射成體斑馬魚，注射體積為10μL。24h後提取斑馬魚的肝臟組織，另設置以相同體積的PBS注射的斑馬魚肝臟組織作為陰性對照。按照Trizol試劑盒的說明，從斑馬魚肝臟中提取總RNA，利用TaKaRa的3-Full RACE Core Set試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以該cDNA作為模板，用引物Hepcidin F1、R1對抗菌肽Hepcidin的轉錄表達水平進行螢光定量PCR(以下簡稱qPCR)檢測。螢光定量PCR擴增體系組成見表2；PCR引物見表3；qPCR程序為：95℃預變性3分鐘，95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，共40個循環，以β-actin的表達作為內參，qPCR結果用2-ΔΔCt值法處理分析Hepcidin的相對表達差異。結果顯示，在同一濃度刺激的條件下，本發明所設計的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5CpG-ODN對Hepcidin表達的誘導刺激作用最高，與其他實驗組相比較，顯著性上調了Hepcidin表達(圖1)。註：「*」號表示數據間有顯著性差異(P<0.05)。

表2.斑馬魚Hepcidin qPCR擴增體系

表3.斑馬魚Hepcidin qPCR引物

實施例3、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導Hepcidin表達的劑量依賴效應

分別以0.5μg、1.0μg和1.5μg的濃度(將人工合成的CpG-ODN用滅菌PBS稀釋)，將合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5腹腔注射成體斑馬魚，注射量為10μL；另設對照組，即以10μL的無菌生理鹽液(PBS)腹腔注射成體斑馬魚。注射後24小時，分別提取斑馬魚的肝臟組織與血液。肝臟RNA提取以及逆轉錄和螢光定量PCR檢測過程同實施例2內容，相關qPCR體系參見表2，Hepcidin引物序列參見表3。血液於4℃靜置4h後離心取血清，用ELISA法測定血清中Hepcidin蛋白濃度；同時將血清進行Western Blot檢測。

ELISA實驗包被液為：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.94g，雙蒸水定容至1L並調pH值為9.6。封閉液為：1L PBS中加入0.05g BSA以及10μL Tween-20。底物溶液為：配製底物緩衝液Na2HPO4·12H2O 9.2g加檸檬酸2.35g加水定容至500mL並調pH至5.0。取底物緩衝液9.5mL加TMB 0.5mL及40μL 0.75％的H2O2混合後即為底物液(底物液需現配，配製完成15分鐘內使用)。ELISA實驗採用抗原(血清中的Hepcidin)包被的間接法：將各血清組測量蛋白濃度，濃度調為一致後以1比100的稀釋倍數用包被液4℃包被12小時，然後使用本實驗室製備的兔抗Hepcidin多克隆抗體以及購自Promega公司的羊抗兔IgG-HRP進行ELISA實驗，底物液顯色終止後利用酶標儀讀取各實驗孔吸光值OD450和OD630的數值，將每孔OD450的數值減去OD630的數值後即為待測血清中Hepcidin的相對濃度值。Western blot實驗封閉液為：10mL PBS中加入5mg BSA。顯色液為：選用購自美國Millipore公司的Immobilon Western HRP底物化學發光試劑盒(A液與B液等比例混勻使用)。

結果顯示，經CpG-ODN-C4及CpG-ODN-C5注射刺激後的斑馬魚Hepcidin表達量顯著上升，且對兩種CpG-ODN的刺激具有濃度劑量效應(圖2)。註：「*」號表示數據間有顯著性差異(P<0.05)，「**」號表示數據間有極顯著差異(P<0.01)。

實施例4、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所誘導的Hepcidin的抗菌作用

採用抗Hepcidin抗體處理經CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導的血清，測定血清抑菌能力的變化，分析CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所誘導的Hepcidin的抗菌作用。

取兩組成體斑馬魚，其中一組20尾，每尾腹腔注射10μL PBS作為對照；另一組取40尾，每尾腹腔注射1.5μg(PBS稀釋)的本發明所設計的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5作為實驗組，注射量為10μL。24小時後從各組斑馬魚採血，將血液4℃靜置4h後離心取血清。將實驗組血清平分為兩份，一份血清不做任何處理待用；另一份血清等體積混入滴度效價為1:1000的兔抗Hepcidin多克隆抗體，在37℃條件下反應2小時後(使兔抗Hepcidin多克隆抗體與經CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激後的斑馬魚血清進行反應)待用。另將處於對數生長期的嗜水氣單胞菌(A.h)等體積接種於三管LB培養液中(每管含LB液體培養基2mL)，測得接種後各管實時的菌液濃度菌落形成單位值(CFU)一致。將上述三種斑馬魚血清(即對照、未做處理的實驗組血清和兔抗Hepcidin多克隆抗體處理的實驗組血清)分別加入三管培養基中(每管加入血清量為100μL)，在恆溫搖床中以37℃、200rpm的條件下培養。培養後1、3、6、9和12小時分別各取100μL培養液測量菌液濃度CFU值。實驗重複3次。

結果顯示，經CpG-ODN-C4(圖3中A)或CpG-ODN-C5(圖3中B)刺激後斑馬魚血清的抑菌能力得到了顯著提升；但經Hepcidin抗體中和處理後的斑馬魚血清的抑菌能力則受到了抑制。表明斑馬魚血清中的Hepcidin在抑制嗜水氣單胞菌活性的過程中發揮作用。註：「*」號表示數據間有顯著性差異(P<0.05)，「**」號表示數據間有極顯著差異(P<0.01)。

實施例5、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導斑馬魚血清鐵離子含量下降

取兩組成體斑馬魚，每組各10尾。其中一組每條魚腹腔注射10μL、1.5μg本發明所設計的CpG-ODN-C4，另一組每條魚腹腔注射10μL、1.5μg本發明所設計的CpG-ODN-C5；對照組設PBS和空白對照，24h後取血，取血後將血液離心取血清，血清經65％硝酸60℃處理2小時後利用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)測定鐵離子濃度，實驗重複3次。結果顯示，PBS組的鐵含量在22-24ppm左右，而CpG-ODN-C4與CpG-ODN-C5刺激組的鐵含量均在15ppm左右，PBS組和control組間無顯著差異，而CpG刺激組與對照組相比鐵離子濃度均呈現顯著降低(圖4)。註：「*」號表示數據間有顯著性差異(P<0.05)。

實施例6、CpG-ODN-C4與CpG-ODN-C5的免疫保護功能

取八組成體斑馬魚，每組各30尾。實驗組分別腹腔注射CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5(每尾10μL、1.5μg)，對照組腹腔注射相同體積的無菌PBS。12h後將實驗組、對照組的斑馬魚分別腹腔注射10μL/CFU 1.0×106的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,A.h,菌種編號1.927，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))(圖5中A)和10μL/CFU 1.5×106的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,V.a，菌種編號ATCC 17749，來源同A.h細菌)(圖5中B)，對照組均不做任何處理。從24h開始，每隔24h統計斑馬魚的存活率，並計算注射過CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚組在各個時間點(0d～6d)的相對免疫保護率(1-實驗組死亡率/對照組死亡率×100％)，試驗重複3次。結果顯示，相對於未注射CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚，注射了CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚在被A.h細菌感染後死亡率明顯降低，其中CpG-ODN-C5實驗組相對於對照組有近24％的相對免疫保護率；CpG-ODN-C4實驗組相對於對照組也有20％的相對免疫保護率。其免疫保護率有了顯著提高(P<0.05)；而對照組則在實驗過程中沒有發病現象(表4)。註：「*」號表示數據間有顯著性差異(P<0.05)，「**」號表示數據間有極顯著差異(P<0.01)。

表4.兩種CpG-ODN對A.h或細菌感染斑馬魚的免疫保護率

綜上所述，本發明中，經設計合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射成體斑馬魚，可高效激活斑馬魚Hepcidin表達及Hepcidin介導的免疫抗菌應答。這種安全、高效、環境友好型的核酸類免疫抗病製劑將為開發新型魚類抗病藥物以及新型魚類疫苗的研究提供了一個全新的方向。

應當注意的是，以上實驗列舉的僅僅是本發明的若干具體實例，顯然，本發明還有許多變形，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。

SEQUENCE LISTING

浙江大學

一種魚類Hepcidin表達促進劑及其應用

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