一種使用同一份臍帶血的血清來收穫幹細胞的方法

2023-09-24 12:48:00

專利名稱：一種使用同一份臍帶血的血清來收穫幹細胞的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術與組織工程領域，涉及到一種使用同一份臍帶血的血清來收穫幹細胞的方法，特別涉及到一種使用同一份臍帶血的血清來同時獲得臍帶血造血幹細胞與間充質幹細胞的方法。
背景技術：
造血幹細胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)可以廣泛應用於基因治療、腫瘤淨化和骨髓移植等方面(Bellantuono I. The International Journal of Biochemstry & CellBiology, 2004， 36 (4) :607-620)，尤其是造血幹細胞移植已成為癌症患者放化療後造血功能重建的常規方法，但細胞數量有限極大地限制了其在臨床上的應用。解決此問題的有效方法是實施HSCs的體外大規模擴增。儘管造血幹細胞移植能夠顯著地改善癌症患者放化療之後的生命質量，但絕大多數患者不可避免的要承受短期內的嚴重嗜中性粒細胞減少症和血小板減少症的痛苦，因此有必要提出新的治療方案來降低這些併發症的發生。
間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)已被證明在體外具有支持造血發生的功能，同時在N0D/SCID小鼠體內實驗中，也證明了同時移植HSCs和MSCs加速了小鼠造血功能的重建(Kim D H， et al. Journal of Korean Medical Science, 2006， 21 (6) : 1000-1004)。而對於臨床上乳腺癌患者化療後的造血幹細胞移植，聯合移植入自體的MSCs同樣具有促進造血重建的功能，同時降低了伴隨造血幹細胞移植併發症的發病率。另外，MSCs也可作為細胞治療的種子細胞和基因治療的載體細胞。因此，能夠在同一個培養體系內同時培養與收穫HSCs和MSCs兩種幹細胞，具有重要的臨床應用價值。
臍帶血(Umbilical cord blood， UCB)作為HSCs的來源之一，同時含有MSCs。相對於骨髓及外周血，臍血造血幹細胞(CBSC)具有富含更早期的造血幹/祖細胞、免疫原性弱、對異源性抗原產生的抗體少、成熟性T細胞較少、採集和保存容易、無腫瘤細胞汙染、對供者無損傷及副作用、CD34+CD38—與〔034+ CD33—的比例較高、在移植過程中可以減少移植物抗宿主病(GVHD)發生率、來源廣泛等一系列優點，使得與臍帶血有關的造血幹/祖細胞研究成為熱點。然而HSCs和MSCs分別具有懸浮生長和貼壁生長的生物學特性，體外必須同時提供懸浮培養環境與動態貼附表面，才有可能在模擬體內微環境的條件下實現HSCs和MSCs的共培養。微載體與適宜生物反應器相結合是解決此問題的可行方法。變性膠原包被的交聯葡聚糖(cytodex-3)微載體以其良好的表面貼附特性，在貼壁細胞三維動態培養方面倍受關注。
另外，相對於普遍應用的胎牛血清，使用同一份臍帶血中的自體血清可以為細胞提供更好的營養物質，同時，在細胞以後的臨床應用中，也可以避免胎牛血清帶來的免疫反應。
因此，用同一份臍帶血的血清代替胎牛血清、不添加細胞因子及無基質細胞支持，採用微載體與生物反應器相結合的策略，實現臍帶血來源造血幹細胞與間充質幹細胞的共培養。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種同時培養出臍帶血造血幹細胞與間充質幹細胞的方法。
本發明的技術方案包括以下步驟
1、 分離人臍帶血單核細胞臍帶血來自健康產婦足月分娩或足月剖腹產嬰兒，每次臍帶血採集量平均為50 100mL。臍帶血採集後，按體積比l: 1與PBS緩衝鹽溶液混合均勻，用密度為l. 077g. mL—^勺Ficoll細胞分離液以2500rpm， 25分鐘密度梯度離心後獲得單核細胞(Mononuclear cells,麗Cs) ， Ficoll細胞分離液與臍帶血的體積比為l: 1 1:2。分離後的細胞用頂DM基礎培養基離心洗滌兩次(1000rpm，5分鐘)，調整細胞密度備用。
2、 獲得同一份臍帶血血清本專利所使用的人自體血清為與細胞同一來源的臍帶血血清，其獲得方法為臍帶血採集後，按體積比l: 1與PBS緩衝鹽溶液混合均勻，用密度為1.077g.mL—^勺Ficoll細胞分離液以2500rpm、 25分鐘密度梯度離心，收穫單核細胞；然後用滴管吸取第一層血清液，置入無菌離心管中備用。
3、 cytodex-3微載體的預處理將乾燥的cytodex-3微載體置於矽化處理的玻璃瓶中，並用不含Ca^、 Mg^的PBS緩衝鹽溶液在室溫下浸泡4小時(50 100mL—1 cytodex-3微載體)以上，其間要偶爾攪拌一下。用新鮮的不含"2+、 Mg2+的PBS緩衝鹽溶液衝洗兩次後，高壓滅菌(115°C， 15分鐘，l大氣壓)備用。
4、 共培養UCB-HSCs與UCB-MSCs:將新鮮分離得到的UCB-麗Cs以2 X 106cells. mL—^勺密度接種到提前鋪滿cytodex-3微載體的24孔板中，添加20%的臍帶血血清。採用自然沉降的方法將懸浮的UCB-HSCs和粘附在GCSC微載體上的UCB-MSCs分離並收穫。
本發明的效果和益處是(1) 利用人自體血清，不僅能夠支持UCB-HSCs、 UCB-MSCs在三維條件下良好擴增，完全替代胎牛血清的作用，還能避免異體間的免疫排斥反應。
(2) cytodex-3微載體能夠為貼壁生長特性的UCB-MSCs提供黏附表面，使UCB-MSCs在在三維動態環境中實現貼壁懸浮培養成為可能。
(3) 採用自由沉降的方法，將懸浮的UCB-HSCs和黏附在GCSC微載體上的UCB-MSCs兩種幹細胞輕易地分離並收穫。
(4) 利用本發明的方法，在添加臍帶血血清、不添加細胞因子及滋養層細胞支持的條件下，採用微載體培養的策略，在孔板中共培養UCB-HSCs和UCB-MSCs。結果表明，同一份臍帶血來源的血清，可以很好的支持UCB-HSCs和UCB-MSCs的體外擴增，UCB-MSCs在cytodex-3微載體上的貼附生長狀態良好。


圖1是本發明所述的UCB-HSC s與UCB-MSC s共培養的流程圖。圖2是實施例1中密度梯度離心後的分層示意圖。
圖3是實施例2中UCB-MSCs在cytodex-3微載體表面上黏附的光鏡觀察結果。
圖4是實施例3中cytodex-3微載體自然沉降後與細胞懸液的分層示意圖。
具體實施例方式
以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施例。實施例l
本實施例為在同一份臍帶血中同時獲得培養用血清及單個核細胞。
臍帶血來自健康產婦足月分娩或足月剖腹產嬰兒，臍帶血採集量120mL。臍帶血採集後，按體積比l: 1與PBS混合均勻，用密度為1.077g.mL—^勺Ficoll細胞分離液以2500rpm，25分鐘密度梯度離心，Ficoll分離液與臍帶血的體積比例為l:l l:2。離心後，如圖2所示，上層為血清，採集後置入無菌離心管中備用；取中間白膜層獲得單核細胞(Mononuclearcells,麗Cs)，分離後的細胞用頂DM基礎培養基離心洗滌兩次(1000rpm，5分鐘)，調整細胞密度備用。
實施例2
本實施例為UCB-HSCs與UCB-MSCs在靜態條件下的共培養。
將新鮮分離得到的UCB-MNCs以2 X 106cellS. mL—^勺密度接種到提前鋪滿cytodex-3微載體的6孔板中，添加20%的同一份臍帶血來源的血清，在37。C、 5%C02、 20%02及飽和溼度條件下共培養12天。每隔24小時計數，光鏡觀察。
實驗結果同一份臍帶血來源的血清，可以很好的支持UCB-HSCs和UCB-MSCs的體外擴增，由圖2可以看出UCB-MSCs在cytodex-3微載體上的貼附生長狀態良好。
實施例3
本實施例為UCB-HSCs與UCB-MSCs在靜態條件下的共培養後，兩種細胞的分離。培養結束後，用滴管將cytodex-3微載體吹起成懸液，將懸液吸出置於無菌的離心管中
，靜置5分鐘後，cytodex-3微載體沉降在底層，如圖4所示。吸出上層細胞懸液，用5mL頂DM
衝洗cytodex-3微載體，再次靜置，反覆三次。
析出的上層細胞懸液，離心後可獲得UCB-HSCs，將貼附於cytodex-3微載體上的
UCB-MSCs用O. 125%胰酶及0. 02"/。EDTA消化收穫。
權利要求
1.一種使用同一份臍帶血的血清來收穫幹細胞的方法，其特徵在於以下步驟(1)分離人臍帶血單核細胞臍帶血來自健康產婦足月分娩或足月剖腹產嬰兒，每次臍帶血採集量平均為50～100mL；臍帶血採集後，按體積比1∶1與PBS緩衝鹽溶液混合均勻，用密度為1.077g.mL-1的Ficoll細胞分離液以2500rpm、25分鐘密度梯度離心後獲得單核細胞，Ficoll細胞分離液與臍帶血的體積比為1∶1～1∶2；分離後的細胞用IMDM基礎培養基1000rpm、5分鐘離心洗滌兩次，調整細胞密度備用；(2)獲得同一份臍帶血血清臍帶血採集後，按體積比1∶1與PBS緩衝鹽溶液混合均勻，用密度為1.077g.mL-1的Ficoll細胞分離液以2500rpm、25分鐘密度梯度離心後，收穫單核細胞；然後用滴管吸取第一層血清液，置入無菌離心管中備用；(3)cytodex-3微載體的預處理將乾燥的cytodex-3微載體置於矽化處理的玻璃瓶中，並用不含Ca2+、Mg2+離子的PBS緩衝鹽溶液在室溫下浸泡4小時以上，偶爾攪拌；用新的不含Ca2+、Mg2+離子的PBS緩衝鹽溶液衝洗兩次後，高壓滅菌備用；(4)共培養UCB-HSCs與UCB-MSCs將分離得到的UCB-MNCs以2×106cells.mL-1的密度接種到提前鋪滿cytodex-3微載體的24孔板中，添加20％的臍帶血血清；採用自然沉降的方法將懸浮的UCB-HSCs和粘附在GCSC微載體上的UCB-MSCs分離並收穫。
全文摘要
本發明公開了一種使用同一份臍帶血的血清來收穫幹細胞的方法，屬於生物技術與組織工程領域。用同一份臍帶血的血清代替胎牛血清、不添加細胞因子及無基質細胞支持，採用微載體與生物反應器相結合的策略，實現臍帶血來源造血幹細胞與間充質幹細胞的共培養。本發明能夠支持UCB-HSCs、UCB-MSCs在三維條件下良好擴增，完全替代胎牛血清的作用，還能避免異體間的免疫排斥反應；cytodex-3微載體能夠為貼壁生長特性的UCB-MSCs提供黏附表面，使UCB-MSCs在在三維動態環境中實現貼壁懸浮培養成為可能；採用自然沉降的方法，將懸浮的UCB-HSCs和黏附在微載體上的UCB-MSCs兩種幹細胞分離並收穫。
文檔編號C12N5/08GK101525596SQ200910301568
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月15日 優先權日2009年4月15日
發明者水 關, 劉天慶, 崔佔峰, 李香琴, 殷軼群, 丹 葛, 馬學虎, 鮑春雨 申請人:大連理工大學