人糞便中腸道菌群固定液及其製備方法與流程

2023-10-18 14:48:09

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種人糞便中腸道菌群固定液及其製備方法。

背景技術：

基於糞便樣本的人腸道菌群研究，是指通過採集人體糞便樣本，對糞便中的菌群進行研究，其應用主要包括：(1)研究腸道菌群與人體疾病的關係，因為部分疾病受到腸道菌群代謝物影響，比如肥胖、高血壓、糖尿病等；部分疾病發生之前腸道菌群會有變化，從而可在一定程度上進行預測；(2)研究用藥物後腸道菌群的變化，如使用不同抗生素後腸道菌群的變化情況，以及是否某些抗生素作用比較低；或者使用激素類藥物腸道菌群的變化等；可以研究到達腸道的藥物作用情況；(3)研究腸道菌群與兒童營養吸收的關係，因為腸道菌群會幫助食物消化，產生人體需要的物質比如胺基酸，維生素，短鏈脂肪酸等，用來提高食物消化並對人的營養作用。

通過糞便來研究腸道菌群常見的方法有：基於細菌16s擴增子方法和基於細菌全基因metagenome研究方法，其過程主要包括：(1)採集糞便樣本；(2)提取糞便中的微生物dna；(3)對dna進行高通量測序；(4)分析高通量測序獲得的數據獲得腸道菌群情況。其中第(1)步採集糞便樣本，為了保證其中微生物(腸道菌群)各種微生物組成的不變，通常會進行冰凍保存，即將採集好的糞便在儘可能短的時間內放到儘可能-80℃低溫冰箱進行保存。因為脫離了腸道內環境，在常溫中停留時間越久，則腸道菌群越會發生改變，比如某些菌數量會變多，某些菌數量會變少，甚至全部死亡。由於實驗條件和實驗周期等限制，一般情況不可能立即進行第(2)步的dna提取。所以當提取時，糞便中的微生物組成已經與正常腸道環境中不同，研究也就沒有辦法獲得真實結果。因此，需要開發新型的固定人糞便中腸道菌群的方法。

技術實現要素：

針對現有技術中的缺陷，本發明目的在於提供一種人糞便中腸道菌群固定液及其製備方法，以在保證保存品質的基礎上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進行低溫凍存所帶來的不便；製備方法簡單，應用範圍廣。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案為：

第一方面，本發明提供了一種人糞便中腸道菌群固定液，每1000ml固定液中，原料組分包括：400～600mmoltris-hcl、3～7molnacl、50～150mmoledta和/或edta-na2，餘量為水。

在本發明的進一步實施方式中，原料組分還包括：1～3mol乙醇。

在本發明的進一步實施方式中，每1000ml固定液中，原料組分包括：500mmoltris-hcl、100mmoledta和/或edta-na2、5molnacl、2mol乙醇，餘量為水。

在本發明的進一步實施方式中，tris-hcl的ph值為8.0。

在本發明的進一步實施方式中，水為去離子水。

第二方面，本發明提供了上述人糞便中腸道菌群固定液的製備方法，包括如下步驟：將所有的原料組分混合均勻，得到固定液。

第三方面，本發明提供了上述人糞便中腸道菌群固定液的使用方法，包括如下步驟：將採集的糞便加入到固定液中，避光保存。需要說明的是，將採集的糞便加入到固定液中，固定液的加入量，只需要浸沒糞便即可。

在本發明的進一步實施方式中，保存的時間為0～30天。

在本發明的進一步實施方式中，保存的溫度不高於40℃。

第三方面，本發明還保護上述人糞便中腸道菌群固定液在製備人糞便中腸道菌群固定產品中的應用。

本發明提供的技術方案，具有如下的有益效果：

(1)本發明首次採用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2為主要成分配製固定液，雖然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均為常見的緩衝液組分，其組合經常用於dna的提取緩衝液，但是國內外並沒有報導過其組合具有固定腸道菌群的功能；

(2)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，其中的tris-hcl為緩衝液成分，dna在該溶液中會去質子化，提高其溶解性，與edta一同形成的te緩衝液，能有效的保護菌群中的dna降解；edta為金屬螯合劑，能螯合細菌所需的微量金屬元素，如鎂等，使得這類酶不能發揮作用，從而阻斷細菌的正常代謝活動，抑制細菌生長，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制細菌生長；乙醇的主要作用是抑制細菌生長；

(3)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以在保證保存品質(糞便中腸道菌群組成穩定)的基礎上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進行低溫凍存所帶來的不便；

(4)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以直接將糞便加入裝有固定液的保存管中，然後常溫避光保存即可，不需要進行低溫凍存，使用簡單；

(5)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液製備方法簡單，生產成本低，可控制在2～3元/ml，具有極廣的應用價值。

本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

附圖說明

圖1為本發明實施例二中的糞便經不同處理後的腸道菌群的組成柱狀圖；

圖2為本發明實施例二中的糞便經不同處理後的測序分析結果主成分分析聚類圖；a—個體1；b—個體2；c—個體3；

圖3為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物bifidobacterium相對豐度變化圖；

圖4為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物clostridium相對豐度變化圖；

圖5為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物bifidobacterium相對豐度變化圖；

圖6為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物collinsella相對豐度變化圖；

圖7為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物eubacterium相對豐度變化圖；

圖8為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物faecalibacterium相對豐度變化圖；

圖9為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物fusobacterium相對豐度變化圖；

圖10為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物parabacteroides相對豐度變化圖；

圖11為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物ruminococcus相對豐度變化圖；

圖12為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的微生物bacteroides相對豐度變化圖；

圖13為本發明實施例三中的糞便經不同處理後的主要功能基因相對豐度隨時間變化的圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發明的保護範圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，數據為三次重複實驗的平均值或平均值±標準差。

實施例一：人糞便中腸道菌群固定液及製備

本實施例提供一種人糞便中腸道菌群固定液，每1000ml所述固定液中，原料組分包括：500mmoltris-hcl(ph值為8.0)、100mmoledta、5molnacl、2mol乙醇，餘量為去離子水。

製備方法包括：先配製1000mmol/l的tris-hcl溶液(ph值為8.0)，量取500ml的tris-hcl溶液，加入100mmoledta、5molnacl和2mol乙醇，然後加入去離子水至1l，混合均勻，得到固定液。

實施例二：細菌16s擴增子研究腸道菌群組成

1、將同一個體一次排洩的糞便均分成30份採集，然後將採集的糞便分別放入含有等量的本發明實施例一製備得到的人糞便中腸道菌群固定液的30個採集管中，固定液能浸沒糞便(下同)。

將30個樣本在常溫下放置0～9天(第0天表示採集當天)，每天凍存3管作為重複，再放入冰箱冷凍，9天後對所有凍存的糞便進行dna提取、測序和分析(具體操作為本領域常用的操作方法)。

分析後腸道菌群的組成柱狀圖如圖1所示。途中不同顏色表示腸道菌群中不同種類的微生物。橫坐標為天數，小數點後為每天重複的樣(每天重複三次)。縱坐標為微生物的相對豐度。由圖1可知，從第0天到第9天腸道菌群微生物組成的變化小，這種變化主要來源於採集點所致。結果說明本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

2、使用本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液進行糞便固定，同時使用國外產品進行固定，最長常溫放置36天後進行細菌16s擴增子研究腸道菌群組成。由於需要糞便較多，因此選取不同個體進行糞便採集，具體方案及結果如下：

個體1(a)：使用含有等量的本發明實施例一製備得到的人糞便中腸道菌群固定液的採集管36個，分別採集同一個體一次排洩的36份糞便，常溫下放置，從第0天(採集當天)開始每個3天凍存3管，全部凍存完畢後進行測序分析；

個體2(b)：使用含有等量的國外產品的採集管15個，分別採集同一個體一次排洩的15份糞便，常溫下放置，每隔一周凍存3管，一共凍存5周，全部凍存完畢後進行測序分析；

個體3(c)：使用含有等量的國外產品的採集管15個，分別採集同一個體一次排洩的15份糞便，常溫下放置，每隔一周凍存3管，一共凍存5周，全部凍存完畢後進行測序分析。

結果如下：使用主成分方法(通過對測序結果進行分析)對樣本的物種組成進行分析，腸道菌群組成越相似的樣本，聚得越緊密，腸道菌群組成越不相似的樣品，樣品間越疏遠。由圖2可以看出，個體1(a)的30個樣本較個體2(b)和個體3(c)的15個樣本聚得更集中，說明個體1(a)的30個樣本非常相似。結果也說明，本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液較國外產品在固定腸道菌群狀態方面效果更優。

實施例三：細菌全基因metagenome研究

使用本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液進行糞便固定，最長常溫放置36天後進行細菌全基因組metagenome研究(具體操作為本領域常用的操作方法)，觀察腸道菌群中微生物以及功能基因的變化情況，具體方案及結果如下：

將同一個體一次排洩的糞便均分成39份採集，然後將採集的糞便分別放入含有等量的本發明實施例一製備得到的人糞便中腸道菌群固定液的39個採集管中，固定液能浸沒糞便(下同)，常溫下放置。每隔3天取3管進行凍存，一共36天(採集當天也需要凍存3管)，全部凍存完畢後進行細菌全基因metagenome研究。

結果如下：1、圖3-圖12顯示的是含量最高的10種微生物(包括：bifidobacterium、clostridium、bifidobacterium、collinsella、eubacterium、faecalibacterium、fusobacterium、parabacteroides、ruminococcus、bacteroides)，其相對豐度分別在36天中的變化情況。橫坐標是不同樣品，按照天數進行排列(即a01、a02、a03代表第3天凍存樣品，b01、b02、b03代表第6天凍存樣品，依此類推)，縱坐標是該菌的相對豐度。線的平滑度表示對應微生物豐度的變化。可以看出線相對較為平滑，說明腸道菌群中該微生物變化不大。需說明，由於不能百分百的混勻，因此會出現採集點上的偏差，由此也會出現波動，但均在統計學範圍內。結果說明本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

2、圖13是功能基因豐度隨時間變化的圖：橫坐標是不同樣品，按照天數進行排列，縱坐標是該類基因的相對豐度，線越平滑則變化越小。由圖13可以看出，胺基酸代謝(aminoacidmetabolism)相關基因在常溫放置36天情況下變化很小。結果說明本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

本發明提供的技術方案，具有如下的有益效果：(1)本發明首次採用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2為主要成分配製固定液，雖然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均為常見的緩衝液組分，其組合經常用於dna的提取緩衝液，但是國內外並沒有報導過其組合具有固定腸道菌群的功能；(2)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，其中的tris-hcl為緩衝液成分，dna在該溶液中會去質子化，提高其溶解性，與edta一同形成的te緩衝液，能有效的保護菌群中的dna降解；edta為金屬螯合劑，能螯合細菌所需的微量金屬元素，如鎂等，使得這類酶不能發揮作用，從而阻斷細菌的正常代謝活動，抑制細菌生長，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制細菌生長；乙醇的主要作用是抑制細菌生長；(3)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以在保證保存品質(糞便中腸道菌群組成穩定)的基礎上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進行低溫凍存所帶來的不便；(4)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以直接將糞便加入裝有固定液的保存管中，然後常溫避光保存即可，不需要進行低溫凍存，使用簡單；(5)本發明提供的人糞便中腸道菌群固定液製備方法簡單，生產成本低，可控制在2～3元/ml，具有極廣的應用價值。

需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術術語或者科學術語應當為本發明所屬領域技術人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數字表達式和數值並不限制本發明的範圍。在這裡示出和描述的所有示例中，除非另有規定，任何具體值應被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。

最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍，其均應涵蓋在本發明的保護範圍當中。