一種乳粉蛋白質含量分析方法
2023-10-17 17:18:04
專利名稱：一種乳粉蛋白質含量分析方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質檢測技術，尤其是基於自行開發的MPS1.0圖像分析軟體和雙縮脲反應後溶液的顯色相結合而完成的一種乳粉蛋白質含量分析方法。
背景技術：
目前可行的蛋白質測定的方法有多種。既有利用其物理性質，如折射率、比重、紫外線吸收等性質來推知；也有利用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、福林-酚試劑反應、染料結合反應的方法來計算。
通過測定總氮量，再由總氮量折算蛋白質的含量是目前最為基本的和最為常用的檢測方法。其中凱氏定氮法被認為是測定總有機氮的最準確和最簡便的方法之一。該方法可用於所有的動植物食品的分析，具有應用範圍廣、靈敏度高、回收率較好等顯著特點，為國內外普遍應用。我國乳粉標準GB10765-1997《嬰兒配方奶粉I》、GB10766-1997《嬰兒配方乳粉II、III》、GB10767-1997《嬰兒配方粉及嬰幼兒補充粉通用技術條件》中所規定的蛋白質的測定方法要求採用GB/T5413.1-1997《嬰兒配方食品和乳粉蛋白質的測定方法》，所用的方法也是凱氏定氮法。但是這種方法步驟繁瑣、耗時，無法在流通環節方便、有效地應用。
此外，雙縮脲和酚試劑法等也是科學研究中常用的方法。雙縮脲法是一種常見的蛋白質含量的測定方法，其原理為蛋白質的肽鍵在鹼性溶液中與二價銅離子形成藍紫色的絡合物，在一定的範圍內其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比。利用雙縮脲法測定蛋白質的含量，操作快速簡便、需用儀器設備少、對測定的環境要求低，但此類方法多是對樣品進行特定化學反應處理後，通過測定澄清後的樣品溶液的吸光度值來計算蛋白質含量的。樣品溶液的澄清度直接影響到溶液吸光度值的測定，從而影響到蛋白質含量的測定。因此，對於某些樣品(如乳製品)，由於必須經過繁瑣而費時的樣品前處理以保證樣品溶液的高度澄清，而嚴重限制了該類方法的適用範圍。
本申請的乳粉的蛋白質快速檢測方法是在對乳粉中的蛋白質含量進行測定時，毋需經過繁瑣費時的前處理，且具有高度的自動化程度，本申請內容未見他人文章發表。
發明內容
本發明的目的是提供一種乳粉蛋白質含量分析方法，其特徵在於，該方法是根據色度學原理結合雙縮脲試劑與蛋白質形成紫色的絡合物，即不同蛋白質含量的樣品，在鹼性的條件下與雙縮脲試劑形成了深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白質含量高低呈線性相關，用計算機軟體自動分析獲得與通過分光光度計測定吸光度值，然後計算蛋白質含量；本發明的具體步驟如下步驟1配製顯色反應所用的雙縮脲試劑試劑配製顯色反應所用的雙縮脲試劑的具體過程為(1)配製1～10mol/L的鹼性溶液；按m/v濃度配製15～35％的酒石酸鉀鈉溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸餾水中按體積比，鹼性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配製雙縮脲試劑，先分別加入步驟(1)中鹼性溶液、酒石酸鉀鈉溶液和硫酸銅溶液，混合，後添加蒸餾水，使配製成的雙縮脲試劑總量為鹼性溶液體積的100倍定容，其中，酒石酸鉀鈉為穩定劑，用於使雙縮脲試劑性狀穩定；步驟2分別稱取已知蛋白質含量的乳粉的4個標樣和1-4個待測樣；步驟3製備標樣與待測樣品的顯色液各40mg，具體過程為將所稱取的樣品放入錐形瓶中，向錐形瓶中加入1mL四氯化碳，輕搖錐形瓶，使樣品充分的潤溼分散於液體中，加入20mL雙縮脲試劑，避免結塊，靜止3分鐘，使之穩定顯色，移取適量的液體至離心管中離心10min(10000r/min)。
步驟4圖像採集離心後的標樣和試樣各取等量澄清液體至比色池置於掃描儀上，啟動掃描儀採集圖像。
步驟5蛋白質含量的讀取，利用計算機系統讀取圖像採集器採集到的原始圖像信息；點擊「檢測」菜單中的「初始化」，根據提示輸入標樣的標號和標樣的蛋白質含量；用乳粉蛋白質測定軟體利用放入比色池中的四個標樣的色度值和標定的蛋白質的含量，自動繪製標準曲線和採集到的待測樣品的色度值，採用回歸方程計算待測樣品蛋白質的含量。初始參數確定後點擊「結果」，比較後確定檢測樣品的蛋白質含量，並根據需要列印輸出；所述鹼性溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液。
所述配製雙縮脲試劑的常用比例是按鹼性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL。
本發明的有益效果是由於改良了測定中標準曲線的製備，使本發明在測定精度、測定時間、測定成本與操作步驟上得以進一步的優化；利用普通的辦公用計算機與掃描儀代替了實驗室專用的精密儀器一分光光度計，省去了雙縮脲法中人工繪製標準曲線和計算蛋白質含量的步驟，尤其適合乳粉大批量的檢測，自動化程度高，測量精度高，操作快速簡便，需要的儀器設備少，成本低，對測定的環境條件要求低，無汙染。適用於乳粉蛋白質的快速定量測定。較傳統方法具有明顯的優勢。
具體實施例方式
本發明的目的是提供一種乳粉蛋白質含量分析方法，該方法是根據色度學原理結合雙縮脲試劑與蛋白質形成紫色的絡合物，即不同蛋白質含量的樣品，在鹼性的條件下與雙縮脲試劑形成了深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白質含量高低呈線性相關的方法，用計算機軟體自動分析獲得與通過分光光度計測定吸光度值，然後計算蛋白質含量。
以下通過具體的實例對本發明進行詳細的說明。
實施例1(1)分別配製10M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，25％(m/v)的酒石酸鉀溶液和4％(m/v)的無水硫酸銅溶液(2)配製雙縮脲試劑。在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸餾水，再加入上述濃度的10mL氫氧化鉀溶液或氫氧化納溶液和25％的酒石酸鉀鈉溶液20mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30mL，然後添加蒸餾水至1000mL定容，即配製成雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應密封貯存，若有沉澱出現，則應重新配製。
(3)製備標準樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為各稱取4種已知蛋白質含量的乳粉作為標樣，並與待測樣品分別稱取40mg，置於錐形瓶中。向150mL錐形瓶中加入1mL四氯化碳，輕搖錐形瓶，使樣品充分的潤溼分散於液體中，加入20mL雙縮脲試劑，避免結塊，靜止3分鐘，使之穩定顯色，分別取各樣品的顯色液20-30mL液體至離心管中，離心10min(10000rpm)，得到標樣與待測樣品的澄清液。
(4)圖像採集各取離心後的標樣和待測試樣5mL澄清液體至比色池置於掃描儀上，啟動掃描儀採集圖像。
(5)蛋白質含量的讀取利用計算機系統讀取原始圖像的色度信息，點擊「檢測」菜單中的「初始化」，根據提示輸入標樣的標號和蛋白質含量；用乳粉蛋白質測定軟體檢測放入比色池中的四個標樣的色度值和標定的蛋白質的含量，初始參數確定後點擊「結果」，比較後確定檢測樣品的蛋白質含量，並根據需要列印輸出。
實施例2(1)分別配製1M、3M、5M、7M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，15％、20％、30％、35％(m/v)的酒石酸鉀溶液和2％、3％、5％、6％(m/v)的無水硫酸銅溶液(2)配製雙縮脲試劑。在1000mL容量瓶中，先加入400mL蒸餾水，再加入上述濃度的5mL氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液和25％的酒石酸鉀鈉溶液15mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約25mL，然後添加蒸餾水至500mL定容，即配製成雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應密封貯存，若有沉澱出現，則應重新配製。
其餘同實施例1。
最後應該說明的是以上實例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照了上述實例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或者局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
權利要求
1.一種乳粉蛋白質含量分析方法，其特徵在於，該方法是根據色度學原理結合雙縮脲試劑與蛋白質形成紫色的絡合物，即不同蛋白質含量的樣品，在鹼性的條件下與雙縮脲試劑形成了深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白質含量高低呈線性相關，用計算機軟體自動分析獲得與通過分光光度計測定吸光度值，然後計算蛋白質含量；本發明的具體步驟如下步驟1配製顯色反應所用的雙縮脲試劑雙縮脲試劑的具體配製過程為(1)配製1～10mol/L的鹼性溶液；按m/v濃度配製15～35％的酒石酸鉀鈉溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸餾水中按體積比，鹼性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配製雙縮脲試劑，先分別加入步驟(1)中鹼性溶液、酒石酸鉀鈉溶液和硫酸銅溶液，混合，後添加蒸餾水，使配製成的雙縮脲試劑總量為鹼性溶液體積的100倍定容，其中，酒石酸鉀鈉為穩定劑，用於使雙縮脲試劑性狀穩定；步驟2分別稱取已知蛋白質含量的乳粉的4個標樣和1-4個待測樣；步驟3製備標樣與待測樣品的顯色液各40mg，具體過程為將所稱取的樣品放入錐形瓶中，向錐形瓶中加入1mL四氯化碳，輕搖錐形瓶，使樣品充分的潤溼分散於液體中，加入20mL雙縮脲試劑，避免結塊，靜止3分鐘，使之穩定顯色，移取適量的液體至離心管中離心10min(10000r/min)；步驟4圖像採集離心後的標樣和試樣各取等量澄清液體至比色池置於掃描儀上，啟動掃描儀採集圖像；步驟5蛋白質含量的讀取利用計算機系統讀取圖像採集器採集到的原始圖像信息；點擊「檢測」菜單中的「初始化」，根據提示輸入標樣的標號和標樣的蛋白質含量；用乳粉蛋白質測定軟體檢測放入比色池中的四個標樣的色度值和標定的蛋白質的含量，自動繪製標準曲線和採集到的待測樣品的色度值，採用回歸方程計算待測樣品蛋白質的含量；初始參數確定後點擊「結果」，比較後確定檢測樣品的蛋白質含量，並根據需要列印輸出。
2.根據權利要求1所述乳粉蛋白質含量分析方法，其特徵在於，所述鹼性溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液。
3.根據權利要求1所述乳粉蛋白質含量分析方法，其特徵在於，所述配製雙縮脲試劑的常用比例是按鹼性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL。
全文摘要
本發明屬於蛋白質檢測技術的一種乳粉蛋白質含量分析方法。該方法是根據色度學原理結合雙縮脲試劑與蛋白質形成紫色的絡合物，即不同蛋白質含量的樣品，在鹼性的條件下與雙縮脲試劑形成了深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白質含量高低呈線性相關，用計算機軟體自動分析獲得與通過分光光度計測定吸光度值比較，然後計算蛋白質含量。由於改良了測定中標準曲線的製備，使本發明在測定精度、時間、成本與操作步驟上得以進一步的優化；利用普通的辦公用計算機與掃描儀代替了實驗室專用的精密儀器一分光光度計，省去了人工繪製標準曲線的步驟，操作快速簡便，需要的儀器設備少，成本低，對測定的環境條件要求低，無汙染尤其適合乳粉大批量的檢測。
文檔編號G01N33/68GK1776410SQ20051012607
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者侯彩雲, 孫建平, 郭春濤, 王旭, 常國華 申請人:中國農業大學