臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液組合物及其用途的製作方法

2023-10-18 00:09:24 5

本發明涉及一種臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液組合物及其用途，屬於生物醫藥
技術領域：
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背景技術：
：間充質幹細胞(mesenchymalstemcell，mscs)是一類來源於中胚層及外胚層的多能幹細胞，具有自我更新及多向分化潛能。研究證明，間充質幹細胞可分化成為脂肪細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肝臟細胞、神經細胞、神經膠質細胞、皮膚細胞等多種細胞類型，具有很好的損傷修復能力。間充質幹細胞最早發現於骨髓，主要參與骨髓造血幹細胞的定向歸巢及穩態的維持。近年來，國內外研究發現間充質幹細胞除具有多向分化潛能外，還具有很好的免疫調節特性，因此而被用於諸如移植物抗宿主(gvhd)、系統性紅斑狼瘡、關節炎，自身免疫性腸炎等多種炎症性疾病等治療，臨床應用市場巨大。臍帶間充質幹細胞是一類極具應用價值的間充質幹細胞，其來源於產婦廢棄胎盤組織。相比傳統骨髓來源間充質幹細胞，臍帶間充質幹細胞不受個體條件影響，更具有採集方便，來源豐富，以及特性均一等特點。大量研究已嘗試應用臍帶間充質幹細胞治療多種疾病，並取得了理想的療效。將優質低代數間充質幹細胞進行凍存，在必要時進行復甦擴增是間充質幹細胞臨床應用的必經程序。在凍存過程中有效保護間充質幹細胞活性，保障間充質幹細胞復甦時的活率是間充質幹細胞凍存保護液及操作流程在設計時考慮的最終目的。通過凍存復甦後的臍帶間充質幹細胞可作為理想的種子細胞用於衰老及病變引起的組織器官損傷修復。現有技術中使用的間充質幹細胞凍存液多含有胎牛血清，胎牛血清中富含多種細胞營養因子，可用於細胞培養及凍存，能長期保持細胞活力。然而，間充質幹細胞在接觸胎牛血清時會內吞血清物質，當間充質幹細胞回輸人體後可由異源蛋白引起過敏反應，在使得間充質幹細胞移植後成功率降低的同時，導致不良反應的發生，嚴重的可引起過敏性休克。另外，優質胎牛血清多源於進口，價格昂貴的同時，面臨著攜帶狂牛症病毒的風險，因此胎牛血清為或臨床使用批准，只能用於基礎科研。公開號為cn101919378b的中國發明專利申請，公開了一種直接靜脈應用的間充質幹細胞凍存液，相關操作步驟包括:1)將人ab血置於無菌離心管中，在1000～1200rpm條件下離心15分鐘；2)吸取上清液，轉移入新的離心管中，在4000g條件下離心20分鐘，再次取出上清即為凍存用人ab血漿；3)將二甲基亞碸(dmso)、凍存用人ab血漿、勃脈力a注射液按體積比1:3:6混合均勻，即為間充質幹細胞凍存液。由該專利文件的實施例表1可見，經該凍存液i和ii分別凍存細胞1、2、3個月後復甦檢測，凍存液i的細胞活率依次為96％、92.6％和89％，其細胞活率降低率為3.5％/月，凍存液ii細胞活率依次為97.4％，95％和為94.7％，其細胞活率降低率為1.35％/月，該申請公開的凍存液雖然可以直接靜脈輸注，但細胞活率維持時間較短。並且，該間充質幹細胞凍存液中含有人ab血漿，其中大量成分未知，且存在個體差異，無法保證細胞凍存的標準化及穩定性，用於異體輸注存在安全隱患。另外，健康血漿來源少，成本高，難以大規模應用。綜上所述，現有技術中的細胞凍存液難以有效維持間充質幹細胞活率，且不具備臨床使用的條件。技術實現要素：針對上述問題，本發明提供一種符合臨床使用要求，且能有效保證臍帶間充質幹細胞活力的凍存液級凍存方法。本發明是通過以下技術方案實現的：本發明提供了一種臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液組合物，其包括按體積百分數計的如下組分：複方右旋糖酐40注射液：30～80％；20wt％人血清白蛋白：10～50％；dmso：5～20％；其中，所述20wt％人血清白蛋白的溶劑為生理鹽水。作為優選方案，各所述組分的體積百分數分別為：複方右旋糖酐40注射液：65％；20％人血清白蛋白：25％；dmso：10％。一種如前述的臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液組合物在製備臍帶間充質幹細胞懸液中的用途。作為優選方案，包括如下步驟：利用新生兒臍帶血提取充質幹細胞；將所述充質幹細胞用權利要求1所述的凍存保護液組合物進行重懸，得到的細胞懸液。作為優選方案，還包括將所述細胞懸液進行凍存的步驟，具體為：將細胞懸液放入梯度降溫盒中，-80℃冰箱過夜，第2天放入液氮罐長期保存。作為優選方案，所述充質幹細胞的重懸濃度為1×105～1×108個/ml。作為優選方案，所述充質幹細胞的提取方法為：無菌條件下取新鮮新生兒臍帶，並將所述臍帶進行預處理成組織塊；將所述組織塊進行傳代培養後，用胰酶進行消化，離心收集充質幹細胞。作為優選方案，所述臍帶預處理的方法為：將新鮮新生兒臍帶剪成1～2cm臍段，剔除血管，用d-pbs漂洗淨血跡，再剪成0.125cm3組織塊。本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液所含成分都為臨床藥物(複方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或臨床使用級(dmso)。其中複方右旋糖酐40注射液含右旋糖酐，是理想的血漿替代物，可參與提高凍存體系中的膠體滲透壓。同時，右旋糖酐屬於非滲透性抗凍劑，還能降低溶液中低分子溶質(電解質)濃度，減輕鹽損傷；人血清白蛋白屬於非滲透性抗凍劑，可降低凍存保護液中自由水的含量，減少冰晶的形成，同時，由於其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷，大大提高細胞存活率；dmso(二甲基亞碸)作為滲透型細胞保護劑能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液，可以長時間維持間充質幹細胞的活性及生物學活性，不含細胞培養基、胎牛血清、人血漿等不安全成分。所有成分為臨床藥物複方右旋糖酐40注射液，20％人血清白蛋白)或臨床使用級(二甲基亞碸(ups臨床級))，可使凍存復甦的臍帶間充質幹細胞滿足臨床使用要求的同時，保證了臨床標準化間充質幹細胞凍存體系的穩定性。安全有效，製備方法簡單，具有良好的臨床應用前景。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯：圖1臍帶間充質幹細胞凍存前生長形態；圖2本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦時細胞活率；圖3本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液及對照組凍存1年復甦後48h細胞生長形態；圖4凍存前後臍帶間充質幹細胞生長曲線；圖5凍存前臍帶間充質幹細胞成脂分化能力圖；圖6本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後成脂分化能力圖；圖7凍存前臍帶間充質幹細胞成骨分化能力圖；圖8本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後成骨分化能力圖；圖9本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd45檢測結果；圖10本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd31檢測結果；圖11本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面hla-dr檢測結果；圖12本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd34檢測結果；圖13本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd90檢測結果；圖14本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd105檢測結果；圖15本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存1年復甦後48h細胞表面cd73檢測結果。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。本發明中涉及的主要儀器及試劑:1)儀器：離心機eppendorf5810r；co2培養箱thermo8000；流式細胞儀beckmancytoflex；細胞計數countstarbiotech；倒置相差顯微鏡奧林巴斯ckx412)試劑:複方右旋糖酐40注射液(福他樂):購自西安萬隆製藥有限責任公司20％人血清白蛋白：購自baxterag(百特中國)dmso(ups臨床級)購自德國wak-chemielg-dmem基礎培養基+10％胎牛血清購自gibcod-pbs購自gibco0.25％胰酶-0.38g/ledta溶液購自gibco0.04％臺盼藍染色液購自gibco人間充質幹細胞成骨分化試劑盒購自gibco人間充質幹細胞成脂分化試劑盒購自gibco茜素紅(alizarinreds)購自sigma-aldrich油紅o(oilredo)購自sigma-aldrich多聚甲醛購自sigma-aldrich流式染色抗體(fitc標記annexin5，pe標記抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd90、cd73，cd105)以及7-aad染料購自ebioscience。實施例1本實施例涉及一種臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液的製備，具體包括如下步驟：1)如表1所示凍存液配方，取複方右旋糖酐40注射液、20wt％人血清白蛋白，dmso混合，加入密度為5×106/ml臍帶間充質幹細胞成細胞懸液，即可。表1.凍存液配方表對照組：取40mllg-dmem培養基(40％)與50ml胎牛血清(50％))混勻，加入臍帶間充質幹細胞至細胞密度為5×106/ml，再加入10mldmso，即可。對照組的配方是國內作為常用的間充質幹細胞凍存液配方。2)檢測復甦後臍帶間充質幹細胞活率取凍存前細胞檢測細胞活率；將本發明製備的臍帶間充質幹細胞凍存懸液以及對照組細胞，通過程控降溫後保存於液氮罐裡，凍存1年後，迅速在37℃水浴復甦後，檢測細胞活率。檢測方法為臺盼藍經典染色法：(總細胞數一臺盼藍染色細胞)/總細胞數％或annexinv以及7-aad流式染色檢測凋亡細胞。3)結果表2.細胞活率檢測結果組別細胞活率％凍存前97.3對照組93.4191.2295.8393.7492.3由表2可見，本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存臍帶間充質幹細胞一年以後復甦，細胞活率均在91.2％之上，與凍存前相比，細胞活率最多僅下降了6.1％/年，細胞活率降低率最多僅為0.51％/月，下降幅度極低；在本發明優選範圍內，進一步提高細胞活率，降低生產成本，且最優保存液的ph、滲透壓接近人體的ph、滲透壓，更為安全；其中，配方2的細胞活率最高，為95.8％，ph為6.7～6.9，滲透壓為340～380mosmol/l最接近人體ph和滲透壓，故配方安全有效，為最佳配比。證明本發明臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液可以長時間維持細胞活率。在此基礎上，選取最優配比凍存液配方進一步研究。實施例2本實施例涉及一種凍存臍帶間充質幹細胞凍存液的製備方法，包括如下步驟：1)無菌條件下取新鮮新生兒臍帶，將臍帶剪成1～2cm臍段，剔除血管，用d-pbs洗淨血跡，再剪成0.125cm3組織塊。用無菌鑷夾取吸取組織塊均勻散布在10cm培養皿中。37℃，5％co2培養箱孵育30min以使組織塊黏貼在培養皿壁上。向每個培養皿中滴加10ml完全培養基(注意沿皿壁小心滴加，勿使衝動組織塊)。37℃、5％co2繼續培養，5天(d6)後半量換液。再過5天後，夾去組織塊的同時，再次半量換液(此時已有細胞明顯爬出)。之後每3天換一次培養液，繼續培養6～8天，待細胞達到約80～90％後可進行細胞傳達培養或凍存。2)棄去培養皿中上清，d-pbs衝洗兩次，用0.25％胰酶，1min，室溫消化細胞，加入完全培養基終止消化，200g，5min離心收集細胞。3)按體積比例將65％複方右旋糖酐40注射液(福他樂)、25％人血清白蛋白，以及10％dmso混合配置成為凍存液，按1×105～1×108/ml濃度重懸臍帶間充質幹細胞，得細胞懸液。4)本發明臍帶間充質幹細胞凍存保護液凍存獲得的細胞，放入梯度降溫盒中，-80℃冰箱過夜，第2天放入液氮罐長期保存。實施例3本實施例涉及前述的臍帶間充質幹細胞臨床凍存保護液凍存細胞1年後細胞特性檢測按照實施例1中最優配方3配置凍存液並凍存另一批次臍帶間充質幹細胞，凍存1年後，37℃水浴復甦後，進行細胞形態、生長曲線、成脂成骨分化，以及表面標誌物檢測。對照組同實施例11)細胞形態觀察復甦後，將細胞加入10cm培養皿，並加入完全培養基37℃，5％co2培養24h後顯微鏡觀察各組細胞形態。2)細胞生長曲線將凍存前細胞，本發明凍存液凍存細胞注射液和對照組復甦後細胞，分別以2×104個接種在t25培養瓶中，每個組別接種21瓶，分別每天每個組細胞進行三個培養瓶臺盼藍染色後計數，取其平均值，進行生長曲線的繪製。沒有計數的培養瓶每3天更換一次培養基。(見圖4)3)細胞分化能力檢測將凍存前細胞，本發明凍存液凍存細胞注射液和對照組復甦後細胞，分別以2×105個接種於6孔板中，待長至70％融合度時，分別加入成脂、成骨誘導培養基，每4天換液一次，14天後用油紅o進行成脂分化染色，21天後用茜素紅s進行成骨分化染色。4)間充質幹細胞表面標誌物檢測將凍存前細胞，本發明凍存液凍存細胞注射液和對照組復甦後細胞，分別進行pe標記抗cd45、cd31、cd34、hla-dr、cd73、cd105，cd90抗體染色，並進行流式細胞儀檢測。5)檢查結果如圖1-2所示，本發明凍存臍帶間充質幹細胞1年後復甦，細胞形態與凍存前以及對照組細胞的形態沒有明顯變化，均呈梭形，折光度高，分布均一。由圖3，及表2可以見，與凍存前和對照組相比，本發明凍存臍帶間充質幹細胞1年後復甦，增殖能力沒有明顯變化。如圖5～8所示，本發明凍存臍帶間充質幹細胞1年後復甦，其成脂、骨分化能力與凍存前以及對照組細胞的形態沒有明顯變化，均出現大量的脂肪滴和鈣堆積。仍然具有成脂、骨分化能力。如圖9～15所示，本發明凍存臍帶間充質幹細胞1年後復甦48小時後的細胞高表達cd90、cd105、cd73，而不表達cd31、cd34、cd45、hla-dr，符合人間充質幹細胞表面標誌的特徵。實驗結果證明，用本發明凍存液凍存臍帶間充質幹細胞，細胞形態、表型，增殖、分化能力均未受到影響；本發明間充質幹細胞凍存液可以長時間維持細胞活率，臨床應用非常有效方便。以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。當前第1頁12