一種轉化態納米材料致哺乳動物細胞惡性轉化的暴露方法與流程
2023-10-10 16:32:39
本發明涉及納米材料生物安全領域，具體為一種轉化態納米材料致哺乳動物細胞惡性轉化的暴露方法。
背景技術：
納米材料已成為人類廣泛接觸的一種新型環境汙染物，被證實可致DNA損傷和基因突變，但其致/促癌性目前尚無定論。為何納米材料可致突卻未見致癌？可能是由於目前研究思路和研究手段受限。目前對於納米材料的毒性效應及致癌性研究多是針對合成之後未進入環境的「原始態(pristine)」納米材料，而對納米材料在環境因素作用下理化性質及其存在狀態的變化與其毒性及致癌性的關聯往往缺少必要的考慮，也就是說目前所作的納米安全性評估並不全面。近幾年的研究表明即使同一種納米材料也會因環境因素的不同作用而表現出完全不同的理化性質和存在狀態，這使得環境中納米材料的毒理學效應及機制研究存在諸多的不確定性。也就是說，原初狀態的納米材料未顯示致癌性，不能說明被釋放到環境中在各種環境因素影響下可能發生物理化學性質轉變和存在狀態改變的轉化態納米材料依然不具有致癌性。這是當前納米材料生物安全性評價中迫切需要解決的關鍵科學問題之一，也是納米材料致癌性研究需要考慮的重要問題之一。納米材料的理化性質和遺傳毒性均可受到自然環境條件的劇烈影響，從而導致「原始態」的納米材料的毒性不能準確反映環境中轉化態納米材料的真實毒性；因此需設計一種用轉化態納米材料致細胞惡性轉化的有效暴露方法。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種轉化態納米材料致哺乳動物細胞惡性轉化的暴露方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：步驟如下：
步驟一：將正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分別在培養箱中的含胎牛血清的DMEM培養基中培養；
步驟二：分別取至少三皿經過所述步驟一處理的正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分為至少三組，每組中包括一皿正常小鼠胚胎成纖維細胞和一皿含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞，並標記組別；
步驟三：待所述步驟二中的三組細胞生長至對數生長期後，均棄去所述步驟二中的培養液，向所述第一組細胞中加入含胎牛血清的DMEM培養基，向所述第二組細胞中加入含有新鮮液和胎牛血清的DMEM培養基，向所述第三組細胞中加入含有轉化態納米材料懸濁液且含胎牛血清的DMEM培養基；
步驟四：去除所述步驟三中的條件培養基後漂洗每組中的每皿細胞；
步驟五：向經過所述步驟四處理的第一組細胞中加入含胎牛血清的DMEM培養基，向所述第二組細胞中加入含有新鮮液和胎牛血清的DMEM培養基，向所述第三組細胞中加入含有轉化態納米材料懸濁液且含胎牛血清的DMEM培養基；
步驟六：循環所述步驟二到步驟五。
優選的，所述步驟二中的正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞均處於對數生長期，滿度為80％，種植數目均為1×105，所述培養皿大小為60mm，所述每組細胞均經過胰蛋白酶酶解消化。
優選的，所述DMEM培養基中均含有10％體積的胎牛血清，所述步驟三或步驟五中加入的DMEM培養基量均為4ml，所述第二組細胞中加入的DMEM培養基中還含有納米材料濃度為1.5μg/ml的新鮮液，所述第三組細胞中加入的DMEM培 養基中還含有濃度為1.5μg/ml轉化態納米材料懸濁液。
優選的，所述步驟四中的每皿細胞均用1.5ml磷酸鹽緩衝液漂洗細胞3遍。
優選的，所述步驟六連續暴露40代至80代，期間每隔5代凍存部分細胞。
優選的，所述步驟三或者步驟二中的每組細胞在加入培養基後培養24h，所述步驟五中的每組細胞在加入培養基後連續培養3d。
優選的，所述轉化態納米材料的製備步驟如下：
步驟一、將納米材料用超純水懸浮，得到新鮮液；
步驟二、將步驟一中的新鮮液調整pH值為6-9後滅菌得到儲備液，將所述儲備液在25℃下避光保存60d；
步驟三、取經過步驟二處理的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩；
步驟四、將經過步驟三處理的儲備液放入超聲分散儀中超聲分散；
步驟五、將經過步驟四處理的儲備液進行稀釋；
步驟六、將步驟五中的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩，得到轉化態納米材料懸濁液。
優選的，所述步驟一中的新鮮液中納米材料濃度為1mg/mL，所述步驟三和步驟六中的渦旋震蕩的時間均為3min，所述步驟四中超聲分散的時間為20min，所述步驟五中儲備液稀釋後的納米材料濃度為100μg/ml。
優選的，所述步驟二中的儲備液的pH值為6，避光保存天數為60d。
優選的，所述納米材料為粒徑90nm-200nm的納米氧化鋅。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明提供的致哺乳動物細胞惡性轉化的有效暴露方法，可克服利用細菌進行納米材料毒性效應研究的各種缺點和不確定性；針對已確定發生了轉化的轉化態納米材料進行哺乳動物細胞進行長期的低劑量的慢性暴露，獲得並凍存受納米材料慢性刺激20代、40代、60 代甚至80代的穩定的細胞，可避免因急性短時間暴露不適用於研究致癌性這一缺點，對納米材料致癌性的時間效應進行分析和研究。本發明提供的方法簡單，易於操作，成本低，結果可靠，可對各種形式的轉化態納米材料開展致哺乳動物細胞惡性轉化研究，可對慢性暴露不同時間段的細胞進行分析，適合大規模推廣。
附圖說明
圖1為本發明轉化態納米氧化鋅導致正常的小鼠胚胎成纖維細胞克隆形成能力提高的示意圖；
圖2為本發明轉化態納米氧化鋅導致含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞軟瓊脂集落形成能力提高的示意圖。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例1.
本發明提供一種技術方案步驟如下：
步驟一：將正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分別在培養箱中的含胎牛血清的DMEM培養基中培養；
步驟二：分別取三皿經過所述步驟一處理的處於對數生長期，滿度為80％的正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分為三組，每組中包括一皿正常小鼠胚胎成纖維細胞和一皿含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞，並標記組別，每皿種植數目均為1×105，培養皿大小為60mm，每組細胞均 經過胰蛋白酶酶解消化；
步驟三：待步驟二中的三組細胞生長至對數生長期後，均棄去步驟二中的培養液，向第一組細胞中加入4ml含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第二組細胞中加入4ml含有納米材料濃度為1.5μg/ml的新鮮液和10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第三組細胞中加入4ml含有濃度為1.5μg/ml轉化態納米材料懸濁液且含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基；
步驟四：去除步驟三中的條件培養基後用1.5ml磷酸鹽緩衝液漂洗細胞3遍；
步驟五：向經過步驟四處理的第一組細胞中加入4ml含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第二組細胞中加入4ml含有納米材料濃度為1.5μg/ml的新鮮液和10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第三組細胞中加入4ml含有濃度為1.5μg/ml轉化態納米材料懸濁液且含10％體積胎牛血清的DMEM培養基；
步驟六：循環步驟二到步驟五，連續暴露40代至80代，期間每隔5代凍存部分細胞；
其中轉化態納米材料的製備步驟如下：
步驟一、將粒徑為90nm的納米氧化鋅用超純水懸浮，得到納米材料濃度為
1mg/mL的新鮮液；
步驟二、將步驟一中的新鮮液調整pH值為6後滅菌得到儲備液，將儲備液在25℃下避光保存60d；
步驟三、取經過步驟二處理的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩3min；
步驟四、將經過步驟三處理的儲備液放入超聲分散儀中超聲分散20min；
步驟五、將經過步驟四處理的儲備液稀釋至納米材料濃度為100μg/ml；
步驟六、將步驟五中的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩3min，得到轉化態納 米材料懸濁液；
實施例2.
步驟如下：
步驟一：將正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分別在培養箱中的含胎牛血清的DMEM培養基中培養；
步驟二：分別取三皿經過所述步驟一處理的處於對數生長期，滿度為80％的正常小鼠胚胎成纖維細胞和含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞分為三組，每組中包括一皿正常小鼠胚胎成纖維細胞和一皿含激活突變的小鼠胚胎成纖維細胞，並標記組別，每皿種植數目均為1×105，培養皿大小為60mm，每組細胞均經過胰蛋白酶酶解消化；
步驟三：待步驟二中的三組細胞生長至對數生長期後，均棄去步驟二中的培養液，向第一組細胞中加入4ml含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第二組細胞中加入4ml含有納米材料濃度為1.5μg/ml的新鮮液和10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第三組細胞中加入4ml含有濃度為1.5μg/ml轉化態納米材料懸濁液且含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基；
步驟四：去除步驟三中的條件培養基後用1.5ml磷酸鹽緩衝液漂洗細胞3遍；
步驟五：向經過步驟四處理的第一組細胞中加入4ml含10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第二組細胞中加入4ml含有納米材料濃度為1.5μg/ml的新鮮液和10％體積的胎牛血清的DMEM培養基，向第三組細胞中加入4ml含有濃度為1.5μg/ml轉化態納米材料懸濁液且含10％體積胎牛血清的DMEM培養基；
步驟六：循環步驟二到步驟五，連續暴露40代至80代，期間每隔5代凍存部分細胞；
其中轉化態納米材料的製備步驟如下：
步驟一、將粒徑為200nm的納米氧化鋅用超純水懸浮，得到納米材料濃度
為1mg/mL的新鮮液；
步驟二、將步驟一中的新鮮液調整pH值為6後滅菌得到儲備液，將儲備液在25℃下避光保存60d；
步驟三、取經過步驟二處理的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩3min；
步驟四、將經過步驟三處理的儲備液放入超聲分散儀中超聲分散20min；
步驟五、將經過步驟四處理的儲備液稀釋至納米材料濃度為100μg/ml；
步驟六、將步驟五中的儲備液放入震蕩儀中渦旋震蕩3min，得到轉化態納米材料懸濁液；
如圖1-2所示，經1.5μg/ml轉化態納米氧化鋅材料慢性長期暴露細胞克隆形成能力和軟瓊脂集落形成能力都比新鮮的的納米氧化鋅材料強，說明該轉化態納米材料致哺乳動物細胞惡性轉化的暴露方法確實有效，因此該轉化態納米材料致哺乳動物細胞惡性轉化的暴露方法具有簡單，易於操作，成本低，結果可靠等優點，適合大規模推廣。
儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。