黃芩素在製備預防和治療帕金森病藥物中的應用的製作方法

2023-10-10 17:34:19 2

專利名稱：黃芩素在製備預防和治療帕金森病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及黃芩素用於製備預防或治療帕金森病或以帕金森病相關症狀為特徵 的疾病的藥物。還涉及黃芩素與黃酮類化合物及其他物質組合用於製備防治帕金森病的藥 物製劑，屬於製藥領域，
背景技術：
帕金森病(PD)目前已經成為世界上繼阿爾茨海默病之後第二大常見的年齡相關 的神經退行性疾病。全球60歲以上老人的發病率為1%，且隨年齡增長而發病率增加。在 我國，55歲以上老年人中約有170多萬帕金森病患者。目前對PD主要病理特徵的認識為黑 質緻密部多巴胺能神經元進行性缺失和死亡，使黑質-紋狀體通路多巴胺(DA)釋放減少， 造成紋狀體DA含量顯著降低。臨床上以震顫、肌強直、運動徐緩、姿勢步態障礙為特徵。目前對PD的發病機制尚不清楚，臨床上還沒有最終可以逆轉、阻止或減緩PD病人 黑質多巴胺能神經元變性過程的藥物。傳統的PD治療藥物主要有左旋多巴及其複方多巴 製劑、多巴胺受體激動劑、抗膽鹼能藥物、單胺氧化酶抑制劑等。這些藥物通過不同途徑發 揮抑制帕金森病人症狀的作用，能夠明顯改善帕金森病的症狀，但不能延緩疾病的進程，不 能預防多巴胺能神經元的退變，且長期應用有嚴重的毒副作用，甚至導致疾病的惡化。根據 目前藥物應用情況分析可見，無論是改善症狀或是抑制病情發展，預防疾病發生或是治療 帕金森病病的新型藥物都是臨床治療的需求。黃芩素(baicalein)是唇形科(Labiatase)植物黃芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的乾燥根中所含的黃酮類化合物，具有式(I)的結構。 黃芩素具有多種藥理作用，已有文獻報導的藥理作用包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗 變態反應、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤、抗凝、抗血栓形成和保護肝臟、心腦血管和神經 元等作用。在中國專利CN 1556108A (公開號)中記載了中國藥科大學發明的「黃芩素的提取 工藝、藥用組合物及製劑製備工藝」 [1]。其中，涉及了黃芩素及其藥物組合物在治療各種病 毒感染性疾病如肝炎、病毒性感冒、病毒感染引起的急性呼吸道綜合症中的應用。在中國專利CN 1608619A(公開號)中記載了車慶明發明的「黃芩素的藥物組 方」[2]。其中，涉及了黃芩素及其藥學上可接受的鹽類與中、西藥物配合組方，用於製備藥物的新用途，具體包括用於製備解熱鎮痛抗炎藥物；用於製備抗菌、抗病毒藥物；用於製備兼 治解熱鎮痛抗炎和抗菌、抗病毒藥物。在中國專利CN 1606979A(公開號)中記載了車慶明發明的「黃芩素作為解熱、鎮 痛、抗炎、抗菌、抗病毒劑的作用」 [3]。其中，涉及了黃芩素及其藥學上可接受的鹽類用於制 備解熱、鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒的藥物。在中國專利CN 1939295A (公開號)中記載了天津市長徵醫院發明的「黃芩素滴丸 劑及其製備方法」 [4]。其中，涉及了將天然植物黃芩通過常規的提取和分離，採用新的藥用 輔料，研製成黃芩素滴丸，用於治療過敏性皮膚病。在中國專利CN 1559400A(公開號)中記載了杭州市第一人民醫院張喜平發明的 「一種黃芩素液的配製方法」[5]。其中，涉及了一種黃芩素液的配製方法，它在清除氧自由 基，減輕組織缺血再灌注損傷，調節免疫功能，保肝利膽，抗感染，抗腫瘤等方面均有一定的 作用，是多種中藥注射液、口服液、膠囊、飲片、丸散、膏丹的組成成分。在中國專利CN 1528289A (公開號)中記載了西安交通大學李宗芳等發明的「治療 急性胰腺炎的複方大黃素黃芩素注射液及其製備方法」[6]。其中，涉及了一種複方大黃素黃 芩素注射液的製備方法，它在治療急性胰腺炎中的作用。

發明內容
本發明的要解決的技術問題是提供式⑴所示的黃芩素在製藥中的新用途，即黃 芩素在製備預防和治療帕金森病藥物中的應用。 本發明中預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀包括解除疾病症狀和預防、延緩 病情發展或逆轉病理發展過程。本專利發明的黃芩素可以有效緩解帕金森病人的症狀；解除以震顫為主要特徵的 帕金森症狀；發明了黃芩素可以保護神經細胞的病理性變化，有利於抑制帕金森病的發展， 促進帕金森病的逆轉或恢復。所述預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀選自改善帕金森病的震顫症狀和/或 運動功能障礙症狀。改善帕金森病的震顫症狀主要是通過減少震顫的頻率、降低震顫的幅度實現。根據本發明黃芩素還可以製備用於預防、緩解和/或治療帕金森相關疾病的藥 物。所述的帕金森相關疾病是神經細胞損傷、神經退行性疾病和/或神經遞質代謝異 常相關的疾病。
根據本發明黃芩素還可以製備用於預防、緩解和/或治療震顫症狀及其相關疾病 的藥物中的應用。所述的震顫症狀及其相關疾病是以肢體肌電活動頻繁為特徵的。本發明還提供了一種預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀的藥物組合物，含有 預防或治療有效量的黃芩素，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。黃芩素還可以與其他化合物組合用於製備防治帕金森病，特別是與黃酮類天然產 物組合製備的用於治療帕金森病藥物製劑。因此本發明的藥物組合物還可以含有其他黃酮化合物。優選的黃酮化合物選自槲 皮素、蘆丁、木犀草素中至少一種。本發明的藥物組合物，根據施用途徑所述藥物組合物可呈選自如下的劑型溶液、 懸液、乳劑、丸劑、片劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑。本發明發現黃芩素具有如下藥理作用1.黃芩素能預防或治療帕金森病。本發明通過對黃芩素進行了一系列實驗證明其為預防和治療帕金森病的有效藥 物，通過建立6-羥多巴(6-0HDA)損毀大鼠腦功能的PD大鼠模型確定黃芩素對PD動物模 型運動障礙等行為學指標的改善作用，在MPTP誘導的C57BL小鼠帕金森病模型中，證明了 黃芩素可顯著改善MPTP所致的小鼠自發活動下降，縮短MPTP所致的小鼠爬杆時間延長。2.黃芩素能治療帕金森病的震顫症狀。在6-0HDA損毀的大鼠模型中，黃芩素可明顯改善6-0HDA所致大鼠肌肉震顫表現， 降低震顫的頻率和幅度，並證明這種保護作用主要是改善帕金森病動物模型的中樞病理狀 態的結果，與外周神經傳導無直接關係，是黃芩素對帕金森病治療的重要特點之一。3.黃芩素能調節帕金森病動物模型腦內神經遞質。黃芩素可以改變帕金森病模型動物腦內紋狀體等區域的單胺類神經遞質，胺基酸 等活性成分的代謝過程和濃度，可以提高紋狀體多巴胺、高香草酸與5-羥色氨的水平，增 加黑質多巴胺能神經元數目和多巴胺轉運體數目，抑制氧化應激與炎症，從而發揮防治帕 金森病的作用。4.黃芩素能保護神經細胞。本發明涉及黃芩素能濃度依賴性的減輕6-0HDA致SH-SY5Y細胞的活力下降，減輕 6-0HDA致SH-SY5Y細胞的凋亡，提示黃芩素預防和治療帕金森病的作用與其抗凋亡、抗炎 與抗氧化作用有關。本發明還提供了黃芩素作為活性成份和常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。本發明化合物的藥物組合物可根據本領域公知的方法製備，用於此目的時，如果 需要，可將本發明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，製成可作 為人藥或獸藥使用的適當的施用形式或劑量形式。例如黃芩素片劑的製備可以使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例 如稀釋劑與吸收劑，如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸 鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁等；溼潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、澱 粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維 素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖 維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季 銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體 石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣 片，或雙層片和多層片。黃芩素丸劑的製備可以使用本領域公知的各種載體，關於載體的例子是，例如稀 釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石 粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等；崩解劑，如瓊脂 粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。黃芩素膠囊的製備可將黃芩素與上述的各種載體混合，並將由此得到的混合物置 於硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明化合物製成微囊劑，混懸於水性介質 中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或製成注射劑應用。黃芩素注射用製劑的製備，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍乾粉針劑，這種製劑 可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑 劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、乙氧基 化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了製備等滲注射 液，可以向注射用製劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶 劑、緩衝劑、PH調節劑等。這些輔料是本領域常用的此外，如需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或 其它材料。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒 劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混 懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍乾粉針劑等。本發明化合物可以製成普通製劑、也可以是緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑及各種
微粒給藥系統。本發明還提供了通過給與黃芩素或其藥物組合物來預防、緩解和/或治療帕金森 病或症狀的方法。為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給 藥方法給藥。本發明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道 或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、腹膜或直腸等。本發明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注 射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射和穴位注射等。本發明化合物藥物組合物的給藥劑量取決於許多因素，例如所要預防或治療疾病 的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應，給藥途徑、給藥次數、 治療目的，因此本發明的治療劑量可以有大範圍的變化。一般來講，本發明藥學成分的使用 劑量是本領域技術人員公知的。可以根據本發明化合物組合物中最後的製劑中所含有的 實際藥物數量，加以適當的調整，以達到其治療有效量的要求，完成本發明的預防或治療目 的。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發明的化合物或組合物 可單獨服用，或與其他治療藥物合併使用並調整劑量。


圖1.黃芩素對MPTP致帕金森病小鼠紋狀體單胺類遞質的影響#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs MPTP 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 正常對照組.圖2.黃芩素對MPTP致帕金森病小鼠腦黑質TH，DAT, GFAP的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs MPTP 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 正常對照組.圖3.黃芩素對6-0HDA偏側損傷大鼠震顫活動的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 假手術組 圖4.黃芩素對6-0HDA偏側損傷大鼠外周神經傳導速度的影響。#P < 0. 05 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05 vs 假手術組.圖5.黃芩素對6-0HDA偏側損傷大鼠腦黑質TH，GFAP的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 假手術組
圖6.黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細胞損傷存活率的影響#P < 0. 05 vs 6-0HDA, *P < 0. 05 vs 空白組.圖7.細胞核染色法檢測黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細胞調亡的影響(a 空白組；b :6-0HDA組；c 黃芩素低劑量組；d 黃芩素中劑量組；e 黃芩素高 劑量組)圖8.流式細胞儀檢測黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細胞調亡的影響。#P < 0. 05 vs 6-0HDA, *P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 空白組.術語和簡稱MPTP 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶6-0HDA :6_羥基多巴胺
具體實施例方式下述實施例具體顯示本發明的應用。但本實施例不限定本發明的使用範圍。實施例1、黃芩素對MPTP誘導PD小鼠行為學的改善作用模型建立與分組C57BL/6小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、MPTP模型組、黃芩素給藥組 (200mg/kg)，每組12隻。對照組和模型組預先給予灌餵生理鹽水，給藥組給予上述劑量的 藥物，連續灌胃給藥一周後，在第8天模型組和給藥組腹腔注射MPTP (30mg/kg)，每天一次， 連續5天，第13天觀察小鼠的行為學指標檢測。行為學檢測1.自發活動實驗使用小鼠自主活動儀(ZIL-2型小鼠自主活動儀，中國醫學科學 院藥物研究所)測定小鼠自發活動並計數，將小鼠放入自主活動箱中(高13cm，直徑25cm， 每次同時測定4隻小鼠，每個活動箱中1隻)，由記錄儀自動記錄小鼠活動，測定前每隻小鼠 先自由活動3分鐘，然後測定每隻小鼠5min內的活動次數。2.爬杆實驗將一直徑為2. 5cm的軟木小球固定於一根長50cm直徑1cm的木桿頂端，木桿上纏以紗布以防打滑，作為實驗爬杆。實驗期間，每天引導小鼠從杆頂爬到杆底，每 天2次。測試時將被測小鼠置於軟木小球上，記錄小鼠爬到杆底所需要的時間並作統計學 分析，超過60s的以60s計。在給藥前先測定所有小鼠爬杆時間，並在末次腹腔注射MPTP 後lh，再次測定其爬杆時間，每隻小鼠測3次取平均值。以末次爬杆時間減去給藥前爬杆時 間的差值，作為衡量小鼠因MPTP引起肢體協調能力下降程度的指標。MPTP可明顯的降低小鼠的自發活動次數和延長小鼠爬竿時間，而黃芩素可顯著改 善MPTP所致的小鼠自發活動下降，縮短小鼠爬杆時間的延長，這顯示黃芩素能明顯改善PD 模型小鼠的肢體協調能力，並增加小鼠的運動(表1、2)。表1黃芩素對MPTP誘導的PD小鼠自發活動的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P < 0. 05 vs.正常對照組 N = 12. (mean士 S. D)表2黃芩素對MPTP誘導的PD小鼠爬竿時間的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P < 0. 05 vs.正常對照組 N = 12. (mean士 S. D)實施例2、黃芩素對MPTP誘導PD小鼠腦紋狀體內單胺類遞質的影響模型建立與分組同上。每組取6隻小鼠進行取材，斷頭開顱取腦，冰盤上分離兩側 黑質和紋狀體，凍存於液氮。取一側紋狀體進行神經遞質的測定。取紋狀體稱重、記錄，冰 浴中於0. 2ml勻漿液中勻漿40s，80%超聲能量，cycle = 0. 7 A°C 12000rpm離心30min， 取上清液用高效液相電化學的方法檢測多巴胺(DA)及其代謝產物二羥苯乙酸(D0PAC)、高 香草酸(HVA)，5-羥色胺(5-HT)及其代謝產物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的水平，每次進樣 20 ill。流動相0. lmol/1 NaH2P04 水溶液含 0. 85mmol/l 0SA、0. 5mmol/l EDTANa2 禾口 11% 甲醇，用濃磷酸調pH至3. 25，0.45 iim微孔濾膜抽濾脫氣；固定相:Hypersil C185iim填充 不鏽鋼柱。工作電壓+0. 75mV，柱溫35°C，流速0. 8ml/min。與正常對照組相比，小鼠連續腹腔注射MPTP 5天後，紋狀體中的DA及其代謝產物 D0PAC、HVA含量均顯著下降。用黃芩素預處理後，DA和HVA含量均顯著增加，但D0PAC的含 量無明顯變化(圖1A)。MPTP也可導致紋狀體中的5-HT含量顯著的下降，但對5-HI從的 含量沒有顯著的影響。用黃芩素預處理後，紋狀體中5-HT的含量可顯著增加(圖1B)。實施例3、黃芩素對MPTP誘導PD小鼠腦黑質酪氨酸羥化酶(TH)，多巴胺轉運體(DAT)，膠質源性纖維蛋白(GFAP)表達的影響模型建立與分組同上。每組取6隻行免疫組化檢測。用4%水合氯醛麻醉固定， 打開胸腔，分別用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，開顱取腦。置於4%多聚甲醛中後固 定1天，再換入含30%蔗糖的0. 01M PBS中。待腦組織下沉後用冰凍切片機切取20 y m厚 冠狀平面的腦片。腦片用PBST(PH = 7. 4)振蕩漂洗3次，每次lOmin ；再用3%的H202處 理lOmin，PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin ；用封閉液孵育lh ；加入一抗(TH，1 500 ；DAT, 1 200 ；GFAP, 1 400)，4°C孵育過夜。PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin後，分別與生物素 標記的二抗(1 300)室溫孵育lh;PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin後，與卵白素-生物素 複合物(ABC)室溫孵育2h ；再次PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin。DAB顯色，鏡下觀察，適時 用PBS終止反應。免疫組化對照組不加一抗，用PBS代替，其餘步驟同前。貼片，晾乾，乙醇 梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察並攝片。免疫組化切片採用IPP5. 1圖像 分析系統進行圖像分析，所有切片均採用同一放大倍數(X200)。每隻小鼠選取3張切片， 分別累計左側和右側黑質的免疫反應陽性神經元數目並計算其均數。MPTP腹腔連續注射5天後，黑質TH免疫陽性神經元和DAT免疫陽性神經元的數目 顯著下降，預先給予黃芩素可分別使TH陽性神經元數目和DAT陽性神經元數目有一定程度 的增加，說明黃芩素具有一定的神經元保護作用。另外，MPTP可使黑質內GFAP免疫陽性星 形膠質細胞數目顯著增加，而黃芩素可顯著降低GFAP免疫陽性星形膠質細胞的數目，說明 黃芩素可以通過抑制膠質細胞反應性增生來抑制炎症反應(圖2)。實施例4、黃芩素對MPTP誘導PD小鼠腦超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽過氧化 物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量的影響模型建立與分組同上。鼠斷頭開顱，取腦組織標本，以濾紙吸乾表面殘血，去處嗅 球、腦幹、小腦。腦組織標本分別置於玻璃勻漿器，用冰生理鹽水按質量與體積比為1 9 的比例冰浴下製備成10%的腦組織勻漿，立即放入-40°C冰箱保存待測。實驗前以考馬斯 亮藍法測定腦組織蛋白定量。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書要求，用Spectra Max M5酶標儀分別測定腦組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。MPTP腹腔注射5天可導致腦組織中MDA水平顯著升高，GSH-Px水平顯著降低，而 S0D含量未見明顯變化，黃芩素可顯著降低腦組織中MDA水平，增加S0D活性與GSH-Px水平 (表3)，表現出明顯的抗氧化活性。表3黃芩素對MPTP誘導的PD小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P 240r/40min的大鼠作為成功PD模型大鼠。將成功PD模型大鼠隨機分為3組，每組 12隻，分別為模型組，黃芩素組(baicalein，200mg/kg)，陽性藥美多芭組(madopar，50mg/ kg)。另外取假手術組12隻作為對照，每天給予生理鹽水一次，於造模後第三周進行大鼠震 顫活動的測定。震顫活動的檢測將雙記錄電極插在大鼠臀部肌肉上，參考電極接地。使用BL-420E生物信號採集 器對清醒大鼠後肢進行震顫活動測定，評價其震顫頻率和震顫幅度。刺激信號選擇1毫伏 (mv),0. 015毫秒(ms)，掃描速度為0. 01秒(s)，10kHz濾波。分別記錄3個1分鐘內大鼠 震顫的頻率和幅度，取平均值。測試結果顯示，與假手術組相比，6-0HDA損傷組的震顫頻率和震顫幅度具有有顯 著的增加；與模型組相比，黃芩素和美多芭可明顯改善6-0HDA所致帕金森病模型大鼠的震 顫活動，減少震顫頻率，降低震顫幅度(圖3)。實施例6、黃芩素對6-0HDA偏側損傷大鼠外周神經傳導速度的影響模型製備與分組同上。大鼠經戊巴比妥鈉腹腔麻醉，俯臥固定。刺激電極為雙針 電極，插入坐骨神經窩處坐骨神經幹附近，引導電極為雙針電極，插入腓腸肌肌腹，兩電極 相距約2cm。設備採用BL-420E生物信號採集器，刺激信號選擇0. 6毫伏(mv)，0. 02毫秒 (ms)，單刺激，掃描速度為0. 01秒(s)，1kHz濾波，引導信號放大50倍，每分鐘刺激一次，共 刺激六次。計算神經肌肉動作電位潛伏期，傳導速度計算公式為V =刺激電極到引導電極的距離(mm)/潛伏期(ms)。實驗結果顯示，6-0HDA模型組大鼠外周神經傳導速度較假手術組明顯增快，黃芩 素對外周神經傳導速度無明顯的抑制作用(圖4)，這提示黃芩素對6-0HDA損毀大鼠模型的 保護作用與外周神經傳導無直接關係。實施例7、黃芩素對6-0HDA偏側損傷大鼠腦黑質酪氨酸羥化酶(TH)，膠質源性纖 維蛋白(GFAP)表達的影響模型建立與分組同上。每組取6隻行免疫組化檢測。用4%水合氯醛麻醉固定，打 開胸腔，分別用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，開顱取腦。置於4%多聚甲醛中後固定1 天，再換入含30%蔗糖的0. 01M PBS中。待腦組織下沉後用冰凍切片機切取20 iim厚冠狀平 面的腦片。腦片用PBST (PH = 7. 4)振蕩漂洗3次，每次lOmin ；再用3%的H202處理lOmin， PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin ；用封閉液孵育lh ；加入一抗(TH，1 500 ；GFAP, 1 400)， 4°C孵育過夜。PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin後，分別與生物素標記的二抗(1 300)室 溫孵育lh ；PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin後，與卵白素-生物素複合物(ABC)室溫孵育 2h ；再次PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin。DAB顯色，鏡下觀察，適時用PBS終止反應。免疫組化對照組不加一抗，用PBS代替，其餘步驟同前。貼片，晾乾，乙醇梯度脫水，二甲苯透 明，中性樹膠封片，光鏡下觀察並攝片。免疫組化切片採用IPP5. 1圖像分析系統進行圖像 分析，所有切片均採用同一放大倍數(X200)。每隻大鼠選取3張切片，分別累計左側和右 側黑質的免疫反應陽性神經元數目並計算其均數。6-0HDA腦定位注射後，黑質TH免疫陽性神經元數目顯著下降，預先給予黃芩素可使 TH陽性神經元數目有一定程度的增加，說明黃芩素具有一定的神經元保護作用。另外，6-0HDA 可使黑質內GFAP免疫陽性星形膠質細胞數目顯著增加，而黃芩素可顯著降低GFAP免疫陽性星 形膠質細胞的數目，說明黃芩素可以通過抑制膠質細胞反應性增生來抑制炎症反應(圖5)。實施例8、黃芩素對6-0HDA損傷細胞活力的影響細胞的培養與處理SH-SY5Y細胞以完全RMPI1640培養基(含10 %胎牛血清，100U/ml青黴素， 100 u g/ml鏈黴素，1 %穀氨醯胺)，於37°C，5% C02飽和溼度條件下培養。每2_3天換一次 液。取對數生長期的細胞，以完全培養基調整細胞濃度為1X105個/ml，接種至96孔培養 板，每孔200ia，培養24h至亞融合狀態。換用無血清培養基，同時加入黃芩素(終濃度5， 0. 5,0. 05 u g/ml)孵育lh後，再加入6-0HDA(終濃度100 y M)，24h後進行測定。細胞活力的測定加入無血清培養基配製的MTT 200111，終濃度為0.51^/1111，371繼續培養411後， 移走MTT，加入二甲亞碸200iU溶解細胞染色的晶體，在570nm處讀取吸收值。以正常對照 組細胞存活率為100%，計算不同處理組細胞存活率。MTT檢測結果顯示，lOOiiM 6-0HDA作用SH-SY5Y細胞24h可導致細胞活力顯著下 降，而預先給予黃芩素(0.5，5i!g/ml)可顯著提高細胞的存活能力，結果以細胞存活率表 示(圖6)。實施例9、黃芩素對6-0HDA損傷細胞調亡形態學的影響細胞的培養與處理同上。藥物作用結束後，吸盡培養液，用PBS洗一遍。加入 200iU固定液，固定lOmin。棄去固定液，加入含Hoechest 33258 (終濃度10 y g/ml)的 PBS液，置於細胞培養箱中孵育5min，於螢光顯微鏡下觀察，以紫外光激發，同時拍照。Hoechest染色結果顯示，正常培養的對照組細胞的細胞核多數為大小較一致、染 色均勻的圓形核，偶見固縮濃染核；而經6-0HDA處理12h的細胞不僅細胞數減少，且出現凋 亡的細胞核增多，染色質發生固縮，細胞核緻密濃染，形狀不規則，呈顆粒、小塊狀。給予黃 芩素可顯著改善上述凋亡相關的細胞形態學的改變(圖7)。實施例10、黃芩素對6-0HDA損傷細胞調亡率的影響藥物作用結束後收集細胞，以PBS洗兩遍。收集的細胞沉澱加入70%乙醇混勻， 4°C固定過夜，lOOOrpm離心5min，棄去固定液。3mlPBS重懸沉澱5min，用400目鋼絲網過 濾，4°C，1500rpm離心lOmin，棄上清。在沉澱中加入lml PBS，加入PI(終濃度100 u g/ml)。 4°C避光30min，用流式細胞儀檢測10000個細胞，激發波長為488nm，發射波長為630nm，並
計算凋亡百分率。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結果表明，正常情況下細胞凋亡率小於5%，而 100 ii M的6-0HDA作用於SH-SY5Y細胞12h可明顯增加細胞凋亡率，給予0. 5，5 y g/ml的黃 芩素可顯著抑制細胞凋亡(圖8)。
權利要求
如通式(I)所示的黃芩素在製備用於預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀的藥物中的應用F2009100815798C0000011.tif
2.根據權利要求1的應用，其特徵在於，所述預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀選 自改善帕金森病的震顫症狀和/或運動功能障礙症狀。
3.根據權利要求2的應用，其特徵在於，所述的改善帕金森病的震顫症狀是減少震顫 的頻率、降低震顫的幅度。
4.如通式(I)所示的黃芩素在製備用於預防、緩解和/或治療帕金森相關疾病的藥物 中的應用
5.根據權利要求4的應用，其特徵在於，所述的帕金森相關疾病是神經細胞損傷、神經 退行性疾病和/或神經遞質代謝異常相關的疾病。
6.如通式(I)所示的黃芩素在製備用於預防、緩解和/或治療震顫症狀及其相關疾病 的藥物中的應用。
7.根據權利要求6的應用，其特徵在於，所述的震顫症狀及其相關疾病是以肢體肌電 活動頻繁為特徵的。
8.一種預防、緩解和/或治療帕金森病或症狀的藥物組合物，其特徵在於，含有預防或 治療有效量的黃芩素，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。
9.根據權利要求8的藥物組合物，其特徵在於，所述的藥物組合物還含有其他黃酮化 合物。
10.根據權利要求9的藥物組合物，其特徵在於，所述的黃酮化合物選自槲皮素、蘆丁、木犀草素中至少一種。
11.根據權利要求8的藥物組合物，其特徵在於，根據施用途徑所述藥物組合物可呈選 自如下的劑型溶液、懸液、乳劑、丸劑、片劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑。
全文摘要
本發明公開了一種如通式(I)所示黃芩素(化學名5，6，7-三羥基黃酮；英文名Baicalein)在製備預防和治療帕金森病藥物中的應用；本發明涉及黃芩素能夠降低帕金森病震顫的頻率和幅度，改善和治療帕金森病症狀；涉及黃芩素能夠保護多巴胺能神經元免受損傷，可有效地預防和治療帕金森的病理變化和帕金森病的發展；黃芩素通過抗凋亡、抗炎、抗氧化發揮保護多巴胺能神經元的作用和通過對神經系統的作用發揮抑制帕金森症狀的作用。本發明涉及由黃芩素在製備防治帕金森藥物時單獨使用和與其他物質合用製成的各種製劑。
文檔編號A61K31/352GK101856350SQ200910081579
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月13日 優先權日2009年4月13日
發明者何國榮, 呂揚, 李曉秀, 杜冠華, 楊寧, 穆鑫 申請人:中國醫學科學院藥物研究所